CN107384765B - 包含核酸引物-碳材料复合材料的多孔基质及使用所述多孔基质的pcr - Google Patents

Abstract

包含核酸引物‑碳材料复合材料的多孔基质及使用所述多孔基质的PCR。与其中核酸引物存在于基质外表面上的基质或其中核酸引物直接固定在孔内的多孔基质相比，根据本公开内容的多孔基质提供提高的扩增效率，在该多孔基质中，在基质的孔中包含核酸引物‑碳材料复合材料，其中作为聚合物酶链反应(PCR)引物之正向引物和反向引物的一种或更多种核酸引物与碳材料结合。本公开内容的多孔基质可通过改变基质中包含的核酸引物的种类来有效地同时检测多种靶核酸并实时地对其进行分析。因此，该多孔基质可用于扩增多种核酸。

Description

包含核酸引物-碳材料复合材料的多孔基质及使用所述多孔 基质的PCR

技术领域

本公开内容涉及包含核酸引物的多孔基质以及使用所述多孔基质来扩增核酸的方法。

[政府支持的研究和开发的说明]

该研究是在科技部、ICT和未来计划的中级研究员支持项目的支持下由韩国科学技术研究院(Korea Institute of Science and Technology)组织(由韩国国家研究基金会(National Research Foundation of Korea)资助；项目名称：开发用于诊断多种遗传标记的固-液杂合阵列核酸分析的技术(Development of technology for solid-liquidhybrid array nucleic acid analysis for diagnosis of multiple geneticmarkers)；项目号：1711032052)。

背景技术

PCR技术包括终点PCR、实时PCR、数字PCR等。特别地，用于实时地扩增多种核酸的方法(多重实时PCR)由于在一个室中通过一次实验可检测多种生物标志物并且可实时地进行定量分析而广泛地用于疾病的诊断。

然而，对于为扩增多种核酸之最常用方法的利用探针颜色和引物解链点的方法，当存在很多待检测的靶标时由于靶标之间的干扰而难以进行准确检测。因此，难以用于当需要通过快速分析多种不同的核酸来进行疾病的准确诊断时，例如在医护现场技术(point-of-care technology，POCT)中。

[相关技术的参考文献]

[专利文献]

韩国专利登记号No.10-0794699。

韩国专利公开号No.10-2008-0103548。

发明内容

本公开内容涉及提供包含核酸的正向引物和反向引物二者并且具有优异扩增效率的多孔基质以及使用所述基质来扩增核酸的方法，所述方法能够同时实时地准确分析多种核酸。

在一个方面，作为用于提供固定在基质内的核酸引物的新方式，本公开内容提供了用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其在基质的孔内包含核酸引物-碳材料复合材料(nucleic acid primer-carbon material composite)，其中正向引物和反向引物中的一种或更多种核酸引物与碳材料结合。

在另一个方面，本公开内容提供了用于扩增核酸的仪器，所述仪器包含多孔基质和阵列，其表面被图案化(patterned)，以使得以孔的形式布置多孔基质。

在另一个方面，本公开内容提供了用于扩增核酸的方法，其包括：通过将多孔基质注入包含阵列的室中来在阵列(其表面以孔形式图案化)上布置一种或更多种多孔基质，通过向用于扩增核酸之仪器的室中注入溶液来向多孔基质的孔中引入包含一种或更多种靶核酸的溶液，以及通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)来扩增靶核酸。

与其中核酸引物存在于基质外表面上的基质或其中核酸引物直接固定在孔内的多孔基质相比，根据本公开内容的多孔基质提供了提高的扩增效率，在所述多孔基质中，在基质的孔中包含核酸引物-碳材料复合材料，其中作为聚合酶链反应(PCR)引物之正向引物和反向引物中的一种或更多种核酸引物与碳材料结合。

由于碳材料固定在多孔基质内并且因此在扩增核酸期间，核酸引物与碳材料分离且可自由移动，核酸引物-碳材料复合材料提高了与靶核酸的反应性。

因此，本公开内容的多孔基质可通过改变基质中包含的核酸引物的种类而有效地同时检测多种靶核酸并实时地对其进行分析。因此，所述多孔基质可用于实时地扩增多种核酸，并且可用于通过快速地同时分析多种不同的核酸来准确地诊断疾病。

附图说明

图1示意性地示出了包含核酸引物-碳材料复合材料的多孔基质(左)和在核酸扩增期间随温度升高核酸引物从复合材料的分离(右)。在图1中，短且粗的线表示碳纳米管，长线表示PEG聚合物，黑点表示化学交联位点并且白色空隙空间表示孔。

图2示出了使用包含核酸引物-碳材料复合材料的多孔基质的PCR的过程。

图3示出了分析三种多孔基质(#1、#2、#3)中核酸引物-碳材料复合材料的PCR信号均一性的结果。

图4示出了基于靶核酸的浓度的PCR分析结果。

图5比较了根据本公开内容一个示例性实施方案的多孔基质(碳纳米管-引物复合材料)与其中固定正向引物和反向引物且没有复合材料和其中两种引物都不固定(游离引物)且没有复合材料的情况的PCR效率。

具体实施方式

在下文中，对本公开内容进行详细描述。

本公开内容的一个示例性实施方案提供了用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其在基质的孔内包含核酸引物-碳材料复合材料，其中正向引物和反向引物中的一种或更多种核酸引物与碳材料结合。

在一个示例性实施方案中，核酸引物-碳材料复合材料由碳材料中碳之六角结构(hexagonal structure)的一部分和核酸引物中碱基之六角结构的一部分的π-π堆积作用(pi-pi stacking)而形成。特别地，当由碳材料壁上的碳原子形成的六角结构与由核酸引物中碱基形成的六角结构通过π-π堆积作用非共价地反应时，碳材料和核酸引物形成核酸引物-碳材料复合材料。在核酸引物-碳材料复合材料中，由于复合材料中核酸引物和碳材料之间的优异结合，在PCR之前在洗涤多孔基质期间或即使环境发生其他变化，核酸引物可稳定地存在于多孔基质中而不与碳材料分离。在一个示例性实施方案中，在扩增核酸期间，核酸引物可与碳材料分离并与靶核酸反应。例如，在扩增核酸期间当温度升高至约50℃或更高时，核酸引物可与碳材料分离(参见图1)。当在等温条件下进行核酸扩增(等温PCR)时，核酸引物当遇到互补模板时可与碳材料分离。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，由于核酸引物之核酸主链的负电荷的排斥，核酸引物-碳材料复合材料可均匀地分布在多孔基质内。

在一个示例性实施方案中，核酸引物-碳材料复合材料的碳材料可以是但不限于包含呈六角形排列的碳原子的任何物质。例如，可使用石墨、石墨烯、氧化石墨烯、高定向热解石墨(highly oriented pyrolytic graphite，HOPG)、碳纳米管和富勒烯中的一种或更多种。并且，核酸引物可以是例如DNA、RNA、LNA和PNA中的一种或更多种核酸，但不限于此。核酸引物可以是10至100个碱基对(bp)、更特别地20至50个碱基对。然而，核酸引物的具体序列和长度可以但不限于根据靶核酸而不同。在一个示例性实施方案中，当一种或更多种碳材料和一种或更多种核酸引物结合在一种复合材料中时，可形成核酸引物-碳材料复合材料。例如，当一种或更多种碳材料与具有不同碱基序列的两种或更多种核酸引物结合时，可形成复合材料。此外，当两种或更多种碳材料与一种或更多种核酸引物结合时，可形成复合材料。

在一个示例性实施方案中，核酸引物-碳材料复合材料还可包含除核酸引物之外的第三探针以进一步提高选择性。例如，第三探针可以是TaqMan^TM探针。

在一个示例性实施方案中，基于与复合材料结合的引物，多孔基质可包含1μM至1mM浓度的核酸引物-碳材料复合材料。在一个示例性实施方案中，多孔基质可包含0.1至10μg的碳材料和10amol至10pmol的核酸引物。

在一个示例性实施方案中，多孔基质可以是其中核酸引物-碳材料复合材料的碳材料固定在多孔基质的孔内的多孔基质。核酸引物-碳材料复合材料可以是其中碳材料物理地和/或化学地固定在多孔基质的孔内的核酸引物-碳材料复合材料。在一个示例性实施方案中，可将具有较小直径但较长长度的碳纳米管作为核酸引物-碳材料复合材料的碳材料物理地固定在尺寸大于所述直径的多孔基质的孔内。在一个示例性实施方案中，核酸引物-碳材料复合材料的碳材料可使用例如胺基、羧基、丙烯酰基团等的官能团化学地固定在多孔基质的孔内。

由于碳材料固定在多孔基质的孔内，复合材料的核酸引物可在PCR期间从复合材料分离并在多孔基质的孔内自由移动。因此，与其中将正向引物和反向引物二者固定在颗粒内的现有基质相比，根据本公开内容一个示例性实施方案的多孔基质由于将两种引物都固定在基质的孔内而可提供优异的扩增效率，但其表现出提高的反应性和选择性。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，多孔基质中包含的正向引物和反向引物之一可形成核酸引物-碳材料复合材料，使得碳材料固定在基质的孔内，而另一核酸引物可固定在基质的孔内而不形成核酸引物-碳材料复合材料。固定在基质的孔内而不形成核酸引物-碳材料复合材料的核酸引物可通过与基质交联而固定。在一个示例性实施方案中，核酸引物可以是例如DNA、RNA、LNA和PNA中的一种或更多种核酸，但不限于此。核酸引物可以是10至100个碱基对(bp)、更特别地20至50个碱基对。然而，核酸引物的具体序列和长度可以但不限于根据靶核酸而不同。

例如，根据本公开内容一个示例性实施方案的多孔基质的平均颗粒直径可以是10μm至5mm、更特别地100至600μm。多孔基质的形状不受限制，只要其为在其内部可具有孔的三维基质即可。例如，其可具有球形、半球性或盘形状。多孔基质可以但不限于由任何可固化的聚合物(预聚物)制备。特别地，可使用亲水性聚合物，例如聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEG-DA)或聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAM)。此外，在一个示例性实施方案中，基于多孔基质的总体积，多孔基质的孔隙率为10至95体积％、更特别地60至80体积％。超过该范围，基质的孔隙率或稳定性可降低。

此外，在本公开内容的一个示例性实施方案中，多孔基质还可包含提供核酸引物之信息的一种或更多种编码物(encoder)和提供所扩增核酸之定量信息的荧光探针。编码物指基于颜色、形状等来区别多孔基质中的核酸引物的物质。例如，可使用显示不同颜色荧光的染料、量子点或特定形状的金属、塑料、玻璃、硅等。另外，在不使用编码物的情况下，可通过改变多孔基质自身的尺寸或形状或者特别地标记多孔基质的表面来区别多孔基质中的核酸引物。或者，可通过指定在多孔基质的阵列中的位置来区别多孔基质中的核酸引物。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，用于制备多孔基质的方法可包括：通过向包含正向引物和反向引物中一种或更多种引物的溶液中添加碳材料并使引物与碳材料结合来制备引物-碳材料复合材料溶液的步骤，通过将引物-碳材料复合材料溶液与预聚物、光敏引发剂和孔诱导聚合物(pore inducing polymer)(致孔剂)混合来制备预聚物溶液的步骤，通过将预聚物溶液微点样(microspotting)成微滴形式并使其固化来制备基质的步骤，以及通过从基质除去孔诱导聚合物来在基质内形成孔的步骤。

“预聚物”是指为了方便聚合物模塑而在合适阶段停止其聚合或缩聚(polycondensation)的预备聚合物(preliminary polymer)。在本公开内容中，其是指在其固化之前处于可容易模塑之状态的聚合物。

在一个示例性实施方案中，在制备引物-碳材料复合材料溶液的步骤中，可使用包含正向引物和反向引物中一种的溶液来制备引物-碳材料复合材料溶液。并且，预聚物溶液还可包含不包含在引物-碳材料复合材料溶液中的正向引物和反向引物中的另一种引物，并且该引物可固定在基质内而不形成引物-碳材料复合材料。

将预聚物溶液微点样成微滴形式的步骤可通过使用微通道、压电装置、电磁阀、微点样器(microspotter)等来进行。通过该步骤，可制备多种形状和尺寸的基质。

以使用微通道的方法作为一个实例，在制备十字形微通道之后，可使油连续地通过一个通道并可使预聚物溶液间断地通过另一个通道，使得基质形成溶液在通道的交叉处分散在油中。通过控制油和预聚物溶液的流量及其比例可控制通过通道的液滴颗粒的形状和尺寸。

通过根据靶核酸来注入不同的核酸引物，可制备多种包含不同核酸引物的多孔基质。预聚物溶液还可包含提供核酸引物之信息的一种或更多种编码物和提供所扩增核酸之定量信息的荧光探针。

在一个示例性实施方案中，制备预聚物溶液的步骤还可包括通过改变该溶液中所包含孔诱导聚合物的尺寸来控制在多孔基质中形成的孔的尺寸。例如，孔诱导聚合物可以是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或聚丙烯酰胺(PAM)。特别地，可使用PEG 200、PEG300、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 1500、PEG 2000、PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG6000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 12000、PEG 20000、PEG 35000、PEG 40000等(可从SigmaAldrich获得)作为聚乙二醇。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，在使多孔基质维持在固化之前的形状的同时固化多孔基质。固化方法不受限制，只要可维持形状即可。例如，可使用光固化、化学固化或热固化。

在另一个示例性实施方案中，本公开内容提供了用于扩增核酸的仪器，其包含：一种或更多种多孔基质，以及阵列，其表面被图案化，以使得以孔的形式布置多孔基质。

在一个示例性实施方案中，阵列(其表面以孔的形式图案化)可以但不限于由玻璃、塑料、聚合物、硅等制备。在一个示例性实施方案中，用于扩增核酸的仪器可包含用于在一个通道中同时检测多种靶核酸的在不同孔中的多种多孔基质，其包含用于不同靶核酸之核酸引物或者核酸引物和编码物。在一个示例性实施方案中，所述阵列可将多孔基质固定至孔的底部。所述固定可通过使底部具有含有丙烯酸盐/酯基团的表面来实现。

在另一个示例性实施方案中，本公开内容提供了用于扩增核酸的方法，其包括：通过将一种或更多种多孔基质注入包含阵列(其表面以孔的形式图案化)的室中来在该阵列上布置一种或更多种多孔基质的步骤，通过向用于扩增核酸之仪器的室中注入包含一种或更多种靶核酸的溶液来将该溶液引入多孔基质的孔中的步骤，以及通过聚合酶链反应(PCR)来扩增靶核酸的步骤。在一个示例性实施方案中，一种或更多种多孔基质可包含不同的引物。

在一个示例性实施方案中，在扩增靶核酸的步骤中，当核酸引物-碳材料复合材料的核酸引物与碳材料分离时，靶核酸可被扩增。在一个示例性实施方案中，用于扩增核酸的方法还可包括与扩增靶核酸的步骤同时进行的实时地定量分析在一种或更多种多孔基质中聚合的核酸的步骤。这样，可在扩增不同靶核酸的同时对其进行检测和实时定量分析。

在下文，通过实施例对本公开内容进行详细描述。然而，以下实施例仅用于举例说明的目的，并且对本领域普通技术人员显而易见的是，本公开内容的范围不受实施例限制。

[实施例]多孔基质的制备

如下制备根据本公开内容的一个示例性实施方案的多孔基质。

首先，如下制备引物-碳纳米管复合材料溶液：向用于检测沙门菌(Salmonella)的正向引物(Integrated DNA Technologies)的1mM溶液中添加0.1μg碳纳米管并通过声处理和离心来使其分散。然后，通过将PEG 700DA(预聚物，Sigma Aldrich)、PEG 600(孔诱导聚合物，Sigma Aldrich)、作为光敏引发剂的Darocur(Sigma Aldrich)和正向引物-碳纳米管复合材料溶液以20∶40∶5∶35(20μL∶40μL∶5μL∶35μL)的体积比混合来制备预聚物溶液。将预聚物溶液与具有丙烯酸盐/酯基团的反向引物(Integrated DNA Technologies)的溶液以9∶1混合。

正向引物和反向引物的碱基序列如下。

-正向引物：5’-aattatcgcc acgttcgggc aattcgtta-3’(SEQ ID NO 1)。

-反向引物：5’-tcaataatac cggccttcaa atcggcatc-3’(SEQ ID NO 2)。

然后，使用电磁阀微点样器将溶液微点样成25nL微滴，并随后通过辐照UV来固化。通过用纯化水(去离子水(D.I.water))洗涤经固化的颗粒并除去孔诱导聚合物(致孔剂)和未固定在多孔基质内的核酸引物来制备多孔基质。

[测试例1]使用多孔基质的核酸扩增1

使用根据本公开内容一个示例性实施方案的多孔基质来扩增靶核酸。

首先，将在实施例中制备的多孔基质注入PCR机的通道中。然后，在向室中注入PCR溶液之后进行聚合酶链反应(PCR)，所述PCR溶液包含8μL PCR主混合物(Taq聚合酶，dNTPSYBR Green I，Nanobiosys)、7μL蒸馏水(去离子水)和1μL作为靶核酸的沙门菌DNA模板(1×10⁶个拷贝的质粒DNA)。

根据以下温度循环进行PCR。进行总共40个循环，并在每个循环之后通过测量来自所扩增核酸的荧光探针的荧光强度持续5秒来进行定量分析。

-预变性：95℃，8秒。

-变性：95℃，3秒。

-退火和延伸：72℃，6秒。

图2和图3示出了研究多孔基质颗粒的均一性和再现性的结果。具体地，在将如实施例中所述制备的多孔基质添加至三个不同的通道(#1、#2、#3)中并随后添加1×10⁶个拷贝的沙门菌DNA模板之后，比较PCR信号。如从图2可以看出，荧光强度随循环数而提高。从图3可以看出，在相同位置观察到信号。还确认荧光并未因为充分洗涤而从颗粒漏出。

图4示出了在每1μL注入1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴拷贝的沙门菌DNA模板时进行相同实验的结果。可以看出，随着拷贝数降低，PCR信号向左移动。当浓度降低10倍时，曲线间的间距为差不多3.3，这是10倍浓度差的理想间隔。

[测试例2]使用多孔基质的核酸扩增2

为了研究根据本公开内容一个示例性实施方案的多孔基质的PCR效率，制备包含正向引物和反向引物但不含引物-碳材料复合材料的多孔基质(比较例)。具体地，以与实施例中制备多孔基质中相同的方式制备其中正向引物和反向引物二者都固定的多孔基质和其中正向引物和反向引物二者都不固定的多孔基质，不同之处在于不制备引物-碳纳米管复合材料溶液。

然后，以与测试例1中相同的方式进行聚合酶链反应(PCR)。

在每个循环之后通过测量来自所扩增核酸的荧光探针的荧光强度持续5秒进行定量分析。如从图5可以看出，仅对根据本公开内容的包含引物-碳材料复合材料的多孔基质(实施例)观察到荧光。对于其中两种引物固定或未固定且未使用复合材料的多孔基质(比较例)，未观察到荧光。在两个比较例中，其中两种引物固定且未使用碳材料复合材料的一个比较例在早期循环中由于高引物浓度而显示出亮荧光，但是随着PCR的进行，荧光逐渐降低。这意味着，对于两个比较例，PCR未发生或PCR效率不好。

序列表

<110> 韩国科学技术研究院

<120> 包含核酸引物-碳材料复合材料的多孔基质及使用所述多孔基质的PCR

<130> OF16P258CN

<150> KR 10-2016-0054875

<151> 2016-05-03

<160> 2

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

aattatcgcc acgttcgggc aattcgtta 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

tcaataatac cggccttcaa atcggcatc 29

Claims (15)

1.用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其在所述基质的孔内包含核酸引物-碳材料复合材料，其中正向引物和反向引物中的一种或更多种核酸引物与碳材料结合，

其中所述核酸引物-碳材料复合材料设置成响应于扩增条件释放所述核酸引物以在所述基质的孔内自由移动，并且

其中所述核酸引物-碳材料复合材料的碳材料固定在所述基质的孔内。

2.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中所述核酸引物-碳材料复合材料的碳材料均匀地分布在所述基质的孔内。

3.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中所述核酸引物-碳材料复合材料由碳材料中碳之六角结构的一部分和核酸引物中碱基之六角结构的一部分的π-π堆积作用形成。

4.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中在扩增核酸期间，在所述核酸引物-碳材料复合材料中核酸引物与碳材料分离。

5.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中正向引物和反向引物之一形成所述核酸引物-碳材料复合材料，使得所述碳材料固定在所述基质的孔内，而另一核酸引物固定在所述基质的孔内而不形成所述核酸引物-碳材料复合材料。

6.根据权利要求5所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中固定在所述基质的孔内而不形成所述核酸引物-碳材料复合材料的核酸引物通过与所述基质交联而固定。

7.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中所述核酸引物-碳材料复合材料的碳材料包含石墨、石墨烯、氧化石墨烯、高定向热解石墨(HOPG)、碳纳米管和富勒烯中的一种或更多种。

8.根据权利要求1所述的用于扩增核酸的仪器的多孔基质，其中所述核酸引物-碳材料复合材料的核酸引物为DNA、RNA、LNA和PNA中的一种或更多种核酸。

9.用于扩增核酸的仪器，其包含：

一种或更多种根据权利要求1至8中任一项所述的多孔基质；以及

阵列，其表面被图案化，以使得以孔的形式布置所述多孔基质。

10.根据权利要求9所述的用于扩增核酸的仪器，其中所述用于扩增核酸的仪器包含用于不同靶核酸之核酸引物的多种多孔基质。

11.用于扩增核酸的方法，其包括：

通过将一种或更多种根据权利要求1至8中任一项所述的多孔基质注入包含阵列的室中来在所述阵列上布置所述多孔基质，所述阵列的表面以孔的形式图案化；

通过向用于扩增核酸的仪器的室中注入包含一种或更多种靶核酸的溶液来将所述溶液引入所述多孔基质的孔中；以及

通过聚合酶链反应(PCR)来扩增所述靶核酸。

12.根据权利要求11所述的用于扩增核酸的方法，其中所述一种或更多种多孔基质包含不同的核酸引物。

13.根据权利要求11所述的用于扩增核酸的方法，其中，在所述靶核酸的扩增中，当核酸引物-碳材料复合材料的核酸引物与碳材料分离时，所述靶核酸被扩增。

14.根据权利要求11所述的用于扩增核酸的方法，其还包括在扩增所述靶核酸的同时实时地分析在所述一种或更多种多孔基质中聚合的核酸。

15.用于制备根据权利要求1至8中任一项所述的多孔基质的方法，其包括：

通过向包含正向引物和反向引物中一种或更多种引物的溶液中添加碳材料并使所述引物与所述碳材料结合来制备引物-碳材料复合材料溶液；

通过将所述引物-碳材料复合材料溶液与预聚物、光敏引发剂和孔诱导聚合物混合来制备预聚物溶液；

通过将所述预聚物溶液微点样成微滴形式并使其固化来制备基质；以及

通过从所述基质除去所述孔诱导聚合物来在所述基质内形成孔。

Images