CN107261129A - 用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(e. coli)不耐热肠毒素(lt)的偶联 - Google Patents
用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(e. coli)不耐热肠毒素(lt)的偶联 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(E.COLI)不耐热肠毒素(LT)的偶联。本发明的多糖与去毒大肠杆菌不耐热肠毒素LT的共价偶联物，其可用作疫苗，其中所述的共价偶联物呈可溶形式，及其中所述的LT为LTS61K全毒素，并且维持其三级结构及对GM‑1的结合活性。研究结果显示，偶联多糖‑LTS61K疫苗相比于单独的多糖或与LTS61K混合的多糖在血清中诱导更高的多糖特异性IgG效价和更大的杀菌活性。抗LTS61K血清IgG抗体的存在减轻由大肠杆菌(ETEC肠毒性大肠杆菌)引起的旅行性腹泻。
Description
本申请是申请日为2011年4月29日、申请号为201180021528.1、发明名称为“用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(E.COLI)不耐热肠毒素(LT)的偶联”的发明专利申请的分案申请。
相关申请案交叉参考
本发明主张对在2010年5月3日申请的第61/330,650号美国临时专利申请案的优先权，其揭示内容是全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(E.COLI)不耐热肠毒素(LT)的偶联。
背景技术
多糖疫苗在不使用载体蛋白制备时缺少免疫记忆反应。当前已知的偶联疫苗包括细菌荚膜多糖，例如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)b型、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)C组和肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、19F、23F。所述疫苗共价偶联到载体蛋白，例如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、突变体无毒白喉毒素或脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白。这些多糖偶联疫苗尤其在年龄小于两岁的婴儿中可诱导T细胞依赖反应；且其可促发长期免疫记忆，产生高亲和力抗体，且可降低鼻咽移生和传播速率。
然而，当前销售的大部分细菌多糖偶联疫苗应用破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)作为载体蛋白。TT和DT，这两种类毒素蛋白是用于婴儿/儿童的合法疫苗；在短期内高频率接种TT和DT可能会影响免疫原性和安全性。(降低的对同时投予婴儿的具有共同蛋白表位的复合疫苗的反应(Reduced response to multiple vaccines sharing commonprotein epitopes that are administered simultaneously to infants).感染与免疫(Infect.Immun.)1998；66(5):2093-8；组合肺炎球菌-脑膜炎球菌疫苗在婴儿中的免疫原性和安全性：随机控制试验(Immunogenicity and safety of a combinationpneumococcal-meningococcal vaccine in infants:a randomized controlled trial).美国医学协会杂志(JAMA)2005；293(14):1751-8)。因此，本发明提供用于偶联疫苗的新型载体蛋白LTS61K。
发明内容
本发明包括多糖与去毒大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的偶联，其可用作疫苗来针对诸如流感嗜血菌和肺炎链球菌等传染性细菌的效应进行保护或免疫且减轻由肠毒性大肠杆菌引起的旅行性腹泻。
本发明的一个方面涉及以纯化形式分离的共价偶联的多糖-LTS61K疫苗。这些偶联产物在哺乳动物中具有非常优秀的免疫原性和杀细菌性特性。另一方面涉及将有效量的偶联多糖-LTS61K疫苗投予需要抵抗流感嗜血菌b型(Hib)的哺乳动物的方法。本发明疫苗刺激T辅助细胞反应，在再次暴露后展现强加强反应且具有高抗体效价。
本发明的另一方面涉及通过还原胺化和分离经纯化偶联产物产生偶联多糖-LTS61K的方法。根据本发明，已发现偶联多糖与LTS61K来制备本发明疫苗的优选方法是高碘酸盐氧化天然PS，之后进行还原胺化。
本发明偶联物中采用的LTS61K阐述于以下文献中：在2007年8月13日申请的第PCT/US2007/075801号PCT申请案；在2007年7月18日申请的第US 11/779419号美国申请案、在2008年5月15日申请的US 12/120,953和在2010年3月23日申请的US 12/729,649；以及在2006年10月27日申请且在2009年1月获准的第95139707号台湾专利申请案。这些申请案中的每一者中阐述的标的物都是以引用方式并入本文中。
附图说明
图1概括性绘示LT载体蛋白。
图2是Hib PRP糖的结构图。
图3展示若干种偶联方法。
图4展示本发明的还原胺化方法。
图5绘示PRP与LTS61K通过还原胺化偶联。
图6展示在NaIO4处理后经氧化PRP的HPLC-SEC-RI洗脱曲线。
图7是经氧化PRP的NMR谱。此光谱确认在高碘酸盐氧化后在PRP上形成醛基团。
图8展示远UV CD谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的二级结构之间无差异；且还展示荧光谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的λ最大三级结构之间无差异。
图9展示氨基酸分析，其确认PRP与LTS61K成功偶联且形成共价键。
图10展示SDS-PAGE蛋白质印迹(Western Blotting)分析以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。
图11展示通过IEF PAGE分析的经纯化PRP-LTS61K偶联物。
图12展示IEF蛋白质印迹以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。
图13通过HPLC-SEC-UV-MALLS-RI确认经纯化偶联疫苗的纯度。
图14展示通过IEF PAGE分析经纯化PRP-LTS61K偶联物以确认经纯化偶联疫苗的纯度。
图15概述对本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的大鼠免疫原性研究。
图16概述对本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究。
图17图解说明对本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价分析和抗PRP IgG Ab效价的结果。
图18图解说明关于兔免疫原性研究的其它信息。
图19图解说明对本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价(BA)和抗PRP IgG Ab效价(OD)的结果。
图20展示抗PRP和抗LTS61K抗体反应研究的其它兔免疫原性ELISA的结果。
图21展示其它兔血清杀菌分析和抗PRP IgG Ab的结果。
图22展示在第四次免疫后其它兔血清杀菌分析和抗PRP IgG Ab的结果。
图23展示在小鼠中对肺炎球菌PS血清型14-LTS61K偶联物的免疫原性。
具体实施方式
现在已经发现，根据本发明制备的偶联多糖-LTS61K疫苗可令人惊讶地相比于多糖或与LTS61K混合的多糖在血清中诱导更高的多糖特异性IgG抗体效价和更大的杀菌活性。
本文采用的缩写列表如下：
CFU：菌落形成单位
ELISA：酶联免疫吸附分析
Hib：流感嗜血菌b型
IEF：等电聚焦
LT：不耐热肠毒素
MALLS：多角度激光散射
OD：光密度
PNPS：肺炎球菌多糖
PRP：多核糖基核糖醇磷酸盐
PS：多糖
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC_HPLC：尺寸排除高压液相色谱
RI：反射率
本发明偶联物中采用的新载体蛋白是去毒重组大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LT，更具体来说是LTS61K。在LT突变体中，A和B亚单元形成典型的AB5全毒素结构。去毒LT突变体(LTS61K)含有在氨基酸位置61处包括K的突变成熟亚单元A(LTA)和野生型成熟亚单元B(LTB)。LTS61K使产物的毒性显著低于野生型LT。载体蛋白绘示于图式中的图1中。
选作本发明起始材料之一的LTS61K的发明是基于以下意外发现：含有突变LTA的LT展现与其野生型对应物相比降低的毒性且同时保留免疫原性。此突变LTA在对应于野生型LTA的位置61的位置处具有氨基酸取代，所述野生型LTA的氨基酸序列SEQ ID NO:5展示于以引用方式并入本文中的所引用专利申请案中。因此，LTS61K的特征在于包括突变LTA的经分离多肽，所述突变LTA在对应于SEQ ID NO:5的位置61的位置处含有并非S、T和F的氨基酸残基。取代氨基酸残基可为D、E、H、I、K、L、N、P、Q、R、Y或W。其可能是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，例如D-氨基酸或β-氨基酸。在一个实例中，LTA具有氨基酸序列SEQ IDNO:2、4、8或10。含有此突变LTA的LT展现降低的毒性，即为并入本文中的上述专利申请案中含有SEQ ID NO:5的野生型LT的<10-5倍。
根据本发明，培养流感嗜血菌b型且纯化其荚膜多糖抗原，即多核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)。PRP是直链，具有负电荷且具有亲水性。具有分子量345和式10C,18H,11O,1P的HibPRP糖如图式中的图2中所绘示。
通过产生偶联疫苗的化学还原胺化反应使PRP偶联到LTS61K上，其中采用多糖PRP对蛋白质(LTS61K)的适当摩尔比。PRP:LTS61K的摩尔比范围展示于下表1中。优选地，PRP:LTS61K的摩尔比范围介于约3:1与约60:1之间，且摩尔/摩尔IO4 -/PRP介于约0.1与约0.4之间。
表1.不同比率的PRP/LTS61K偶联测试
另外，根据本发明，通过还原胺化反应将来自流感嗜血菌b型和肺炎链球菌的多种不同类型的细菌荚膜多糖抗原与LTS61K蛋白化学偶联。采用如上文表1中所示多种不同摩尔比率的NaIO4:PRP来氧化多糖以产生具有不同重复单元的短长度多糖。在以适当摩尔比使多糖与LTS61K反应后，获得成功偶联且经纯化的多糖-LTS61K偶联产物。产物呈可溶形式且通过以下方法进行物理和化学评估：SEC-HPLC、地衣酚、SDS-PAGE、蛋白质印迹、IEF、GM1结合活性、圆二色性和荧光分析，从而确定多糖抗原与LTS61K载体蛋白成功化学偶联。
制备与LTS61K偶联的多糖的程序的实例：
多种可能的偶联工艺图解说明于图式中的图3中。根据本发明选择的还原胺化工艺的概括性流程图参见糖偶联物杂志(Glyconjugate J.)1989.6:489且再现为图式中的图4。
根据本发明，通过高碘酸盐氧化将多糖裂解为较小片段以产生醛端基。之后，通过还原胺化偶联经氧化多糖与LTS61K蛋白。更具体来说，所述工艺的实例如下：
A.多糖活化(高碘酸盐氧化)：将天然多核糖基核糖醇磷酸盐(PRP，其为流感嗜血菌b型经纯化荚膜多糖)以5mg/mL的量与0.3mg/mL或0.6mg/mL或1.2mg/mL的高碘酸盐(IO4 -)混合(IO4 -对PRP的摩尔比(m/m)＝0.1、0.2、0.4)。将此混合物在4℃下在暗中静置24小时。然后添加甘油以终止反应。使用3.5K膜将所得经氧化PRP对ddH2O进行透析以移除杂质。用0.22μm过滤器对所得产物进行无菌过滤。高碘酸盐氧化程序将多糖PRP片段化为不同链长度。PRP的重复单元的平均数范围为约40到10。
B.多糖-LTS61K偶联：制备PRP与LTS61K的偶联物，分别以10mg/mL、3mg/mL和10mg/mL混合上文获得的经氧化PRP、经纯化LTS61K(其揭示于先前获得/申请的专利中)与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，使反应在4℃下在暗中进行2周。通过添加硼氢化钠NaBH4淬灭PRP上未反应的醛来终止反应，然后将制剂用10K膜对ddH2O进行透析。
C.表征多糖与LTS61K的偶联产物：在以适当摩尔比使多糖与LTS61K反应后，获得成功偶联且经纯化的多糖-LTS61K偶联产物。通过以下方法对呈可溶形式的产物进行物理、化学和生物学评估：SEC-HPLC、地衣酚、SDS-PAGE、蛋白质印迹、IEF、GM1结合活性、圆二色性和荧光分析，从而确认多糖抗原与LTS61K载体蛋白成功化学偶联、多糖对LTS61K蛋白的比率和其免疫原性。图式中的图5概述根据本发明具体实例采用的反应条件和分析。
现参照图式中涉及偶联物和疫苗的结构与纯度的图。
图6展示在NaIO4处理后经氧化PRP的HPLC-SEC-RI洗脱曲线。此图图解说明本发明方法且结果可容易地重现。
图7是经氧化PRP的NMR谱。此确认在高碘酸盐氧化后在PRP上形成醛基团。
图8展示远UV CD谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的二级结构之间无差异；且还展示荧光谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的λ最大三级结构之间无差异。
图9展示氨基酸分析，其确认PRP与LTS61K成功偶联且形成共价键。
图10展示SDS-PAGE蛋白质印迹分析以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。
图11展示通过IEF PAGE分析的经纯化PRP-LTS61K偶联物。
图12展示IEF蛋白质印迹以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。
图13通过HPLC-SEC-UV-MALLS-RI确认经纯化偶联疫苗的纯度。
图14展示通过IEF PAGE分析经纯化PRP-LTS61K偶联物以确认经纯化偶联疫苗的纯度。
下表2是GM1结合分析的结果，其确认，LTS61K蛋白在偶联后保留其结合活性。
表2
展示多糖-LTS61K偶联物的效能的哺乳动物临床前研究：
以两周间隔以肌内方式使用预定人类剂量的多糖、与LTS61K混合的多糖或多糖-LTS6K偶联物对新西兰白兔进行三次免疫以评估偶联疫苗的效力。所有疫苗制剂都不含AlPO4或其它相关佐剂。通过检测抗多糖抗原特异性IgG效价的ELISA和检测抗体的功能活性的血清杀菌分析测定所有疫苗的免疫反应。研究结果表明，只有成功偶联的多糖-LTS61K疫苗才能相比于单独的多糖或单独的与LTS61K混合的多糖在血清中诱导更高的多糖特异性IgG抗体效价和更大的杀菌活性。动物免疫原性研究表明，包括LTS61K蛋白的去毒大肠杆菌不耐热肠毒素全毒素可用作多糖的载体蛋白以显著刺激对多糖抗原的特异性免疫反应。
现参照图式中其它涉及初始哺乳动物研究的结果的图。
图15概述本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的大鼠免疫原性研究。
图16概述本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究。
图17图解说明本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价分析和抗PRP IgG Ab效价的结果。只有PRP-LTS61K偶联物能诱导抗PRP IgG Ab效价。额外添加到PRP-LTS61K偶联物中的LTS61K不会增强抗PRP IgG Ab。
图18图解说明关于兔免疫原性研究的其它信息。
图19图解说明本发明Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价(BA)和抗PRP IgG Ab效价(OD)的结果。
采用所述程序进行其它研究且观察到的结果阐述如下：
以两周间隔以肌内方式使用预定人类剂量的多糖、与LTS61K混合的多糖以及多糖-LTS61K偶联物对新西兰白兔进行三次和四次免疫以评估偶联疫苗的效力。所有制剂都不含AlPO4或其它相关佐剂。通过检测抗多糖抗原特异性IgG效价的ELISA和显示抗多糖抗体的功能活性的血清杀菌分析测定所有疫苗的免疫反应。还通过ELISA测定血清抗LTS61KIgG效价的反应，并且使用体外Caco-2细胞cAMP诱导和Y-1肾上腺细胞毒性集拢(roundingup)研究来测定血清抗LTS61K Ab对野生型LT的中和能力。实施体内兔回肠袢攻击研究以检验抗LTS61K抗体的功能。动物免疫原性研究表明，包括LTS61K蛋白的去毒大肠杆菌不耐热肠毒素全毒素可用作多糖的载体蛋白以显著刺激对多糖抗原的特异性反应。LTS61K自身可用作免疫原，并且有效产生针对野生型LT的抗体。
A.兔免疫原性研究.使用10μg剂量的PRP以肌内方式对兔进行免疫，供试品包括：PRP、与LTS61K偶联的PRP和与LTS61K混合的PRP；以两周间隔给予两次和三次加强。在每次免疫后第14天采集血样，并且将所采集血清样品存储在-80℃下直到使用。
B.通过ELISA测定抗多糖和抗LTS61K抗体.将PRP-BSA偶联物涂布在96孔板上且PRP的浓度为100ng/孔以供抗PRP抗体测定，且用250ng/孔的LTS61K涂布以供抗LTS61K抗体测定。将经涂布板在4℃下培育16小时，且随后与作为封阻缓冲液的5％脱脂乳在37℃下一起培育1小时。从1:50的稀释度开始测试动物血清。使用在37℃下培育1小时的与辣根过氧化物偶联的山羊抗兔IgG来测量特定抗体，且通过添加TMB(四甲基联苯胺)过氧化物酶底物来揭示所述抗体，且在10分钟后，通过添加12％H2SO4来终止反应，且在OD(光密度)650-450nm(参照波长650nm)下读取吸光度。ELISA效价表示为OD 450≥0.5的最终稀释度的倒数。
C.血清杀菌分析.实施抗体依赖性补体介导的杀菌活性以获得杀灭超过50％的流感嗜血菌b型(Hib)菌落的血清稀释液效价。将血清样品在56℃下预处理30分钟以使兔血清中的补体失活。在96孔U形底板中以10μL体积制备血清样品的两倍连续稀释液。随后，添加20μL以1000CFU/20μL制备的经稀释Hib培养物。将混合物在37℃和5％CO2下再培育15分钟，且将50μL经1:1汉克氏缓冲液(hank's buffer)稀释的仔兔补体添加到每孔中，且将混合物在37℃和5％CO2下培育60分钟。将5μL添加有仔兔补体的混合物平铺于巧克力琼脂板中，且将板在37℃和5％CO2下培育16小时。计数Hib菌落形成单位且测定杀灭超过50％Hib菌落的血清稀释液效价。在图形中比较所有血清样品与稀释液效价的倒数。
D.在Caco-2细胞中使用环AMP(cAMP)EIA试剂盒(恩佐生命科学公司(Enzo LifeScience))通过经兔抗LTS61K血清抗体中和的野生型LT执行cAMP诱导研究。将10纳克野生型LT与150μL抗LTS61K兔血清(1:100稀释液)在室温下一起培育。在培育1小时后，将混合物添加到Caco-2细胞板(5×104细胞/孔)中，且将Caco-2细胞在37℃与5％CO2下再培育2小时。随后，用PBS洗涤细胞，并用0.1M HCL(200μL/孔)溶解，且用0.1M NaOH中和。通过在室温下以660×G离心10min来收集细胞溶解产物。通过使用市售EIA试剂盒分析所得悬浮液的细胞内cAMP水平。
E.在Y-1小鼠肾上腺肿瘤细胞上检验使用兔抗LTS61K血清的连续稀释液的对野生型LT的中和研究。对于Y-1细胞分析，将兔血清50×、100×到102,400×的两倍连续稀释液与野生型LT 10-5μg(其为EC 50，即野生型LT在Y-1肾上腺细胞上产生大于50％细胞圆化的毒素浓度)预混合，之后将混合物添加到Y-1肾上腺细胞(5×104细胞/孔)。在培育24小时后观察细胞的形态变化(细胞圆化)。
F.兔回肠袢积液研究：在兔回肠袢分析中实施兔抗LTS61K血清抗体针对野生型LT的中和。在用PRP或与LTS61K偶联的PRP或与LTS61K混合的PRP免疫后，在兔中制备具有5.5cm节段的兔回肠袢。将浓度在0.01μg到1μg范围内的野生型LT投予每一研究动物；在18小时后测量每一节段中的积液量。
与LTS61K偶联的多糖的免疫原性效应的结果：显示多糖-LTS61K偶联物的效能的哺乳动物临床前研究
参照图式中的图20到23和表3到5，研究结果阐述于下文中。
通过ELISA测定针对PRP和针对LTS61K的抗体。兔中的免疫原性结果展示于图20中；只有注射三次PRP-LTS61K偶联物的兔才激发高抗PRP IgG抗体效价且所述效价是PRP或与LTS61K混合的PRP的1000倍。PRP-LTS61K偶联疫苗诱导的主要免疫球蛋白是IgG。抗LTS61K IgG抗体的高效价的存在不干扰抗PRP IgG Ab的免疫反应。
在图20中显示抗PRP和抗LTS61K抗体反应结果的兔免疫原性ELISA，所有动物都以2周间隔接受总计三次肌内剂量(每次10μg)的偶联PRP。在剂量1后1周(1WPD1)、剂量2后1周(1WPD2)和剂量3后2周(2WPD3)采集并分析血清，如图20中所绘示。
通过测试兔血清的杀菌活性来评估抗PRP抗体通过偶联物诱导的保护力。测定针对流感嗜血菌b型(Hib)艾根(Eagen)株的杀菌效价，数据呈现为杀灭超过50％的Hib菌落的血清稀释度倒数。图21显示，在以两周间隔用10μg/剂量的PRP对兔进行三次肌内免疫后，所有三批内部制备的PRP-LTS61K偶联物的抗PRP IgG Ab和杀菌效价都类似，其中偶联PRP的平均重复单元为40或10，且PRP-LTS61K偶联物剂量为每剂量10μg/48μg到10μg/30μg。同时，经PRP和与LTS61K混合的PRP免疫的兔血清不能杀灭Hib细菌，其效价倒数<2，并且也无法激发抗PRP IgG抗体。只有成功的PRP-LTS61K偶联物具有杀细菌性效应且具有高抗PRP抗体效价。
图21展示在兔以2周间隔接受三次肌内剂量(每次10μg)的偶联PRP后的兔血清杀菌分析和抗PRP IgG抗体反应。所测试血清是在第43天，即剂量3后2周采集。
在兔接受初免(三次PRP-LTS61K偶联物免疫)后，对兔实施再加强研究。结果概述于图22中，其显示杀菌效价和抗PRP IgG抗体效价随时间逐渐降低，尽管6WPD3(剂量3后6周)兔血清杀菌效价低于兔血清2WPD3，但兔血清抗PRP IgG抗体和杀菌效价可在PRP-LTS61K偶联物的后续剂量后有效增强。然而，对于经PRP或与LTS61K混合的PRP免疫的兔未观察到这些现象。
对于图22，用不同比率的PRP-LTS61K偶联物对兔进行免疫。在不同时间获得血清，且执行ELISA抗PRP IgG Ab和杀细菌性分析。结果显示血清抗PRP IgG抗体与血清杀菌活性之间的关联，且显示用PRP-LTS61K偶联物对兔进行的第4次免疫有效再增强抗PRP Ab。
表3显示，在Caco-2细胞中，只有在兔血清含有高抗LTS61K抗体时，10ng的野生型LT毒素才不能刺激细胞内释放的cAMP水平的增加；这些兔血清是经PRP-LTS61K偶联物和与LTS61K混合的PRP免疫的兔血清。相反，从经PRP免疫的兔获得的兔血清并未阻止野生型LT增加Caco-2细胞中的cAMP水平。
表3：在Caco-2细胞中通过经兔抗LTS61K血清抗体中和的野生型LT进行的cAMP的诱导研究。
在Y-1小鼠肾上腺肿瘤细胞上使用兔抗LTS61K血清的连续稀释液实施对野生型LT的中和研究。表4中的结果显示，只有那些具有抗LTS61K抗体的兔血清才能有效中和野生型LT的毒性，这出现于经PRP-LT61K偶联物和与LTS61K混合的PRP免疫的兔血清中，但在经PRP免疫的兔血清中不出现。
表4中和研究
表5中的数据显示，在每5.5cm节段回肠袢0.01μg野生型LT的浓度下，在不含抗LTS61K抗体的兔中诱导积液；然而，在含有抗LTS61K抗体的兔中无积液。这些结果确认了那些先前获得的体外Caco-2cAMP诱导和Y-1肾上腺细胞中和研究，即血清抗LTS61K抗体能中和野生型LT。在不含抗LTS61K Ab且每节段投予0.5μg和1.0μg野生型LT的兔的回肠粘膜上观察到严重出血性损伤。
表5：兔回肠袢积液研究.
*积液是在每5.5cm节段兔回肠袢中测量。
**在不含抗LTS61K Ab且每节段投予0.5μg和1.0μg野生型LT的兔的回肠粘膜上观察到严重出血性损伤。
作为与LTS61K共价偶联的肺炎球菌多糖血清型14的实例，动物免疫原性研究的结果展示于图23中。通过ELISA测定对PNPS血清型14的抗体效价。样品是PS平均重复单元为94或40的PNPS 14-LTS61K偶联物、单独的PNPS 14、与LTS61K混合的PNPS 14以及PBS。只有偶联产物能诱导高抗PNPS14IgG抗体。在免疫程序期间，化学佐剂氢氧化铝的存在无益于或不显著增强抗PNPS 14抗体。
图23显示在小鼠中对肺炎球菌PS血清型14-LTS61K偶联物的免疫原性。只有给予PNPS 14-LTS61K偶联物的动物才激发高抗PS IgG抗体效价且所述效价是PNPS 14或与LTS61K混合的PNPS 14的500倍。
所属领域技术人员将明了许多不背离权利要求书界定的本发明精神和范围的对本发明的修改和改变。
Claims (10)
1.一种多糖与去毒大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素LT的共价偶联物，其可用作疫苗，其中所述的共价偶联物呈可溶形式，及其中所述的LT为LTS61K全毒素，并且维持其三级结构及对GM-1的结合活性。
2.根据权利要求1所述的共价偶联物，其是用以针对传染性细菌的效应进行保护或免疫。
3.根据权利要求2所述的共价偶联物，其中所述传染性细菌是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)或肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的共价偶联物，其中所述多糖是多核糖基核糖醇磷酸盐。
5.一种用于投予哺乳动物的疫苗，其包含经纯化的根据权利要求1到4中任一权利要求所述的共价偶联物。
6.一种经纯化的根据权利要求1到4中任一权利要求所述的共价偶联物的用途，其用于制造用以针对传染性细菌的效应对哺乳动物进行保护或免疫的药剂。
7.一种制备根据权利要求1到4中任一权利要求所述的共价偶联物的方法，其包含高碘酸盐氧化所述多糖，随后还原胺化所得多糖和所述的LT，以及分离所得共价偶联物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中PRP:LT的摩尔比范围介于约3:1与约60:1之间，并且摩尔/摩尔IO4/PRP介于约0.1与约0.4之间。
9.一种经纯化的根据权利要求1到4中任一权利要求所述的共价偶联物的用途，其用于制造用以针对旅行性腹泻的效应对哺乳动物进行保护或免疫的药剂。
10.一种经纯化的根据权利要求1到4中任一权利要求所述的共价偶联物的用途，其用于制造用以针对肠毒性大肠杆菌性腹泻的效应对哺乳动物进行保护或免疫的药剂。
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