[go: up one dir, main page]

CN107267624A - 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法 - Google Patents

一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107267624A
CN107267624A CN201710547153.1A CN201710547153A CN107267624A CN 107267624 A CN107267624 A CN 107267624A CN 201710547153 A CN201710547153 A CN 201710547153A CN 107267624 A CN107267624 A CN 107267624A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
primer
digital pcr
probe
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710547153.1A
Other languages
English (en)
Inventor
武利庆
董莲华
高运华
王晶
郑康乐
盛灵慧
金有训
米薇
杨彬
王志栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Metrology
Original Assignee
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Metrology filed Critical National Institute of Metrology
Priority to CN201710547153.1A priority Critical patent/CN107267624A/zh
Publication of CN107267624A publication Critical patent/CN107267624A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，包括如下步骤(1)准备待测目标蛋白质的抗体；(2)将获得的抗体用生物素进行标记；(3)合成三段单链寡聚核苷酸；(4)分别将两段寡聚核苷酸的5’端和3’端用亲和素进行标记；(5)设计Taqman探针和对应的引物；(6)利用生物素‑亲和素之间的放大亲和反应，用寡聚核苷酸标记抗体。(6)将待测目标蛋白用缓冲溶液稀释至5000分子/μL以下的浓度，并在其中加入寡聚核酸标记的两种抗体、第三条寡聚核酸片段及DNA连接酶，形成抗原‑抗体复合物。然后进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为浓度c0；(7)再次进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为c1；(8)待测目标蛋白的浓度为c0‑c1。

Description

一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法
技术领域
本发明涉及生物化学检测领域，特别是涉及一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定方法。
背景技术
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。基准测量方法是一种具有最高计量学品质的测量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最终不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准方法是形成量值源头的依据。
随着生命科学和生物技术的发展，生命科学已经经历了从“描述生物学”向“实验生物学”再向“创造生物学”发展的过程，当今的生物学已经成为精准定量的科学。没有对生命体各类生命现象的精确测量，便难以对生命过程进行全方位的调控与干预。蛋白质作为一类重要的生物大分子，是生命活动的主要承担者，在体内各个生命活动如营养代谢、酶催化、激素、免疫、遗传、变异等过程中均离不开蛋白质功能的发挥。鉴于蛋白质生物体内的重要作用，它已经成为众多领域的检测靶标。例如在体外诊断中，常见的体外诊断项目中有一半以上检测对象为蛋白质；在食品安全中，160多种食品含有可以导致过敏反应的食品过敏原，其中大于90％的过敏原都是蛋白质，根据国内食品标签标识管理规定，相应的蛋白质过敏原均应被检测并被标识；在生物医药领域，目前已经批准150多个蛋白质药物上市，400多种蛋白质药物处于临床研究阶段，3000多种处于临床前研究阶段。不论是体外诊断，还是食品安全与用药安全，这些都关乎大众健康与国计民生，相关领域蛋白质检验结果的准确可比则是保证大众健康与安全的基石。
通过建立量值溯源传递体系来保证检测结果的准确一致已经成为共识，是计量界的通行做法并在传统的物理计量与化学计量领域得到广泛和成功的应用。量值溯源传递体系的建立一是要有量值的源头，二是要有量值传递方法，尤其是要有具有较高测量准确度的“基标准”方法，才能保证国家基准复现的量值能够准确的传递到下一级的标准物质或工作计量器具上。高准确度量值传递方法的缺乏将导致即使国家基准能够复现出量值，也无法准确的传递下去，从而使得保证检测结果的准确可比成为空谈。因此，高准确度的计量方法研究在计量及量值溯源传递中具有举足轻重的作用。
蛋白质含量是蛋白质的基本属性，它描述了被定义的“蛋白质分子”数量的多少，是蛋白质测量的基本量值，在各类蛋白质检测项目中占到了80％以上。因此，要保证蛋白质含量检测结果的准确可比，必须研究建立高准确度的蛋白质含量计量方法，才能实现蛋白质量值的准确传递，从而达到检测结果准确可比、实现检测结果的互通与互认、保证贸易公平、保护人民大众健康的目的。
蛋白质含量测量方法按照测量准确度可以分为常规测量方法和高准确度的计量(潜)基准测量方法，常用的计量(潜)基准方法包括同位素稀释质谱法、质量平衡法和定量核磁法。按照测量原理可以分为滴定法、光谱法、色谱法、质谱法、电泳法、波谱法、综合法等，例如，常用的凯氏定氮、微量凯氏定氮等属于滴定法；双缩脲法、Folin-酚法(Lowry法)、考马斯亮蓝法等属于比色光谱法。按照测量过程中是否需要上一级标准，可以分为蛋白质含量绝对测量方法和相对测量方法两类。蛋白质含量绝对测量方法在测量过程中不需要同样的标准物质作为标准，而相对测量方法在测量过程中需要相应的标准物质绘制标准曲线，或者通过括弧法或单点法进行定量。质量平衡法、定量核磁法、凯氏定氮法属于绝对测量方法，而同位素稀释质谱法、液相色谱法、比色法等大多数蛋白质含量测量方法都属于相对测量方法。
IDMS是应用稳定同位素进行化学分析的一种方法，在测定蛋白质含量时，该方法将一定量的同位素标记化合物添加到样品中，这些同位素标记化合物可以是同位素标记的元素、氨基酸、肽段或蛋白质。待同位素与样品混合均匀后进行水解或酶解的操作，再通过质谱技术检测反应后非标记物和标记物的比例，由此对蛋白质进行准确定量。由于该方法所采用的内标物与待测物具有几乎相同的物理化学性质，在分离和分析过程中始终在一起，因此能够消除掉前处理过程和分析过程中的系统误差。通过对非标记物和标记物比例的精确测量及所加入稀释剂的准确称量，有效地保证了高精度和高准确度。一旦稀释剂与样品反应平衡，同位素比值恒定，在保证测量操作正确的情况下检测结果很难受到影响，具有很高的稳定性。而高灵敏度的质谱可以提高IDMS的检测水平，进行微量、痕量以及超痕量的分析。
质量平衡法(Mass Balance Method)是一种高纯固体蛋白含量绝对测量方法，其测量结果具有很小的不确定度。它将主成分的含量作为1，然后采用各种技术对其中含有的无机成分、有机杂质、挥发性成分、水分等逐一进行测定并扣除，从而对物质进行绝对定量。该方法在有机高纯小分子的纯度测定中应用广泛，在蛋白质准确定量中，仅用于肽段或小蛋白的测定，总的来说，由于蛋白质组成复杂，该方法在蛋白质含量准确测定中的应用还十分有限。
定量核磁共振技术(qNMR)是近些年提出的在核磁共振技术的基础上，向样品中加入定量已知的标记物，后根据被测物的分子量、选定的定量积分信号以及产生该信号的质子数，代入计算公式边可以定量研究。此外，作为新型的定量技术，qNMR有分析速度快、预处理简单等特点。受到谱峰重叠的干扰，定量核磁技术也只能用于小的肽段或蛋白质的准确定量。
上述这些方法在进行蛋白质定量时，同样需要使用一种化学品的标准物质来做标准，其量值不是直接溯源到SI单位的；同时，上述测定方法蛋白质含量的测定结果是基于其一级序列的蛋白质浓度，不能反映出蛋白质的活性；另外，同位素稀释质谱测定过程中需要将蛋白质分解成小分子如氨基酸或者肽段以后进行测定，在水解或者酶解过程中，可能引入一定的不确定度。
因此，建立一种能够不依赖任何标准品直接对目标蛋白进行定量的基准方法，尤其是能够直接测定蛋白质活性浓度的基准方法是十分必要和迫切的。
发明内容
本发明建立了一种采用数字PCR技术对蛋白质活性浓度进行直接测定的基准技术，在测定过程中不必依赖任何标准品，测定结果为能够与抗体结合的免疫活性浓度，同时测定结果可以直接溯源到SI单位，符合计量基准方法的定义。
一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，包括如下步骤：
(1)准备待测目标蛋白质的抗体，如果是多克隆抗体，准备一种即可；如果是单克隆抗
体，需要准备针对不同表位的两种单克隆抗体；
(2)将获得的抗体用生物素进行标记；
(3)合成三段单链寡聚核苷酸，其中两段寡聚核苷酸连接后可与第三段形成具有100～200bp的互补序列，可形成双链DNA；
(4)分别将两段寡聚核苷酸的5’端和3’端用亲和素进行标记；
(5)针对寡聚核苷酸形成的双链片段，设计Taqman探针和对应的引物；
(6)利用生物素-亲和素之间的放大亲和反应，用寡聚核苷酸标记抗体；如果采用的是多克隆抗体，将多克隆抗体分成两个部分，每个部分分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的多克隆抗体；如果是单克隆抗体，每种单克隆抗体分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的单克隆抗体；
(7)将待测目标蛋白用缓冲溶液稀释至5000分子/μL以下的浓度，在其中加入寡聚核酸标记的两种抗体、第三条寡聚核酸片段及DNA连接酶，形成抗原-抗体复合物；然后在其中加入扩增缓冲液、4种dNTP混合物、抗原-抗体复合物、Taqman探针及引物、Taq DNA聚合酶、Mg2+，进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为浓度c0；
(8)在(7)的条件下，除了目标蛋白溶液用双蒸水替代，其它条件与(7)的条件一致，再次进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为c1；
(9)待测目标蛋白的浓度为c0-c1，单位为分子数/μL；如果需要，将分子数浓度除以阿伏伽德罗常数后即得到摩尔浓度。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(1)中：所用抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体；所用抗体应当对目标蛋白具有一定的亲和性和特异性；当选用的抗体是单克隆抗体时，需要两种针对两个不同表位的单克隆抗体，且两个表位在空间上应当相距一定的距离，不能存在空间位阻；当选用的抗体是多克隆抗体时，只需要一种即可。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(2)中：用生物素标记抗体，可以自行标记，也可以选用商品化的生物素抗体标记试剂盒进行标记。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(3)中：单链寡聚核酸可形成200bp以下的双链DNA结构，且该结构不进一步形成复杂的二级结构；也可以选择商品化的试剂盒作为标记用的寡聚核苷酸标记探针。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(4)中：亲和素标记寡聚核苷酸，可以自行标记；也可以选用商品化的试剂盒进行标记。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(5)中：设计Taqman探针和引物，根据两个单链DNA形成的双链DNA片段，采用软件设计该区间扩增所用的Taqman探针和引物，其中引物的设计应当遵循下面的原则：
(1)引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；
(2)扩增产物不能形成二级结构；
(3)引物长度一般在15～30碱基之间；
(4)G+C含量在40％～60％之间；
(5)碱基要随机分布；
(6)引物自身不能有连续4个碱基的互补；
(7)引物之间不能有连续4个碱基的互补；
(8)引物5′端可以修饰；
(9)引物3′端不可修饰；
(10)引物3′端要避开密码子的第3位；
Taqman探针的设计遵循以下原则：
(1)探针的长度25～32bp之间，且Tm值在68～72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合；
(2)探针的Tm值可用Oligo或Primer Preiemer软件计算，确保探针中GC含量在30～-80％，应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现；
(3)探针的5’端不能为G，否则G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现；
(4)Taqman探针应靠近上游引物，两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp；
也可以选用商品化试剂盒中与上一步两对寡聚核酸配套使用的引物和Taqman探针。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(6)中：抗体的寡聚核酸标记，在磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐的缓冲体系中都可以进行，直接将生物素标记好的抗体与亲和素标记好的DNA探针等比例混合，标记完成后对标记好DNA的抗体进行纯化。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(7)中：数字PCR扩增反应，扩增体系包括上下游引物、探针、Mg2+、Taq聚合酶、dNTP、和抗原-抗体复合物，用蒸馏水补足剩余体积；采用数字PCR或微滴数码PCR对起始拷贝数进行测定。
本发明所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其中，所述步骤(8)中：采用数字PCR或微滴数码PCR对背景拷贝数进行测定。
本发明的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法与现有技术相比，其突出效果在于：
(1)本发明建立的基于数字PCR的蛋白活性浓度测定基准方法在测定过程中不依赖任何标准品，直接对蛋白质样品的浓度进行测定；
(2)本发明建立的方法蛋白质含量测定结果可以直接溯源到SI单位；
(3)本发明建立的方法测定的蛋白质含量为目标蛋白中能够与指定抗体结合的活性蛋白浓度，而非蛋白质一级序列浓度。
下面结合具体实施例对本发明的基于数字PCR的蛋白活性浓度测定基准方法作进一步说明。
具体实施方式
实施例
一种基于数字PCR的蛋白活性浓度测定基准方法：
针对脂肪酸结合蛋白FABP，从Abcam公司购买其多抗，用Nanodrop对抗体的浓度进行定量，0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6)稀释到1mg/ml，体积为1～2.5ml；
按照下述方法对抗体进行生物素标记：
(1)交互用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6)，对抗体充分透析；
(2)用1ml DMSO溶解NHSB 1mg；
(3)向1ml抗体溶液(即含抗体1mg)加入120μl NHSB溶液(即含NHSB 120μg)；
(4)在室温下持续搅拌，保温2～4小时；
(5)加入9.6μL1mol/L NH4Cl(每25μg NHSB加1μl)，在室温下搅拌10分钟；
(6)在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；
(7)将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，抗体在1～3ml之间洗下，置于-20℃保存。
委托生物技术服务公司合成3’和5’寡聚核酸片段，引物和Taqman探针，经高效液相色谱纯化并脱盐，其纯度达到99％，引物和探针信息如下：
引物/探针 5’->3’序列
正向引物 TGCGCTGTATGCCGGTATG
反向引物 GTTGTTCGGGTCAATCCAGTTC
探针 6-FAM-CCTCAACGGCATTATGGCGGTCCTT–TAMRA
采用商品化的链霉亲和素标记试剂盒对纯化号的两对寡聚核酸片段进行链霉亲和素的标记。取稀释好的待测FABP溶液1μL，在其中加入两种寡聚核酸标记抗体各10μL，第三条寡聚核酸链2μL，DNA连接酶2μL，在37℃孵育形成抗原抗体复合物。配制荧光实时定量PCR扩增体系，包括上下游引物各0.25μL(50μmol/L)，探针2μL(5μmol/L)，10×buffer(Mg2+)2.5μL，Taq聚合酶0.25μL(5U/μL)，dNTP 0.5μL(10mmol/L)，待测抗原抗体复合物1μL，用蒸馏水补足剩余体积。扩增条件50℃2min，95℃10min，1个循环；95℃20s，60℃40s，40个循环。采用Life Technologies的QuantStudioTM3D Digital PCR对起始拷贝数进行测定，结果为1785copies/μL。将上述扩增体系中的模板用水替代，再次进行数字PCR的分析，结果为485copies/μL，因此FABP的最终测量结果为1300copies/μL。根据稀释倍数，计算出脂肪酸结合蛋白FABP母液的活性浓度为0.17mg/g。
为突出本发明实施例的突出效果，还进行了同位素稀释质谱法的对比试验：
对比例
(1)采用最小分度为0.001mg的天平称取20μL脂肪酸结合蛋白FABP母液，加到2mL安瓿瓶中，再加入20μL标记氨基酸混标溶液。加入500μL 6mol/L盐酸，通氮2min除氧后密封，在(110.0±0.5)℃的烘箱中进行水解。水解后氮气吹干，用200μL水(含0.1mol/L盐酸)复溶，经0.22μm滤膜过滤后进行质谱分析。
(2)所用液相色谱-质谱分析条件为：色谱柱：Agilent SB-Aq(2.1×150mm)；流速：0.2mL/min。质谱条件：离子对质荷比：脯氨酸：116->70(Pro)和121->74(标记Pro)；缬氨酸：118->72(Val)和123->76(标记Val)；苯丙氨酸：166->120(Phe)和174->128(标记Phe)。
FABP HPLC-IDMS纯度测定流动相及梯度
(3)根据下述公式计算FABP蛋白的浓度
式中：
cFABP——FABP的蛋白质含量，g/g；
cL-AA——通过HPLC-IDMS测定的氨基酸的含量，g/g；
MFABP——FABP的分子量；
wTotal——称量的FABP的质量，g；
ML-AA——氨基酸的分子量；
对12个FABP样品的测定结果如下表所示：
FABP样品HPLC-IDMS定量结果g/g
通过以上对比例和实施例的试验结果对比，可以得出以下结论：
(1)现有的同位素稀释质谱方法作为基准方法，测定蛋白质浓度为基于一级序列的蛋白总浓度，不是蛋白质的活性浓度，其浓度大于采用实施例测定的FABP的活性浓度；
(2)同位素稀释质谱实时过程中，同样需要氨基酸标准物质作为测量标准，不是直接对样品中的FABP进行定量，而实施例在测定过程中不依赖任何标准品即可对样品中的FABP浓度进行测定。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准备待测目标蛋白质的抗体，如果是多克隆抗体，准备一种即可；如果是单克隆抗体，需要准备针对不同表位的两种单克隆抗体；
(2)将获得的抗体用生物素进行标记；
(3)合成三段单链寡聚核苷酸，其中两段寡聚核苷酸连接后可与第三段形成具有100～200bp的互补序列，可形成双链DNA；
(4)分别将两段寡聚核苷酸的5’端和3’端用亲和素进行标记；
(5)针对寡聚核苷酸形成的双链片段，设计Taqman探针和对应的引物；
(6)利用生物素-亲和素之间的放大亲和反应，用寡聚核苷酸标记抗体；如果采用的是多克隆抗体，将多克隆抗体分成两个部分，每个部分分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的多克隆抗体；如果是单克隆抗体，每种单克隆抗体分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的单克隆抗体；
(7)将待测目标蛋白用缓冲溶液稀释至5000分子/μL以下的浓度，在其中加入寡聚核酸标记的两种抗体、第三条寡聚核酸片段及DNA连接酶，形成抗原-抗体复合物；然后在其中加入扩增缓冲液、4种dNTP混合物、抗原-抗体复合物、Taqman探针及引物、Taq DNA聚合酶、Mg2 +，进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为浓度c0；
(8)在(7)的条件下，除了目标蛋白溶液用双蒸水替代，其它条件与(7)的条件一致，再次进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为c1；
(9)待测目标蛋白的浓度为c0-c1，单位为分子数/μL；如果需要，将分子数浓度除以阿伏伽德罗常数后即得到摩尔浓度。
2.根据权利要求1所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(1)中：所用抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体；所用抗体应当对目标蛋白具有一定的亲和性和特异性；当选用的抗体是单克隆抗体时，需要两种针对两个不同表位的单克隆抗体，且两个表位在空间上应当相距一定的距离，不能存在空间位阻；当选用的抗体是多克隆抗体时，只需要一种即可。
3.根据权利要求2所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(2)中：用生物素标记抗体，可以自行标记，也可以选用商品化的生物素抗体标记试剂盒进行标记。
4.根据权利要求3所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(3)中：单链寡聚核酸可形成200bp以下的双链DNA结构，且该结构不进一步形成复杂的二级结构；也可以选择商品化的试剂盒作为标记用的寡聚核苷酸标记探针。
5.根据权利要求4所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(4)中：亲和素标记寡聚核苷酸，可以自行标记；也可以选用商品化的试剂盒进行标记。
6.根据权利要求5所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(5)中：设计Taqman探针和引物，根据两个单链DNA形成的双链DNA片段，采用软件设计该区间扩增所用的Taqman探针和引物，其中引物的设计应当遵循下面的原则：
(1)引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；
(2)扩增产物不能形成二级结构；
(3)引物长度一般在15～30碱基之间；
(4)G+C含量在40％～60％之间；
(5)碱基要随机分布；
(6)引物自身不能有连续4个碱基的互补；
(7)引物之间不能有连续4个碱基的互补；
(8)引物5′端可以修饰；
(9)引物3′端不可修饰；
(10)引物3′端要避开密码子的第3位；
Taqman探针的设计遵循以下原则：
(1)探针的长度25～32bp之间，且Tm值在68～72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合；
(2)探针的Tm值可用Oligo或Primer Preiemer软件计算，确保探针中GC含量在30～-80％，应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现；
(3)探针的5’端不能为G，否则G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现；
(4)Taqman探针应靠近上游引物，两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp；
也可以选用商品化试剂盒中与上一步两对寡聚核酸配套使用的引物和Taqman探针。
7.根据权利要求6所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(6)中：抗体的寡聚核酸标记，在磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐的缓冲体系中都可以进行，直接将生物素标记好的抗体与亲和素标记好的DNA探针等比例混合，标记完成后对标记好DNA的抗体进行纯化。
8.根据权利要求7所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(7)中：数字PCR扩增反应，扩增体系包括上下游引物、探针、Mg2+、Taq聚合酶、dNTP、和抗原-抗体复合物，用蒸馏水补足剩余体积；采用数字PCR或微滴数码PCR对起始拷贝数进行测定。
9.根据权利要求8所述的基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：所述步骤(8)中：采用数字PCR或微滴数码PCR对背景拷贝数进行测定。
CN201710547153.1A 2017-07-06 2017-07-06 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法 Pending CN107267624A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710547153.1A CN107267624A (zh) 2017-07-06 2017-07-06 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710547153.1A CN107267624A (zh) 2017-07-06 2017-07-06 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107267624A true CN107267624A (zh) 2017-10-20

Family

ID=60072283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710547153.1A Pending CN107267624A (zh) 2017-07-06 2017-07-06 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107267624A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107894410A (zh) * 2017-10-26 2018-04-10 南昌大学 一种用于细胞表面分子成像的荧光探针及其合成方法
CN109187484A (zh) * 2018-09-13 2019-01-11 广西师范大学 一种用亲和反应调控碳点催化sers检测生物素的方法
CN112695075A (zh) * 2021-01-07 2021-04-23 中国计量科学研究院 一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用
WO2022012673A1 (zh) * 2020-07-15 2022-01-20 南京岚煜生物科技有限公司 抗体标准品赋值和抗体检测试剂最低检出限确定的方法
CN114657235A (zh) * 2022-04-11 2022-06-24 中国计量科学研究院 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044231A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-30 Simon Fredriksson Method and kit for proximity probing with multivalent proximity probes
CN101382552A (zh) * 2007-09-05 2009-03-11 周国华 一种用于蛋白质含量差异测定的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044231A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-30 Simon Fredriksson Method and kit for proximity probing with multivalent proximity probes
CN101382552A (zh) * 2007-09-05 2009-03-11 周国华 一种用于蛋白质含量差异测定的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CEM ALBAYRAK等: "Digital Quantification of Proteins and mRNA in Single Mammalian Cells", 《MOLECULAR CELL》 *
MATS GULLBERG等: "Cytokine detection by antibody-based proximity ligation", 《PNAS》 *
尤超等: "PCR 引物设计方法综述", 《现代农业科技》 *
杜鹃等: "《医学细胞与分子生物学理论与技术》", 31 July 2012, 吉林大学出版社 *
郑铁生等: "《临床生物化学检验》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107894410A (zh) * 2017-10-26 2018-04-10 南昌大学 一种用于细胞表面分子成像的荧光探针及其合成方法
CN109187484A (zh) * 2018-09-13 2019-01-11 广西师范大学 一种用亲和反应调控碳点催化sers检测生物素的方法
CN109187484B (zh) * 2018-09-13 2020-12-04 广西师范大学 一种用亲和反应调控碳点催化sers检测生物素的方法
WO2022012673A1 (zh) * 2020-07-15 2022-01-20 南京岚煜生物科技有限公司 抗体标准品赋值和抗体检测试剂最低检出限确定的方法
US11630113B2 (en) 2020-07-15 2023-04-18 Lansion Biotechnology Co., Ltd. Method for assigning antibody standard and determining minimum detection limit of antibody detection reagent
CN112695075A (zh) * 2021-01-07 2021-04-23 中国计量科学研究院 一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用
CN114657235A (zh) * 2022-04-11 2022-06-24 中国计量科学研究院 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用
CN114657235B (zh) * 2022-04-11 2023-09-01 中国计量科学研究院 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107267624A (zh) 一种基于数字pcr的蛋白质活性浓度测定基准方法
Zor et al. Solution structure of the KIX domain of CBP bound to the transactivation domain of c-Myb
Gutierrez-Rodrigues et al. Direct comparison of flow-FISH and qPCR as diagnostic tests for telomere length measurement in humans
Sonnleitner et al. Interplay between the catabolite repression control protein Crc, Hfq and RNA in Hfq-dependent translational regulation in Pseudomonas aeruginosa
CN105548109B (zh) 一种重金属镉的荧光检测体系以及检测方法
JP5043237B2 (ja) 蛍光免疫測定方法
DE69708285D1 (de) Passive interne Referenzen für den Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten
CN104120184B (zh) 一种利用扩增dna片段长度多态性测定短链rna的方法
CN101855539A (zh) 内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒
CN104131112B (zh) 一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
Sugimoto et al. Insights on droplet digital PCR–based cellular kinetics and biodistribution assay support for CAR-T cell therapy
CN109837275B (zh) 一种融合基因阳性对照标准品的制备方法
CN102621297A (zh) 一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析检测方法
CN101573452B (zh) 探测大分子与其他分析物的分子生物感应器
Whitcombe et al. Development and evaluation of a new triplex immunoassay that detects group A Streptococcus antibodies for the diagnosis of rheumatic fever
Zhang et al. International co-validation on absolute quantification of single nucleotide variants of KRAS by digital PCR
CN105177127A (zh) 一套用于单增李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒
CN110484607A (zh) 一种实时荧光定量pcr仪校准用标准物质及其应用
Rosenblum et al. RiPCA: An Assay for the Detection of RNA‐Protein Interactions in Live Cells
CN101012483B (zh) 含核酸适配子的检测试剂及其制备方法和用途
Su et al. SI-traceable calibration-free analysis for the active concentration of G2-EPSPS protein using surface plasmon resonance
EP1752767A4 (en) METHOD FOR TESTING HYALURONIC ACID WITH HYALURONIC ACID BINDING PROTEIN
Lehmusvuori et al. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes
Rhea Determining the binding kinetics of peptide macrocycles using bio-layer interferometry (BLI)
Fox et al. Changes in the conformation and stability of 5 S RNA upon the binding of ribosomal proteins.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171020