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CN107299087B - 用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法 - Google Patents

用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法 Download PDF

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CN107299087B CN201610234746.8A CN201610234746A CN107299087B CN 107299087 B CN107299087 B CN 107299087B CN 201610234746 A CN201610234746 A CN 201610234746A CN 107299087 B CN107299087 B CN 107299087B
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Abstract

本发明公开了一种用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法及其应用。使用传代细胞系接种羊口疮病毒，接种24h后细胞形态发生变化，48h后细胞开始肿胀、膨大，72‑96h细胞出现羊口疮典型病变，细胞病变(CPE)可达85％以上。本发明用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法可以保证病毒的均一、稳定，同时可以防止因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其它病原的风险；此外，利用传代细胞系制备羊口疮疫苗简化了疫苗的生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本、劳动强度，同时还能保证制备得到的羊口疮疫苗质量稳定，因此，对羊口疮疫苗的规模化生产具有重要意义。

Description

用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法
技术领域
本发明属于病毒的制备方法及其应用，特别是涉及用传代细胞系制备羊口疮病毒强毒株的方法。
背景技术
羊口疮，又称为羊传染性脓疱病，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒引起的羊的一种局部性传染性疾病，以唇、鼻等部位皮肤的增生性病变为主，在进行剪毛、交易、潮湿的环境及屠杀等情况下容易发生。羊口疮主要感染羔羊和新生羊，其病变多集中于口部和鼻部周围，其临床症状会经历一个从红斑到囊泡和脓疱的过程，之后形成痂皮，病毒会随着痂皮的脱落进入周围环境。患羊口疮的成年羊因采食困难导致摄入营养不足，严重影响各项生产指标。新生羔羊患羊口疮则难以充分摄入母乳，严重影响羔羊生长发育，甚至饥饿死亡。除山羊和绵羊外，羊驼、驯鹿、海豹、麝牛、松鼠、羚牛、骆驼等一些野生动物也可感染羊口疮。用病毒灭活疫苗进行免疫是防治羊口疮症的一种有效措施。
羊口疮病毒制备方面，1957年，羊口疮病毒在羊胚胎原代细胞上成功复制此病毒，但病变并不是十分明显(Plowright W,Whitcomb M A,Ferris R D.1959.Studies with astrain of contagious pustular dermatitis virus in tissue culture.Arch GesVirusforsch,9:214-231.)。此后，用犊牛睾丸原代细胞、羔羊睾丸原代细胞成功增殖了羊口疮病毒，并观察到了典型的细胞病变反应(Sands J J,Scott A C,Harkness JW.1984.Isolation in cell culture of a poxvirus from red squirrel.Vet Rec,114(5):117-118.Pye D.1990.
Vaccination of sheep with cell culture grown orf virus.Aust vet J,67(5):182-186.Robinson A J,Balassu T T.1981.Contagious pustular dermatitis(Orf).J Vet Bull,51:771-781.)。一些外国学者利用羔羊肾细胞系、鸡胚成纤维细胞成功增殖了羊口疮病毒(Maria T,Mercante,Rosslla,Lelli,Gaetano,Federico,Ronchi.2008.Production and efficacy of an attenuated l ive vaccine againstcontagious ovine ecthyma.J Veterinaria Italiana,44(3):543-547.)。
然而，用原代羊睾丸细胞培养羊口疮病毒的过程中常受到羔羊日龄选择、采集羊睾丸时间、制备羊睾丸原代细胞过程繁琐、原代细胞不宜连续传代、原代细胞可能会带有其他病原体等问题的制约。
发明内容
为了解决现有技术中使用原代细胞存在的问题，本发明目的在于提供一种用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法。
本发明所提供的用传代细胞系(Macr-145、MDBK细胞等)制备羊口疮病毒的方法，是将羊口疮病毒接种至传代细胞系上，产生羊口疮典型病变增殖羊口疮病毒。所述传代细胞系为Marc-145细胞或MDBK细胞(牛肾细胞)。
Marc-145细胞，上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆得到，可连续培养；MDBK细胞(牛肾细胞)，上皮样贴壁细胞，来源于牛肾，可连续传代。
具体的，本发明用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，是将羊口疮病毒接种在传代稳定的传代细胞系上，在37℃培养液中培养，至发生病变的传代细胞病变率达85％及以上(优选85％-95％)时收获病毒液，得到增殖的羊口疮病毒；所述培养液包含MEM培养基、MEM体积的1％新生牛血清、终浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺和终浓度为10mmol/L的HEPES，用7.5％碳酸氢钠溶液调节pH值为7.4±0.2。
所述传代细胞系为Macr-145细胞或MDBK细胞。
其中传代稳定的传代细胞系的获得，是将已有冻存的传代细胞系在细胞培养液中复苏，置37℃恒温箱中培养20h以上(优选24h)后更换细胞培养液，继续培养至48h以上(优选72h)，按照1：3或1:4的比例进行传代，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至细胞培养瓶中培养，稳定传3-5代；所述细胞培养液的配方：培养基为MEM，按MEM的体积添加8-10％新生牛血清，终浓度2mmol/L的L-谷氨酰胺，终浓度为10mmol/L的HEPES；用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.0-7.3。
其中冻存的传代细胞系复苏方法为：从液氮中取出一支的传代细胞系，融化，离心，弃上清液，加入所述细胞培养液作为复苏液，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至培养瓶在37℃恒温箱中培养。
传代细胞发生病变现象为细胞出现空洞、细胞破裂、聚堆、部分脱离瓶壁。
所述病变率数值用活细胞计数得到：
病变率＝(未接种病毒细胞的细胞数-产生病变细胞的活细胞数)/未接种病毒细胞的细胞数×100％。
其中：接种在传代稳定的传代细胞系上的羊口疮病毒是经羊睾丸细胞繁殖获得的细胞毒，具体方法为：采集羊口疮发病羊病料-痂皮毒，经研磨、浸毒、离心后取上清，接种羊睾丸原代细胞，当细胞病变达85％以上时收获病毒液，继续接种至羊睾丸原代细胞，当细胞病变达85％以上收获病毒液，如此连续传代至收获时间稳定、病变稳定的病毒液作为接种用羊口疮病毒。
本发明用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，更具体包括以下步骤：
1)传代细胞系的传代：从液氮中取出1支传代细胞系进行复苏，置37℃恒温箱中培养20h以上(优选24h)后更换细胞培养液，继续培养至48h以上(优选72h)，按照1：3或1:4的比例进行传代，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至细胞培养瓶中培养，稳定传3-5代；
所述细胞培养液的配方：培养基为MEM，按MEM的体积添加8-10％新生牛血清，终浓度2mmol/L的L-谷氨酰胺，终浓度为10mmol/L的HEPES；用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.0-7.3；
2)羊口疮病毒的繁殖：将步骤1)中传代稳定的传代细胞系按种毒含量为1-2％(体积比)的比例接种羊口疮病毒，羊口疮病毒传代细胞系中繁殖的条件为：培养基为MEM，培养基中按MEM的体积添加1％新生牛血清、添加L-谷氨酰胺使终浓度为2mmol/L、添加HEPES使终浓度为10mmol/L，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.4±0.2，培养温度为37℃；
3)羊口疮病毒的收获：当步骤2)中发生病变的传代细胞病变率达85％及以上(85％-95％)时收获病毒液，得到增殖的羊口疮病毒。
所述收获的羊口疮病毒毒液在-20℃条件下冻融2-3次后保存。
用以上所述方法制备获得的羊口疮病毒也属于本发明内容。
本发明提供了一种用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法。使用传代细胞系接种羊口疮病毒，接种24h后细胞形态发生变化，48h后细胞开始肿胀、膨大，72-96h细胞出现羊口疮典型病变，细胞病变(CPE)可达85％以上。
本发明用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法可以保证病毒的均一、稳定，同时可以防止因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其它病原的风险；此外，利用传代细胞系制备的羊口疮疫苗简化了疫苗的生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本、劳动强度，同时还能保证制备得到的羊口疮疫苗质量稳定，因此，对羊口疮疫苗的规模化生产具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为接种羊口疮病毒前Marc-145传代细胞的生长状况；
图2为接种羊口疮病毒前羊睾丸原代细胞的生长状况；
图3为用Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒后48h时的生长状况；
图4为用羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒后48h时的生长状况；
图5为用Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒后91h时的生长状况(即收获时)；
图6为用羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒后91h时的生长状况(即收获时)；
图7为收获羊口疮病毒时Marc-145传代细胞对照(91h)；
图8为收获羊口疮病毒时羊睾丸原代细胞对照(91h)。
具体实施方式
本发明旨在提供一种用传代细胞系(Macr-145、MDBK细胞等)制备羊口疮病毒的方法。设计思路为：将羊口疮病毒接种至传代细胞系上，产生羊口疮典型病变，增殖后收获羊口疮病毒。
经发明人深入分析与实验，确定可用于本发明的传代细胞系为Marc-145细胞或MDBK细胞(牛肾细胞)。其中：Marc-145细胞属上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA104细胞)克隆得到，可连续培养；MDBK细胞(牛肾细胞)属上皮样贴壁细胞，来源于牛肾，可连续传代。
以下以实施例详细说明本发明。
本发明中百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例1、用传代细胞系Marc-145制备羊口疮病毒
用Marc-145传代细胞培养羊口疮病毒，包括以下过程：
1)Marc-145传代细胞的传代：从液氮中取出1支Marc-145传代细胞(购于中国兽医药品监察所)进行复苏,复苏的具体方法为：从液氮中取出一支冻存的Marc-145传代细胞，融化，离心，弃上清液，加入细胞营养液；
细胞营养液配方：培养基为MEM(购自GIBCO)，培养基中按MEM的体积添加8-10％新生牛血清(购自金源康)，添加谷氨酰胺使其终浓度为2mmol/L、添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)使其终浓度为10mmol/L，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.0-7.3。
用细胞营养液调节接种密度至1-1.5×105个细胞/mL，转至T75细胞培养瓶中，置37℃恒温箱中培养20h以上(优选24h)后更换细胞培养液；
继续培养至48-72h(优选72h)，此时细胞已长满单层，当细胞浓度为3-5×105个细胞/mL按照1：3的比例进行传代，用细胞培养液调节接种密度至1-1.5×105个细胞/mL，转至细胞培养瓶中培养，稳定传3-5代后的传代细胞液可用于病毒的接种。
2)羊口疮病毒的繁殖：用Marc-145传代细胞培养羊口疮病毒强毒株，接种前Marc-145传代细胞的生长状况如图1所示。
具体方法为：将步骤1)中传代稳定、长满单层的Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒(外购或来源于经羊睾丸细胞繁殖获得的细胞毒，繁殖方法见下面)，按种毒含量为1～2％(体积比)的比例接种羊口疮病毒在长满单层的Marc-145传代细胞中。羊口疮病毒在Marc-145传代细胞中繁殖的条件为：培养基为MEM(GIBCO)，培养基中按MEM的体积添加1％新生牛血清(金源康)、添加谷氨酰胺使终浓度为2mmol/L、添加HEPES使终浓度为10mmol/L，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.4±0.2，培养温度为37℃。
本实施例提供步骤2)用羊睾丸细胞繁殖获得羊口疮病毒的过程。繁殖方法为：采集羊口疮发病羊(青岛)病料-痂皮毒，经研磨、浸毒、离心后取上清，接种羊睾丸原代细胞(采集3-5月龄羔羊的羊睾丸制备而成)，当细胞病变达85％以上时收获病毒液，继续接种至羊睾丸原代细胞，当细胞病变达85％以上收获病毒液，如此方法,继续传代至收获时间稳定、病变稳定时的病毒液作为羊口疮病毒液。
用Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒48h的生长状况如图3所示，由图3可以看出细胞膨大、拉网、分离、部分聚堆；用Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒91h的生长状况如图5所示，由图5可以看出细胞出现空洞、聚堆、细胞圆缩、破裂、部分脱离瓶壁。
3)羊口疮病毒的收获：当步骤2)中Marc-145传代细胞病变率达85％及以上(85％～95％)时收获病毒液。细胞病变现象为细胞出现空洞、细胞破裂、聚堆、部分脱离瓶壁，病变率的数值通过活细胞计数实现。
细胞病变率：将产生病变的细胞(在T25细胞瓶中培养的细胞)进行消化，用细胞计数法计算出活细胞数，记作1；将细胞对照即未接种病毒的细胞(在T25细胞瓶中培养的细胞)进行消化，用细胞计数法算出后细胞数，记作2；细胞病变率的计算公式为[(2-1)/2×100％]，表述为：
病变率＝(未接种病毒细胞的细胞数-产生病变细胞的活细胞数)/未接种病毒细胞的细胞数×100％。
未接种羊口疮病毒91h时Marc-145传代细胞对照(细胞对照就是一个平行参照物，与接种病毒后的细胞的区别就是细胞对照中不接种病毒)如图7所示，由图7可以看出细胞轮廓清晰，无病灶，虽偶有老化圆缩细胞，但并未破碎。比较用Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒(图5)和未接种羊口疮病毒(图7)后Marc-145传代细胞状态(图7是当Marc-145细胞长满单层后未接种羊口疮病毒继续培养91h后的细胞状态，而图5是当Marc-145细胞长满单层后接种了羊口疮病毒继续培养91h后的细胞状态)，图7显示细胞没有产生病变的状态，而图5显示细胞产生病变的状态，两种细胞形态不同，表明Marc-145传代细胞接种羊口疮病毒后已发生病变。
收获的羊口疮病毒毒液可在-20℃条件下冻融(冻融的目的：破碎含毒细胞，将病毒释放到培养液中)2-3次后保存，备用。
TCID50的测定：用羊睾丸原代细胞、Marc-145传代细胞分别测定实施例1制备的同一份羊口疮病毒样品的TCID50。测定TCID50的具体方法为：将病毒样品按体积比做10倍比例稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，每个稀释度做4个重复孔，每孔加入100微升稀释后的毒液于96孔细胞培养板中，再在每孔加入100微升羊睾丸原代细胞(调节接种密度至2×105个细胞/mL)或Marc-145传代细胞(调节接种密度至1.5×105个细胞/mL)，置37℃、5％CO2培养箱中培养5-7天，观察96孔细胞培养板中细胞病变情况，利用Karber法计算TCID50含量。测得该样品的毒价结果分别为
10-6.0TCID50/mL(羊睾丸原代细胞)、10-6.5TCID50/mL(Marc-145传代细胞)，测定结果表明：用这两种细胞分别测定同一份羊口疮病毒样品的毒价，测定结果之间没有差异。
对照例：用羊睾丸原代细胞制备羊口疮病毒(对照)
用羊睾丸原代细胞培养羊口疮病毒进行对照。进行以下操作：
1)羊睾丸原代细胞的传代：选择3-5月龄绵羊采集羊睾丸，制备羊睾丸原代细胞，调节接种密度至1×106个细胞/mL，转至细胞培养瓶中，置37℃恒温箱中培养，72h(72-96h均可)后，按照1:2(这个细胞生长比较慢，所以一般以1:2的比例进行传代)的比例进行传代，稳定传代3-7代后可用于病毒的接种。
2)羊口疮病毒的繁殖：用羊睾丸原代细胞培养羊口疮病毒强毒株，接种前羊睾丸原代细胞的生长状况如图2所示。
具体方法为：将步骤1)中传代稳定、长满单层的羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒(与本例一使用相同的羊口疮病毒液)，按种毒含量为1-2％(体积比)的比例接种羊口疮病毒在长满单层的羊睾丸原代细胞中，羊口疮病毒在羊睾丸原代细胞中繁殖的条件为：培养基为MEM(GIBCO)，培养基中按MEM的体积添加1％新生牛血清(金源康)、添加L-谷氨酰胺使终浓度为2mmol/L、添加HEPES使终浓度为10mmol/L，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.4±0.2，培养温度为37℃。
用羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒48h的生长状况如图4所示，由图4可以看出细胞膨大、拉网、分离、部分聚堆，和图3进行比较，可以看出细胞变形趋势基本一致；用羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒91h的生长状况如图6所示，由图6可以看出细胞出现空洞、细胞圆缩、破裂、聚堆、部分脱离瓶壁，和图5进行比较，可以看出变形细胞形态相似，基本一致。
3)羊口疮病毒的收获：当步骤2)中羊睾丸原代细胞病变达85％以上时收获病毒液，细胞病变现象为细胞出现空洞、细胞圆缩、破裂、聚堆、部分脱离瓶壁。未接种羊口疮病毒的羊睾丸原代细胞对照如图8所示(91h)，由图8可以看出细胞轮廓清晰、呈长梭形，无病灶，虽偶有老化圆缩细胞，但并未破碎。比较用羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒(图6)和未接种羊口疮病毒(图8)后羊睾丸原代细胞状态，表明羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒后已发生病变。收获的羊口疮病毒毒液可在-20℃条件下冻融2-3次后保存，备用。冻融的目的：破碎含毒细胞，将病毒释放到培养液中。
TCID50的测定：用羊睾丸原代细胞、Marc-145传代细胞分别测定对照例制备的同一份羊口疮病毒样品的TCID50。测定TCID50的具体方法为：将病毒样品按体积比做10倍比例稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，每个稀释度做4个重复孔，每孔加入100微升稀释后的毒液于96孔细胞培养板中，再在每孔加入100微升羊睾丸原代细胞(调节接种密度至2×105个细胞/mL)或Marc-145传代细胞(调节接种密度至1.5×105个细胞/mL)，置37℃、5％CO2培养箱中培养5-7天，观察96孔细胞培养板中细胞病变情况，利用Karber法计算TCID50含量。测得该样品的毒价结果分别为10-6.25TCID50/mL(羊睾丸原代细胞)、10-6.5TCID50/mL(Marc-145传代细胞)，测定结果表明：用这两种细胞分别测定同一份羊口疮病毒样品的毒价，测定结果之间没有差异。
将上述实施例1和对照例的实验过程及测毒结果进行对比，使用Marc-145传代细胞和羊睾丸原代细胞接种羊口疮病毒，接种24h后细胞形态发生变化，48h后细胞开始肿胀、膨大，72-96h细胞出现羊口疮典型病变，细胞病变(CPE)可达85％以上；表明这两种细胞接种羊口疮病毒后，培养一定时间后细胞均能产生羊口疮的典型病变；使用Marc-145传代细胞和羊睾丸原代细胞分别测定同一份羊口疮病毒样品的毒价—TCID50，测定结果没有差异。
实施例2、用传代细胞系MDBK制备羊口疮病毒
方法与实施例1相同。其中所用MDBK传代细胞来源于中国兽医药品监察所。
TCID50含量的测定结果为：用羊睾丸原代细胞、MDBK传代细胞分别测定实施例2制备得到的同一个羊口疮病毒样品，测得该样品的毒价结果分别为10-6.5TCID50/mL(羊睾丸原代细胞)、10-6.25TCID50/mL(MDBK传代细胞)，测定结果表明：用这两种细胞分别测定同一个羊口疮病毒样品的毒价，两种细胞测定结果之间没有差异。
使用MDBK传代细胞接种羊口疮病毒，接种24h后细胞形态发生变化，48h后细胞开始肿胀、膨大，72-96h细胞出现羊口疮典型病变，细胞病变(CPE)可达85％以上，表明MDBK传代细胞接种羊口疮病毒后，培养一定时间细胞均能产生羊口疮的典型病变，能收获一定毒力的羊口疮病毒毒液。
以上实施例显示使用Marc-145传代细胞或MDBK传代细胞接种羊口疮病毒与使用羊睾丸原代细胞同样能制备得到羊口疮病毒。本发明的特点是使用传代细胞，因传代细胞本身具有每个细胞特征均一、稳定、纯净的特征，所以接种病毒后可以使各批次收获的病毒液均一、稳定，进而保证了生产出的疫苗质量安全、稳定、均一、有效。
另外，与原代细胞相比较而言，传代细胞还具有传代过程简单、耗时短、传代分种比例高(一般可按1:3-1:5进行分种)、细胞生长速度快(在细胞接种密度适宜的情况下2-4天可以长满单层进行传代)、可规模化生产的特征，所以接种病毒后可使病毒均一、批间差异小、生产病毒的周期缩短，从而简化了疫苗的生产工艺、缩短了生产周期。而羊睾丸原代细胞存在采集羊睾丸受季节影响(夏冬季不能采集)、携带其他病原体的风险、制备原代细胞过程繁琐、耗时长、传代分种比例低(只能1:2进行分种)、细胞生长速度慢(在细胞接种密度适宜的情况下5天到一周可以长满单层进行传代)等不足，因此本发明用传代细胞进行病毒的繁殖用于疫苗生产，降低了生产成本、劳动强度，同时还能保证制备得到的羊口疮疫苗质量稳定。

Claims (9)

1.用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于，将羊口疮病毒接种在传代稳定的传代细胞系上，所述传代细胞系为Macr-145细胞或MDBK细胞，在37℃培养液中培养，至发生病变的传代细胞病变率达85％及以上时收获病毒液，得到增殖的羊口疮病毒；
所述培养液包含MEM培养基、MEM体积的1％新生牛血清、终浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺和终浓度为10mmol/L的HEPES，用7.5％碳酸氢钠溶液调节pH值为7.4±0.2。
2.根据权利要求1所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：至发生病变的传代细胞病变率达85％-95％时收获病毒液。
3.根据权利要求1所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：传代稳定的传代细胞系的获得，是将已有冻存的传代细胞系在细胞培养液中复苏，置37℃恒温箱中培养20h以上后更换细胞培养液，继续培养至48h以上，按照1：3或1:4的比例进行传代，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至细胞培养瓶中培养，稳定传3-5代；
所述细胞培养液的配方：培养基为MEM，按MEM的体积添加8-10％新生牛血清，终浓度2mmol/L的L-谷氨酰胺，终浓度为10mmol/L的HEPES；用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.0-7.3。
4.根据权利要求3所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：冻存的传代细胞系复苏方法为：从液氮中取出一支的传代细胞系，融化，离心，弃上清液，加入所述细胞培养液作为复苏液，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至培养瓶在37℃恒温箱中培养。
5.根据权利要求1所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：传代细胞发生病变现象为细胞出现空洞、细胞破裂、聚堆、部分脱离瓶壁。
6.根据权利要求5所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：病变率数值用活细胞计数得到；
病变率＝(未接种病毒细胞的细胞数-产生病变细胞的活细胞数)/未接种病毒细胞的细胞数×100％。
7.根据权利要求1所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：接种在传代稳定的传代细胞系上的羊口疮病毒是经羊睾丸细胞繁殖获得的细胞毒，具体方法为：采集羊口疮发病羊病料-痂皮毒，经研磨、浸毒、离心后取上清，接种羊睾丸原代细胞，当细胞病变达85％以上时收获病毒液，继续接种至羊睾丸原代细胞，当细胞病变达85％以上收获病毒液，如此连续传代至收获时间稳定、病变稳定的病毒液作为接种用羊口疮病毒。
8.根据权利要求1至7任一项所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)传代细胞系的传代：从液氮中取出1支传代细胞系进行复苏，置37℃恒温箱中培养20h以上后更换细胞培养液，继续培养至48h以上，按照1：3或1:4的比例进行传代，调节接种密度至1-10×105个细胞/mL，转至细胞培养瓶中培养，稳定传3-5代；
所述细胞培养液的配方：培养基为MEM，按MEM的体积添加8-10％新生牛血清，终浓度2mmol/L的L-谷氨酰胺，终浓度为10mmol/L的HEPES；用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.0-7.3；
2)羊口疮病毒的繁殖：将步骤1)中传代稳定的传代细胞系按种毒含量为体积比为1-2％的比例接种羊口疮病毒，羊口疮病毒传代细胞系中繁殖的条件为：培养基为MEM，培养基中按MEM的体积添加1％新生牛血清、添加L-谷氨酰胺使终浓度为2mmol/L、添加HEPES使终浓度为10mmol/L，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH至7.4±0.2，培养温度为37℃；
3)羊口疮病毒的收获：当步骤2)中发生病变的传代细胞病变率达85％及以上时收获病毒液，得到增殖的羊口疮病毒。
9.根据权利要求1所述的用传代细胞系制备羊口疮病毒的方法，其特征在于：所述收获的羊口疮病毒毒液在-20℃条件下冻融2-3次后保存。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1997037031A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 University Of Otago Parapoxvirus vectors
CN101979518A (zh) * 2010-05-10 2011-02-23 洛阳普莱柯生物工程有限公司 一种制备伪狂犬病病毒的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037031A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 University Of Otago Parapoxvirus vectors
CN101979518A (zh) * 2010-05-10 2011-02-23 洛阳普莱柯生物工程有限公司 一种制备伪狂犬病病毒的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
羊口疮病毒甘肃流行株的分离鉴定及其ＯＲＦ０５９基因和ＯＲＦ１０９基因的序列分析;王盈盈 等;《中国兽医科学》;20131231;第４３卷(第８期);第783页第1.1,1.3节 *

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