CN107236757A

CN107236757A - 一种提高丝状真菌木质纤维素酶系表达及生物基化学品生产的方法

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Publication number: CN107236757A
Application number: CN201610181298.XA
Authority: CN
Inventors: 田朝光; 王邦; 李金根; 林良才; 赵军旗; 刘倩; 孙涛; 高婧芳; 孙文良; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-03-28
Filing date: 2016-03-28
Publication date: 2017-10-10

Abstract

本发明公开一种提高丝状真菌生产木质纤维素酶系的方法及其在微生物生物基化学品发酵中的应用，属于基因工程领域。本方法是利用敲除、突变、导入等基因工程方法对丝状真菌高亲和力葡萄糖转运蛋白进行改造，得到的工程菌株具备上述优势。所述丝状真菌包括但不限于脉孢菌、毁丝霉、木霉、曲霉、青霉、镰刀霉等，所述转运蛋白基因包括NCU10021（HGT‑1）及其同源基因和NCU04963（HGT‑2）及其同源基因，敲除其中的任意一个或双敲除两个，或突变一个或两个基因的碱基，或减弱任意一个或两个表达。通过将上述转运蛋白外源导入微生物菌株或改变内源该转运蛋白表达，得到的工程菌株获得或提高葡萄糖转运利用能力，进而获得或提高发酵生产有机酸、有机醇等生物基化学品的能力。

Description

一种提高丝状真菌木质纤维素酶系表达及生物基化学品生产的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶；提高微生物糖的转运吸收及其在生物基化学品发酵生产中的应用，涉及2个糖转运蛋白基因NCU10021（HGT-1）或其同源基因和NCU04963（HGT-2）或其同源基因。

背景技术

植物纤维素是自然界中存在最广泛、含量最丰富的碳水化合物。随着地球传统能源的快速消耗、环境污染和能源危机的日益加剧，纤维素作为潜力巨大、环境友好的可再生能源成为研究的重点。作为地球上含量最丰富的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食料和化学原料等，势必将会对人类社会的可持续发展起到关键作用。要利用这些储量巨大的生物质资源，需要糖化和发酵两个基本步骤。其中，如何将生物质高效地水解为单体化合物（葡萄糖、木糖等）已成为其利用过程中的一个迫切需要解决的问题。

自然界有一大类真菌能够自由生长在枯萎或腐烂的植物上，它们是生态圈的分解者。这类真菌大多属于腐生型的丝状真菌。丝状真菌粗糙脉孢菌很早就被发现具有降解利用纤维素的能力，是典型的纤维素降解真菌。在提高生物质降解效率的研究中，传统诱变技术已经取得了重大进步，提升空间有限。因此，本领域迫切需要开发能够提高纤维素酶生产从而提供菌株对纤维素利用的技术和方法。丝状真菌分泌的一系列木质纤维素酶，能将高聚化的纤维素和半纤维素降解为可溶解、可利用的简单糖类，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖，以及各种寡糖，包括纤维寡糖（二糖、三糖等等）和木寡糖。细胞欲利用这些简单的糖类，首先需要将这些膜不透过性营养分子转运进胞内。因此，糖的转运成为了解析纤维素降解利用的第一步，也是关键步骤之一

丝状真菌糖转运蛋白多属于膜蛋白家族MFS（major facilitator superfamily）。依据转运的机制，MFS又分为简单转运蛋白（uniporter），又称协助扩散蛋白（facilitated diffusion protein），同向转运蛋白（symporter）以及反向转运蛋白（antiporter）。Uniporter，依靠底物浓度梯度驱动转运，转运蛋白主要起着协助运输的作用。Symporter，向同一个方向同时转运两种及以上的底物，并以其中一种底物的电化学梯度作为推动力，常见的有sugar/H+，glucose/Na+，phosphate/H+，nucleoside/H+以及nitrate/H+等等。Antiporter，向反方向协同转运两种及以上的底物，驱动力来源和symporter一样，这一类里很多都是drag/H+反向转运蛋白。真菌中的糖转运蛋白主要是uniporter和symporter/H+类型。由于自然界中脉孢霉能生长在各种干枯的木质纤维上，可以预见其糖转运蛋白家族具有很高的功能多样性。同时，在长期的进化适应过程中，细胞面对不同的生长环境，如酸性-碱性，碳充足-碳匮乏，会有很好的策略来协同这些转运蛋白之间的转运工作，以使得其能高效地吸收外界的营养。通过研究和改造糖转运蛋白，提高糖的转运吸收，对改造工程菌（包括酵母，曲霉，木霉）以充分利用培养基中的残糖发酵，提高糖的转化利用率具有重要意义。

木质纤维素的主要成分是纤维素和半纤维素，其水解产物主要包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等。实现糖的共利用和高效利用一直是研究热点。然而，对多数微生物来说，葡萄糖的存在会限制其他糖的利用，称之为碳代谢物抑制（carbon catabolite repression, CCR）。CCR可以增加微生物对环境的适应和竞争力，所以对微生物自身来说CCR是有利的，而对工业应用来说，则是不利的，优先利用碳源会抑制其他碳源代谢过程所需酶基因的表达，如葡萄糖抑制纤维素酶的表达分泌，从而导致微生物不能利用纤维素。解除CCR的抑制作用，可以实现糖的共利用，快利用，从而提升工业菌株的生产能力。葡萄糖阻遏效应是一个复杂的过程，葡萄糖转运蛋白是其中重要的参与基因，通过研究调控葡萄糖转运蛋白，可以调控葡萄糖转运和下游阻遏效应，进而促进木糖等其他糖的利用，对实现生物质各类糖的共利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶表达的方法及其在糖利用中的应用。

本发明提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：

抑制丝状真菌两个保守的葡萄糖转运蛋白基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。

在另一优选例中，所述的丝状真菌包括：脉孢菌（Neurospora）、或毁丝霉（Myceliophthora）。

在另一优选例中，所述的丝状真菌还包括曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或毁丝霉(Myceliophthora)。

在另一优选例中，所述纤维素降解相关转运蛋白包括：

(a)SEQ ID NO.: 2、或4所示序列的一种或多种。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关转运蛋白还包括：

(b)与SEQ ID NO.: 2、或2所示序列同源性为50%以上，较佳地为60%以上，更佳地为65%以上的纤维素降解相关转运蛋白。

在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的纤维素降解相关转运蛋白的表达和/或活性。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关转运蛋白至少包括SEQ ID NO.: 1所示的序列。

在另一优选例中，所述的丝状真菌为脉胞菌，较佳地，为粗糙脉胞菌。

本发明还提供了一种纤维素降解相关转运蛋白或其基因的抑制剂的用途，(a)用于提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达；和/或(b)用于提高丝状真菌的纤维素降解活性。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关转运蛋白包括选自(a)SEQ ID NO.: 2、或4所示序列的一种或多种；或(b)与SEQ ID NO.: 2、或4所示序列同源性为50%以上，较佳地为60%以上，更佳地为65%以上的纤维素降解相关转运蛋白。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关转运蛋白的NCBI参考序列号包括：XP_001395794.2、XP_001396930.1、ACA66265.1、CAC80843.1、CAJ44796.1、XP_001822181.1、XP_001817192.1、XP_747770.1、XP_746376.1(曲霉)；KUM58567.1、KUM55954.1、XP_002561741.1、EPS26451.1(青霉)；XP_006964877.1、XP_006966515.1(木霉)；EYB25402.1、XP_382817.1(镰刀霉)；XP_003664932.1、XP_003658874.1(毁丝霉)。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括所述纤维素降解相关转运蛋白的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA 以及转运蛋白的活性抑制剂。

本发明还提供了一种用于降解纤维素的工程菌，所述工程菌中纤维素降解相关转运蛋白被敲除或被下调。

在另一优选例中，所述的工程菌不表达或基本不表达纤维素降解相关转运蛋白。

在另一优选例中，所述的“基本不表达”指的是与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素降解相关转运蛋白的表达量至少降低了50%，较佳地，至少降低了60%、70%、80%、或90%。

在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性至少提高了20%，较佳地，至少提高了50-80%，更佳地，至少提高了100-500%。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关转运蛋白包括选自SEQ ID NO.: 2、或4所示序列的一种或多种。

在另一优选例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脉孢菌（Neurospora）、或侧孢霉（Sporotrichum）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或毁丝霉(Myceliophthora)。

本发明还提供了一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，在纤维素原料的存在下，培养所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。

在另一优选例中，所述的诱导物即纤维素原料包括木质纤维素、结晶纤维素、木聚糖、木质纤维素水解物、木寡糖、纤维寡糖、木糖、或阿拉伯糖。

本发明还提供了一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，在木质素原料的存在下，培养所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。

本发明还提供了所述工程菌的用途，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。

该方法是利用敲除或突变转运蛋白基因的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，所述微生物为脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）或侧孢霉（Sporotrichum）。

本发明还提供了所述工程菌的用途，用于增强戊糖己糖共利用能力。通过敲除、突变，或降低所述葡萄糖转运蛋白表达，减低葡萄糖阻遏效应，从而提高混合碳源生长发酵时，戊糖的利用，提高戊糖-己糖共利用能力；

本发明还提供了一种增强丝状真菌葡萄糖转运吸收和提高生物量生长的方法，通过过表达外源或上调内源所述葡萄糖转运蛋白基因，可以在葡萄糖或者生物质水解液为碳源，培养工程菌，工程菌葡萄糖转运吸收能力增强，和/或生物量得到提高；

本发明还提供一种增强丝状真菌生物基化学品发酵能力的方法，其特征在于，在葡萄糖或者生物质水解液为碳源，培养发明第八方面所述的工程菌，工程菌有机酸或有机醇等生物基化学品发酵能力得到提高；

所述转运蛋白基因包括NCU10021（HGT-1）和NCU04963（HGT-2），敲除其中的任意基因，或突变任意一个转运蛋白的部分碱基，或是减弱任意一个转运蛋白的表达。

所述转运蛋白基因NCU10021的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2所示蛋白；所述转运蛋白基因NCU04963的核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列4所示蛋白。

具体的，该方法利用以下任一菌株：以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转运蛋白NCU10021基因的菌株；以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转运蛋白NCU04963基因的菌株；以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转运蛋白NCU10021和NCU04963基因的双突变体。

本发明提供的提高木质纤维素降解和纤维素酶、半纤维素酶表达的方法，是以微生物为出发菌株，敲除其中转运蛋白基因而得到，或将任意转运蛋白基因部分碱基突变而得到，或是减弱任意转运蛋白基因的表达而得到。所述微生物为脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）或侧孢霉（Sporotrichum）。所述敲除或部分碱基突变或减弱基因表达是针对转运蛋白基因NCU10021和NCU04963。

本发明方法的应用是广泛的，其为高效表达生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白质。其中：

生产纤维素酶的方法，是以木质纤维素、结晶纤维素、经过预处理的木质纤维素、纤维寡糖为诱导物，发酵所述的方法得到纤维素酶。

生产半纤维素酶的方法，是以木质纤维素、木聚糖、经过预处理的木质纤维素、阿拉伯糖、木寡糖、木糖为诱导物，发酵所述方法得到半纤维素酶。

生产其它蛋白的方法，包括将编码蛋白功能片段的基因导入所述受体菌中形成工程菌，再发酵该工程菌生产蛋白的过程。

因此，本发明还涉及这些转运蛋白基因在构建功能性工程菌中的应用。该应用是将编码蛋白功能片段的基因导入所述的出发菌株中形成的工程菌。

由此形成的高效表达蛋白的工程菌也属于本发明的技术内容。

本发明提供了一种分离的糖转运蛋白多肽，所述的多肽选自下组：

(a) 具有SEQ ID NO.: 4(HGT-2)、或2(HGT-1)中任一条所示氨基酸序列的多肽；

(b) 将SEQ ID NO.: 4、或2中任一条所述氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、具有戊糖和/或己糖转运活性的衍生多肽；

(c) 序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；

(d) 氨基酸序列与SEQ ID NO.: 4、或2中任意一条所述氨基酸序列的同源性≥85%(较佳地≥90%、更佳地≥95%、98%)，并具有戊糖和/或己糖转运活性的衍生多肽；

其中，所述的己糖转运活性是指将己糖自细胞外转运至细胞内。

在另一优选例中，(d)中所述的衍生多肽来源于以下一种或多种菌株：曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、毁丝霉(Myceliophthora)、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）。

在另一优选例中，所述的细胞为微生物细胞。

在另一优选例中，所述的多肽具有将己糖自细胞外转运至细胞内的活性。

在另一优选例中，所述的己糖包括葡萄糖。

在另一优选例中，序列如SEQ ID NO.: 4所示的多肽，具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性；和/或

序列如SEQ ID NO.: 2所示的多肽，具有将葡萄糖自细胞外转运至细胞内的活性。

本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：

(A)编码本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列；

(B)编码SEQ ID NO.: 4、或2中任一所示多肽的核苷酸序列；

(C)如SEQ ID NO.: 3、或1中任一所示的核苷酸序列；

(D)与(A)-(C)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述的载体含有本发明第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，和/或所述的宿主细胞的染色体整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核或原核细胞，优选为真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞表达一个或多个本发明第一方面所述的多肽。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母（Saccharomyces）属、克鲁维酵母菌属、梭状芽胞杆菌属、或丝状真菌。

在另一优选例中，所述的酵母属包括的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、摩纳酵母（Saccharomyces monacensis）、贝酵母（Saccharomyces bayanus）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、裂殖酵母（Saccharomyces pombe）；

所述克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）包括马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis），树干毕赤酵母（Pichia stipites）、休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis）；

所述梭状芽孢杆菌属（Clostridium sp.）包括梭热杆菌（Clostridium thermocellum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）、热乙酸菌（Moorella thermoacetica）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticu）或枯草杆菌（Bacillus subtilis）；

所述丝状真菌包括嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）。

本发明提供了将所述多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞用于将己糖自细胞外转运至细胞内。

本发明还提供了一种促进宿主细胞转运己糖的方法，包括步骤：在己糖的存在下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞。

在另一优选例中，当本发明第九方面所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.: 4所示的多肽时，所述的己糖为葡萄糖。

在另一优选例中，当本发明第九方面所述的宿主细胞表达SEQ ID NO.: 2所示的多肽时，所述的己糖为葡萄糖。

在另一优选例中，所述的出发菌株包括酿酒酵母，例如酿酒酵母BSW2AP、酿酒酵母EBY.VW4000，优选为酿酒酵母BSW2AP菌株

本专利的目的在于提供了两种新的糖转运蛋白，其具体核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下

a. 葡萄糖转运蛋白基因HGT-1(NCU10021，来源于粗糙脉胞孢霉，Neurospora crassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1 所示；

葡萄糖转运蛋白基因HGT-1(NCU10021，来源于粗糙脉胞孢霉，Neurospora crassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.2；

b. 木糖转运蛋白基因HGT-2 (NCU04963，来源于粗糙脉胞孢霉，Neurospora crassa)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3 所示；

木糖转运蛋白基因HGT-2 (NCU04963，来源于粗糙脉胞孢霉，Neurospora crassa)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.4

此外，还包含了与以上所述五个转运蛋白氨基酸残基序列全长或局部结构域同源度在75％以上的蛋白；该同源度在75％以上的蛋白来自于但不限于以下菌：曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、毁丝霉(Myceliophthora)、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、柄孢霉（Podospora anserina）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米赤霉（Gibberella zeae）等。

所应用的微生物包括但不限于以下菌：酵母属（Saccharomyces sp.）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、摩纳酵母（Saccharomyces monacensis）、贝酵母（Saccharomyces bayanus）、巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、裂殖酵母（Saccharomyces pombe），克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces sp.）的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis），树干毕赤酵母（Pichia stipites）、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）、休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）、（Clostridium phytofermentans）、梭热杆菌（Clostridium thermocellum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum ）、热乙酸菌（Moorella thermoacetica）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticu）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）。

另一方面，本发明还提供一种使微生物获得或提高对葡萄糖利用的方法，是将上述转运蛋白导入微生物细胞（如上述所列）中，所得微生物工程菌株可以将葡萄糖从微生物胞外转运至胞内，从而提高微生物对葡萄糖的利用效率和相应发酵生产生物基产品的能力。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：WT、NCU10021（△HGT-1）、NCU04963（△HGT-2）突变体在2%微晶纤维素（Avicel）上培养7天的产酶动力曲线。

图2：WT、NCU10021与NCU04963双突变体（△2HGT）在2%微晶纤维素（Avicel）上培养7天的产酶动力曲线。

图3：WT、NCU10021与NCU04963双突变体（△2HGT）在2%微晶纤维素（Avicel）上培养5天和7天的纤维素内切酶酶活和木聚糖酶酶活分析。

图4：WT、NCU10021与NCU04963双突变体（△2HGT）在2%微晶纤维素（Avicel）培养基上培养5天和7天后，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。

图5：HGT-1转运蛋白在酿酒酵母中的绿色荧光定位图。

图6：HGT-1对葡萄糖的同位素转运的测定。

图7：含有HGT-1的酿酒酵母EHGT-1在葡萄糖平板上的生长。

图8：HGT-2转运蛋白在酿酒酵母中的绿色荧光定位图。

图9：HGT-2对葡萄糖的同位素转运的测定。

图10：含有HGT-2的酿酒酵母EHGT-2在葡萄糖平板上的生长。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，丝状真菌中存在一系列与纤维素降解调控相关的转运蛋白。实验证明，当这些转运蛋白的表达降低或不表达时，丝状真菌中的纤维素酶或半纤维素酶的表达量会上升，从而能够提高菌株对木质纤维素的利用，并增强木质纤维素的降解。同时本发明蛋白可以使酵母等微生物以葡萄糖为碳源进行生长。在此基础上，完成了本发明。

葡萄糖转运蛋白

如本文所用，术语“葡萄糖转运蛋白”、“本发明转运蛋白”、“本发明转运蛋白”均指在丝状真菌中属于膜蛋白具有调控(半)纤维素酶表达或活性从而与纤维素降解相关的蛋白或其编码基因。

实验证明，当敲除或下调了本发明转运蛋白后，能够有效地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达，并进一步提高丝状真菌对木质纤维素的利用从而加强其降解。

优选地，本发明转运蛋白指的是在脉胞菌中的葡萄糖转运蛋白，例如，如SEQ ID NO.: 2、或4所示序列的一种或多种。编码这些转运蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.: 1、或3所示。

此外，本发明转运蛋白还包括来自多种丝状真菌转运蛋白。例如，所述的丝状真菌包括曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或毁丝酶。在这些丝状真菌的转运蛋白中，可以找到与本发明SEQ ID NO.: 2、或4所示序列具有一定同源性的转运蛋白。本发明人通过筛选发现，在这些丝状真菌中，具有以下NCBI参考序列号的转运蛋白与纤维素的降解相关：XP_001395794.2、XP_001396930.1、ACA66265.1、CAC80843.1、CAJ44796.1、XP_001822181.1、XP_001817192.1、XP_747770.1、XP_746376.1(曲霉)；KUM58567.1、KUM55954.1、XP_002561741.1、EPS26451.1(青霉)；XP_006964877.1、XP_006966515.1(木霉)；EYB25402.1、XP_382817.1(镰刀霉)；XP_003664932.1、XP_003658874.1(毁丝酶)。

优选地，这些转运蛋白中与本发明SEQ ID NO.: 2、或4所示序列同源性大于50%，较佳地大于60%，更佳地大于65%的转运蛋白与纤维素降解有密切的相关性。

同时，本领域技术人员可以根据本发明教导在其他丝状真菌中找到同源性较高的葡萄糖转运蛋白。

此外，本发明人还通过实验发现，当单个敲除或多个敲除所述的转运蛋白后，均能够有效地使(半)纤维素酶活性增加，而不影响菌株的正常生长。

纤维素、纤维素酶、半纤维素酶

纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，其可以分泌多种纤维素水解酶。

纤维素酶是一种多酶体系，由多种组份组成。按底物特异性可将纤维素酶分为以下组分：（1）外切β-1,4-葡萄糖酶（exo-beta-1,4-glucanase，EC.3.2.1.91）简称为外切酶，又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase）。纤维二糖水解酶可以水解纤维素结晶区，从纤维素链的非还原端/还原端开始水解并释放纤维二糖。（2）内切β-1,4-葡聚糖酶（endo-beta-1,4-glucanase，EC3.2.1.74）简称内切酶。纤维素内切酶能够在纤维素多糖链上无定形部分随机切断糖苷键，产生新的糖链末端和长度不一的纤维寡糖。（3）β-1,4-葡萄糖苷酶（beta-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21）简称纤维二糖酶。纤维二糖水解酶水解可溶性的纤维糊精和纤维二糖生成葡萄糖。（4）其它组分，除了以上三大组分外还有纤维二糖脱氢酶、纤维二糖醌氧化还原酶、磷酸化酶、纤维素酶小体等都会参与纤维素降解过程。

半纤维素具有与纤维素一样的负责结构，其降解需要多种半纤维素酶的共同作用。其中主要有两种：β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者从半纤维素主链内部作用于木糖苷键，分解成低聚木糖，后者作用于低聚木糖的末端，释放出单糖。除此之外，降解半纤维素还需要多种侧链裂解酶的共同作用，主要有乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶等。

糖转运

如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明多肽及其衍生多肽”、“本发明转运蛋白”、“己糖转运蛋白”、“SEQ ID NO.: 4、或2所示多肽”，均指具有将己糖自细胞外向细胞内转运活性的HGT-2(SEQ ID NO.: 4)、或HGT-1(SEQ ID NO.: 2)所示的多肽及其衍生多肽。

如本文所用，术语“己糖”指的是含有6个碳原子的糖类，通常，所述的己糖包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。优选地，所述的己糖为葡萄糖等可用于微生物发酵的六碳糖。

工程菌

本发明“工程菌”、“突变体”可互换使用，均是指将出发菌株中纤维素降解相关转运蛋白敲除或下调后获得的具有(增强的)降解纤维素活性的工程菌株。其中，本发明工程菌在改造后，不表达或基本不表达纤维素降解相关转运蛋白。

本领域技术人员应理解，当获得了转运蛋白的序列后，可以通过多种常规技术使某出发菌株中的转运蛋白的表达下调或沉默。通常，可采用同源重组的方法，采用某标记(或抗性)基因置换出发菌株的原始编码列。

当然，还可以采用能够抑制纤维素降解相关主运蛋白表达和/或活性的其他基因工程手段或物质对该蛋白进行敲除或下调，从而获得新的转基因工程菌。这一类物质被称为“纤维素降解相关转运蛋白或其基因的抑制剂”或“本发明抑制剂”。例如，所述的抑制剂包括纤维素降解相关转运蛋白的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA 以及转运蛋白的活性抑制剂。

同样，在获得了本发明转运蛋白的序列或其编码核苷酸后，本领域技术人员可以根据常规技术手段设计、合成、鉴定并验证这些抑制剂及其效果。应理解，这些抑制剂可以是完全抑制本发明转运蛋白的表达和/或活性，也可以是部分抑制，从而获得(半)纤维素酶活性增强的本发明工程菌。

应用

通过抑制本发明转运蛋白，可以人为地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达量和/或活性，从而增加菌株对纤维素(尤其是木质纤维素)的利用。

例如，当获得了本发明的工程菌后，可以通过加入纤维素原料的诱导，对所述的工程菌进行培养。此时，所述的菌株会分泌纤维素酶和半纤维素酶，对其进行分离并提纯后，就可以获得较纯的纤维素酶和半纤维素酶。

由于产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中，纤维素原料受其降解，形成降解产物。因此当进一步对培养物进行分离时，就可以获得纤维素的多种降解产物，例如多种单体化合物：葡萄糖、木糖等。

用时利用编码本发明转运蛋白的多核苷酸可以制备一种新的重组菌株，所述的菌株可以利用原先具有或不具有己糖转运能力的出发菌株，通过导入本发明载体，赋予出发菌株新的或更强己糖转运能力，从而提高碳源的利用率。

本发明有益效果

本发明通过改造丝状真菌在纤维素降解的调控因子和糖转运原件，增强了丝状真菌对纤维素的利用，提高了生物质降解，增强戊糖利用，提高工程菌种发酵生产纤维素酶和以葡萄糖和生物质及其衍生糖为原料发酵生产各类产品的能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明所采用的原始出发菌株商购于美国真菌菌种保存库（FGSC），其余所用材料均为商购。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

本发明中，纤维素、葡萄糖购自sigma试剂公司；

同位素标记的葡萄糖均购自美国Radiolabeled化工有限公司。

实施例 1 工程菌的获得

可采用常规技术对出发菌株中的转运蛋白进行敲除。

以粗糙脉胞菌出发菌株(FGSC2489)(购自FGSC)为例，根据同源重组的原理，利用hph基因（潮霉素B抗性基因）置换NCU10021的整个开放阅读框（open reading frame，ORF）。

1）设计同源臂特异性引物

上游同源臂特异性引物:

NCU10021-5f:GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCCACCCCAGACCCAGCACT (SEQ ID NO.: 5);

NCU10021-5r:ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACACATGGTGTTTGTTGTGACTCTTGTGT (SEQ ID NO.: 6)

下游同源臂特异性引物:

NCU10021-3f:CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACAGCTGCATATTTTGAGCTCCTCGTG (SEQ ID NO.: 7);

NCU10021-3r:GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCGCACACGTCCGCACTTCCT (SEQ ID NO.: 8)

扩增目标基因上下游同源臂；然后利用引物从质粒pCSN44中扩增hph抗性元件。将上述扩增所得3个片段利用酵母组装的方法连接至pRS426中。引物如下所示

hph-F：GTCGGAGACAGAAGATGATATTGAAGGAGC(SEQ ID NO.: 9)

hph-R：GTTGGAGATTTCAGTAACGTTAAGTGGAT(SEQ ID NO.: 10)

2）将上述所获得质粒作为模板，用SEQ ID NO.: 5、8所示的引物扩增NCU10021敲除元件，凝胶纯化PCR产物。

3）将上述PCR产物10µg电击转化至野生型菌株（FGSC2489，A），通过含有潮霉素的平板筛选阳性转化子。

4）提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物扩增，其中hphDC是验证基因敲除的通用引物，如果可以扩增得到目的片段，则说明这些转化子发生了预期的同源重组。引物如下所示：

NCU10021DC：CGCACACGTCCGCACTTCCT(SEQ ID NO.: 11)

hphDC：TGCAATAGGTCAGGCTCT(SEQ ID NO.: 12)

5）将所获得的转化子与野生型菌株杂交（FGSC4200，a），将杂交得到的子囊孢子热激（60℃, 45min）后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利用PCR进行鉴定。

其余工程菌株均根据类似方法获得，所需的引物如表1所示：

表1

引物	SEQ ID NO.:	序列
			NCU04963-5f:	13	GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTAGCTACCTACCTCGAGACG
NCU04963-5r:	14	ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACTGTAGTACAGGAGGCTTTGC
			NCU04963-3f:	15	CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACAGCTGCCCATCTAAAGGAACAGTCG
NCU04963-3r:	16	GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCGACACAGTTCGAATAGCAGC
			NCU04963DC:	17	GACACAGTTCGAATAGCAGC

实施例 2 工程菌的验证

提基因组DNA：采用酚氯仿法从孢子中提取提基因组DNA

1) RCR采用25μL体系，包括12.5μLDreamTaq PCR Master Mix 12.5μL，9.5 μL水（nuclease-free），上下游引物各1μL，基因组DNA1μL。

2) 按如下条件进行PCR扩增95度预变性5分钟，94度变性30秒，52度退火45秒，72度延伸2分钟，按同样条件进行34个循环，最后72度退火10分钟。

3）110V电压，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，凝胶成像系统下看基因扩增条带。

4)保菌：30%甘油保菌后放于-80℃冰箱保种。

实施例 3 单基因敲除的突变体生长纤维素、半纤维素产量测定

利用实施例1的方法、实施例2的鉴定，构建了如下菌株并对其进行产酶动力学测定：

以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转运蛋白基因NCU10021（HGT-1）；

以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转运蛋白基因NCU04963（HGT-2）。

转运蛋白工程菌和野生型粗糙脉孢菌分别在2%结晶纤维素培养基上培养7天，每天取培养基上清，离心后进行一系列验证试验。

方法：

总的产酶测定

取20μL上清液，加入1mLBradford蛋白显色溶液，室温下反应5min，在595nm处测定吸光值。标准曲线用小牛血清蛋白作为标准蛋白样绘制。

结果：

在2%结晶纤维素条件下培养5天和7天，突变株NCU10021培养基上清液中的产酶水平分别提高了40%和53%（图1）。

在2%结晶纤维素条件下培养5天和7天，突变株NCU4963培养基上清液中的产酶水平分别提高了48%和35%（图1）。

实施例 4 双基因敲除的突变体生长活性研究以及酶活性测定

利用实施例1的方法、实施例2的鉴定、实施例3的产酶测定，构建了NCU10021和NCU4963双缺菌株（△2HGT）并进行了产酶测试。

方法：

4.1.1 酶活测定

（1）内切-1,4-β-葡聚糖酶活力的测定方法：将粗酶液用0.1 M醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.5 mL，放入40℃水浴锅内预热，取出，加入0.5 mL Megazyme AZO-CM-CELLULOSE底物溶液，混匀，40℃温育10 min，用2.5 mL沉淀溶液终止反应，室温静置10 min，混匀，1000 g离心10 min，590 nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。

（2）内切-1,4-β-木聚糖酶活力的测定方法：将粗酶液用0.1 M醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.5 mL，放入40℃水浴锅内预热，取出，加入0.5 mL Megazyme AZO-XYLAN底物溶液，混匀，40℃温育10 min，用2.5 mL沉淀溶液终止反应，室温静置10 min，混匀，1000 g离心10 min，590 nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。

（4）活性定义：1 mL 酶液于40℃下，每min水解底物产生1 μmol产物的酶量定义为1个酶活力单位。

蛋白质 SDS-PAGE 实验

在2%结晶纤维素Avicel培养7天后，离心得到培养基上清液，上样，做蛋白质电泳。

结果：

转运蛋白对纤维素酶、半纤维素酶表达水平的影响

在2%结晶纤维素条件下培养5天，双缺突变株△2HGT培养基上清液中的酶产量比野生型提高了180%（图2）、纤维素内切酶活力提高了260%（图3）、木聚糖酶活提高了190%（图3）。蛋白胶图显示与以上数据吻合（图4）。

在2%结晶纤维素条件下培养5天，双缺突变株△2HGT培养基上清液中的酶产量比野生型提高了180%（图2）、纤维素内切酶活力提高了230%（图3）、木聚糖酶活提高了180%（图3）。蛋白胶图显示与以上数据吻合（图4）。

以上结果显示，以脉孢菌（Neurospora）为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转运蛋白基因NCU10021和NCU04963，以及两者同时被部分碱基突变或敲除或减弱表达，能显著提升细胞降解纤维素的能力和产纤维素、半纤维素酶的水平。

实施例 5 HGT-1 是葡萄糖转运蛋白，使微生物获得转运和利用葡萄糖能力

一、HGT-1基因表达载体的构建

利用引物HGT-1-F（序列：5’- CGGACTAGTATGTCGTCCGCCCACGAG -3’）(SEQ ID NO.: 18)和HGT-1-R（序列：5’- CCGGAATTCAACCTGCTTCTCAGCAG -3’） (SEQ ID NO.: 19)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增HGT-1基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10µL，10mM dNTPs 1µL，HGT-1-F 2.5µL，HGT-1-R 2.5µL，cDNA 1µL，Phusion DNA polymerase 0.5µL，水32.5µL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 1.5min,35个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶SpeI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献（Galazka, J.M., et al., 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.）]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明HGT-1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带HGT-1基因的重组表达质粒，命名为pRS426-HGT-1。将质粒pRS426-HGT-1和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000（Wieczorke, R., et al., 1999. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 464, 123-128.）中，分别命名为EHGT-1和EpRS426，如图5所示。

二、HGT-1对葡萄糖的转运的测定

1、分别挑取EHGT-1和对照菌株E426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基（配方：无氨基酵母氮源 6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖 20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L）中30℃培养过夜（10-12小时）至菌体浓度为1.5-2.0 （OD600）；

2、离心收集菌体（4000rpm,5min）后，用冰预冷assay buffer （100mM Tris-Citrate buffer pH 5.0）洗三次，重悬至OD600为20；

3、将菌体分装至1.5mL离心管（100uL/管）中，其中三个用于烘干称其干重，其余置于冰上，以备使用。

4、反应前将菌体于30摄氏度，放置5min。

5、100uL细胞悬液加入50uL不同浓度同位素标记的葡萄糖溶液(糖浓度： 500μM，100μM，20μM，5μM，1μM)，反应120s后加入1mL冰水终止反应，

6、10000rpm离心1min来收集细胞，冰水洗涤两次，离心，去上清。

7、用500mL，0.1mM NaOH重选菌体，转移至装有3mL Ultima Gold scintillatioin fluid小瓶中，测定其放射量，并计算单位细胞干重单位时间的转运量。

最终结果图6所示。酿酒酵母EBY.VW4000缺失17个己糖转运蛋白和3个麦芽糖/葡萄糖转运蛋白，而失去了转运葡萄糖的能力。由于HGT-1的导入，重组酵母EHGT-1恢复了对葡萄糖的转运能力，其中如图6，HGT-1对葡萄糖的亲和力Km为16.13 ± 0.95 μM，最大转运速率为26.42 ± 0.38 μmol/h/gram DCW。

三、HGT-1使微生物具有利用葡萄糖的能力

1、分别挑取EHGT-1和对照菌株EpRS426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基（配方：无氨基酵母氮源 6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖 20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L）中30℃培养过夜（10-12小时）至菌体浓度为1.5-2.0；

2、离心收集菌体（4000rpm,5min）后，用冰预冷双蒸水洗三次，重悬至OD600为0.3；

3、等梯度稀释菌夜（10⁰,10^-1,10^-2）；

4、将等梯度稀释的酵母点在以2％麦芽糖为碳源的SC-URA平板中（配方：无氨基酵母氮源 6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖 20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L，2%琼脂），置于30℃培养箱中培养。

结果如图7所示,相比对照菌株（EpRS426），重组酵母（EHGT-1）快速利用葡萄糖的能力。说明HGT-1的导入，酿酒酵母恢复了以葡萄糖为碳源进行生长的能力。

综合所述，HGT-1对葡萄糖具有良好的转运能力（26.42 ± 0.38 μmol/h/gram DCW）和极高的亲和性（Km为16.13 ± 0.95 μM），并且HGT-1导入酿酒酵母后，可使其恢复利用葡萄糖为碳源的能力。

实施例 6 HGT-2 是葡萄糖转运蛋白，使微生物获得转运和利用葡萄糖生长及乙醇发酵能力

一、HGT-2基因表达载体的构建

利用引物HGT-2-F（序列：5’- GGACTAGTATGGGCTTGTCACTCAAGAAG -3’）(SEQ ID NO.: 20)和HGT-2-R（序列：5’- CCGGAATTCAGCTGCCTCTTCAGTGATATC -3’） (SEQ ID NO.: 21)从粗糙脉孢菌的cDNA中PCR扩增HGT-2基因的编码阅读框，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10µL，10mM dNTPs 1µL，HGT-2-F 2.5µL，HGT-2-R 2.5µL，cDNA 1µL，Phusion DNA polymerase 0.5µL，水32.5µL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 1.5min,35个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶SpeI和EcoRI将PCR产物和质粒pRS426-PGK1[该质粒构建根据参考文献（Galazka, J.M., et al., 2010. Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science. 330, 84-86.）]，进行双酶切，并将两种双酶切产物进行连接，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，再进行测序，测序结果表明HGT-2基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，表明获得了序列及插入位置正确的携带HGT-2基因的重组表达质粒，命名为pRS426-HGT-2。将质粒pRS426-HGT-2和pRS426-PGK1转入酿酒酵母EBY.VW4000（Wieczorke, R., et al., 1999. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 464, 123-128.）中，分别命名为EHGT-2和EpRS426，如图8所示。

二、HGT-2对葡萄糖的转运的测定

1、分别挑取EHGT-2和对照菌株EpRS426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基（配方：无氨基酵母氮源 6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖 20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L）中30℃培养过夜（10-12小时）至菌体浓度为1.5-2.0 （OD600）；

4、反应前将菌体于30摄氏度，放置5min。

5、100uL细胞悬液加入50uL不同浓度同位素标记的葡萄糖溶液(糖浓度：2000μM, 500μM，100μM，20μM，5μM，1μM)，反应120s后加入1mL冰水终止反应，

最终结果如图9所示。酿酒酵母EBY.VW4000缺失17个己糖转运蛋白和3个麦芽糖/葡萄糖转运蛋白，而失去了转运葡萄糖的能力。由于HGT-2的导入，重组酵母EHGT-2恢复了对葡萄糖的转运能力，其中如图9，HGT-2对葡萄糖的亲和力Km为98.97 ± 22.02 μM，最大转运速率为78.11 ± 4.46 μmol/h/gram DCW。

三、HGT-2使微生物具有利用葡萄糖的能力

1、分别挑取EHGT-2和对照菌株EpRS426单克隆，将其接种在10mL以2％麦芽糖为碳源的SC-URA培养基（配方：无氨基酵母氮源 6.7g/L，酵母合成缺失培养基补充物1.4g/L，麦芽糖 20g/L，亮氨酸，组氨酸和色氨酸各20mg/L）中30℃培养过夜（10-12小时）至菌体浓度为1.5-2.0；

3、等梯度稀释菌夜（10⁰,10^-1,10^-2）；

结果如图10所示,相比对照菌株（EpRS426），重组酵母（EHGT-2）快速利用葡萄糖的能力。说明HGT-2的导入，酿酒酵母恢复了以葡萄糖为碳源进行生长的能力。

对该工程酵母进行乙醇发酵试验，对照菌不能利用乙醇发酵，发酵4天后，工程菌乙醇发酵浓度达到5克/升，显著提高了工程菌乙醇发酵能力；

综合所述，HGT-2对葡萄糖具有良好的转运能力（78.11 ± 4.46 μmol/h/gram DCW）和较高的亲和性（Km为98.97 ± 22.02 μM），并且HGT-2导入酿酒酵母后，可使其恢复利用葡萄糖为碳源的能力。

实施例 7 通过协同表达 HGT-2, 可以提高嗜热毁丝霉苹果酸发酵能力

1、HGT-2过表达载体（pAN52-hgt）的构建

以粗糙脉孢菌FGSC#2489（购自真菌遗传保藏中心，Fungal Genetics Stock Center）葡萄糖条件下的cDNA为模板，利用PCR扩增出葡萄糖转运蛋白编码基因hgt-2（NCU04963，序列SEQ ID NO.: 3）。引物如下：

HGT-F：(SEQ ID NO.: 22)

CGGACTAGTATGGGCTTGTCACTCAAGAAG

HGT-R：(SEQ ID NO.: 23)

CGCGGATCCTCAAGCTGCCTCTTCAGTG

用SpeI和EcoRI酶切后，连入用同样酶双酶切的线性化质粒pAN52-TB-MtPgpdA中，从而得到HGT-2表达载体，命名为：pAN52-hgt。

2、将表达载体（pAN52-hgt）导入嗜热毁丝霉

2.1 将嗜热毁丝霉JG207菌株在MM斜面培养基[50×Vogel’s 盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，组氨酸（50mg/mL）20mL，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s 盐（1L）：柠檬酸三钠（1/2H₂O）150g，无水KH₂PO₄ 250g，无水NH₄NO₃ 100g，MgSO₄7H₂O 10g，CaCl₂2H₂O 5g，微量元素盐溶液5mL，生物素（0.1mg/mL）2.5mL，定容体积到1L] 上45℃培养10天后待用。

2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化

1）菌丝体准备

将成熟的嗜热毁丝霉孢子，用0.05%吐温-80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的MM平板，45℃培养14h。

2）原生质体制备

将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液（配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A：1.0361g 磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100mL，高温灭菌）中，28℃裂解2h，每隔20min轻轻摇动。

而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃ 离心10min，弃上清，加入4mL溶液B（0.735 g氯化钙，18.22 g山梨醇，1mL Tris-HCl 1M pH 7.5，溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100mL，高温灭菌），2000rpm 4℃ 离心10min；弃上清，按200μL/质粒加入一定体积溶液B。

3）原生质体转化

预冷的15mL离心管中，依次加入50μL 预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500μL Tris HCl 1M pH 7.5。)，10μL用HindIII线性化的质粒pAN52-hgt，200μL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG溶液，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素MM培养基中，置于平板中，45℃培养，2d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长

2.3 嗜热毁丝霉转化子验证

1）基因组提取

采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：

1）2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液（lysis buffer，配方：0.2M TrisHCl (pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％ SDS (w/v)），挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于DNA提取管中。

2）将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。

3）65℃水浴30min，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。

4）水浴结束后取出，每管加入80μL pH 7.5的1M的TrisHCl中和。

5)加入400μL的酚:氯仿（1:1），13000rpm离心5分钟。

6）取300μL上清液于新的1.5mL EP管中，加入600μL 95％的乙醇（DNA级）。

7）冰上孵育一小时，随后4℃，13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。

8）用75％的酒精（DNA级）400μL清洗，4度13000rpm离心，轻轻取出上清液。

9）将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。

10）加入50μL ddH₂O溶解DNA，用NanoDrop测DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

2) PCR验证嗜热毁丝霉转化子

以提取的转化子基因组DNA为模版，用引物HGT-F及HGT-R对转化子进行基因PCR 验证。PCR反应体系为：5×phusion GC buffer 4μL，10mM dNTPs 0.2μL，引物各1μL，基因组 1μL，DMSO 0.6μL，Phusion DNA polymerase 0.1μL，去离子水12.1μL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，62℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。

3）对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110V 电压，30 分钟），在凝胶成像系统下观察基因扩增条带，结果表明经HindIII线性化的pAN52-hgt已整合到了嗜热毁丝霉基因组中。

3、嗜热毁丝霉转化子生产苹果酸能力测定

将上述验证的转化子全部接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源培养基中（配方：碳源 75g/L，蛋白胨6.0 g/L，0.15 g/L KH₂PO₄，0.15 g/L K₂HPO₄，0.10 g/L CaCl₂2H₂O，0.10 g/L MgSO₄7H₂O，碳酸钙80.0 g/L，1mL/L 0.5g/L生物素，1 ml/L 微量元素液；微量元素配方（100 mL）：5g C₆H₈O7H₂O，5g ZnSO₄7H₂O，1g Fe(NH₄)₂(SO₄)6H₂O，0.25g CuSO₄5H₂O，0.05g MnSO₄H₂O，0.05g H₃BO₃，0.05g NaMoO₄2H₂O，溶于水中，定容至100 mL），接种量为2.5*10⁵个/mL，45℃条件下150rpm培养，第六天取样测定苹果酸含量。

1）样品处理：

取1mL发酵液于15mL离心管中，并添加1mL 1M H₂SO4，而后80℃下放置30min，每个隔10min进行充分震荡。之后将2mL双蒸水添加至离心管中，充分震荡后，取1mL液体于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清液测定C4-二羧酸含量。

2）苹果酸含量测定

处理后的样品用高效液相色谱测定苹果酸含量，其中检测器为紫外检测器，流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.5mL/min。结果显示第六天时转化子的苹果酸产量与对照菌株JG207相比提高20%。实验说明hgt-2在嗜热毁丝霉中过表达时，能显著促进嗜热毁丝霉利用葡萄糖进行苹果酸发酵。

另外，降低嗜热毁丝霉内源HGT1/2同源基因表达，也有利于苹果酸合成，发酵水平可提高10%。

实施例 8 通过协同表达 HGT1/HGT-2 是葡萄糖转运蛋白，可以提高微生物发酵柠檬酸能力；

柠檬酸发酵培养基：玉米粉200g/L、CaCl₂ 1g/L、淀粉酶20000U/L。

培养基液化过程：玉米粉与水以1:4的比例混合，加入CaCl₂混匀。调节pH至6-6.5。加入耐高温淀粉酶，加热到70度保温1h。迅速加热到90度，保温45-60min。玉米粉与上清液分层，加热煮沸5-10min，用6层纱布过滤去渣滓。

用生理盐水洗下孢子，并用血球计数板计数，接种至培养基中，终浓度为5×10⁴/mL。每隔24小时检测糖消耗情况和柠檬酸产量。

还原糖采用SDG-IV型全自动还原糖测定仪进行测定，总糖可以先用酸水解成还原糖后再测定。总糖的处理方法：取1mL发酵液上清，向其中加入6M盐酸5mL，蒸馏水4mL，在沸水中加热30分钟，取1-2滴置于白瓷盘上，加1滴I-KI溶液检测是否完全水解。如已经水解完全，则不呈现蓝色。水解完毕后，冷却至室温，加入酚酞作为指示剂，用6M氢氧化钠中和至微红色，最后定容至20mL。

有机酸的测定方法：采用高效液相色谱法，发酵液上清稀释10倍，煮沸变性后，高速离心10分钟，取上清。检测条件：柱温为35度，流动相5mM硫酸，流速0.5mL/min，进样量20μL。

将粗糙脉孢菌HGT1/HGT-2在黑曲霉和嗜热毁丝霉中表达,可以提高柠檬酸发酵能力。黑曲霉工程菌比出发菌柠檬酸发酵水平提高了30%以上，糖利用加快了20%以上;嗜热毁丝霉工程菌柠檬酸发酵水平和糖利用速率相比出发菌都提高了20%以上；

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种提高丝状真菌木质纤维素酶系表达及生物基化学品生产的方法

<130> P2016-0325

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1662

<212> DNA

<213> 粗糙脉胞孢霉（Neurospora crassa）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1662)

<223> HGT-1

<400> 1

atgtcgtccg cccacgagaa ggagacggct cctacagcag cccacattgg gctcgctcac 60

acccaagatg tcgaacgcat cgaagccccc gtcacatgga aggcctacct catttgcgcc 120

ttcgcctcat tcggtggtat cttcttcggt tatgactccg gttatatcaa cggcgttctc 180

ggctcgcaga tcttcatcga tgccgtcgaa ggcacctccc ccgtccgcga tgcgctttct 240

gaatcccacc agtccctcgt cgtctctatc ctgtcctgcg gtaccttctt tggcgccctc 300

attgccggtg atctcgccga catgatcggc cgcaagtgga ccgtcattct cggctgtctc 360

atctacctga ttggttgcgt gatccagatg atcactggtc ttggtgatgc tctcggtgct 420

atcgttgctg gccgtcttat tgctggtatc ggtgtgggtt tcgagtccgc cgtcgtcatt 480

ctgtacatgt ctgagatttg ccctcgcaag gtccgtggtg ccttggtcgc cggttaccaa 540

ttctgcatca ccatcggtct tatgcttgct tcttgcgtcg tctacgcaac tcaggacagg 600

ccggataccg gtgcttaccg tattcctatc gccatccagt tcatctgggc tctcatcctt 660

gccggtggtc tcatgtgtct tcccgactct ccccggtact tcgtcaagaa gggtaacctc 720

gctgctgcta ccagctctct gtcccgtctt cgtggccagg accccaactc cgagtacatc 780

caggtcgagc ttgctgagat cgtcgccaac gaggagtacg agcgtcagct tattccctcc 840

accacctggt tcggctcctg ggccaactgc ttcaagggtt ctctctggaa ggccaactcc 900

aacctccgca agactattct tggtacctct cttcagatga tgcagcaatg gaccggtgtc 960

aacttcatct tctactactc cacccctttc cttaagtcta ccggtgccat ctccaacacc 1020

ttcttgatct ccatggtctt caccatcatc aacgtcttct ccactcccat ctccttctgg 1080

acggtcgagc gcttcggccg ccgcactatc ctcttctggg gtgccctcgg catgctcatc 1140

tgccagttcc tcgtcgccat tatcggtgtc accgtcggct tcaacaagac ccacatgggc 1200

cccgacggcg agtccatggc caacaatgtc agcgccgtaa acgcccagat tgccttcatc 1260

gccatcttta tcttcttctt cgcctccacc tggggtcctg gtgcttggat cttgattggc 1320

gagatcttcc ctcttcccat ccgttcgcgc ggtgttggtc tgtccactgc ctccaactgg 1380

ctctggaaca ccatcatcgc cgtcatcacc ccttacatgg ttggcgagca gcgcggcaac 1440

cttaaatcgt ccgtcttctt cgtctggggc ggtctttgca cctgtgcctt catctacact 1500

tacttcctcg tgcctgagac caagggactc tcgctcgagc aggtcgacaa gatgatggag 1560

gagacgaccc ccaggacttc ggccaagtgg aagcctcgca ccacctttgc ccacgcggct 1620

gaggatggta tgctcaacgt acctgctgag aagcaggttt aa 1662

<210> 2

<211> 553

<212> PRT

<213> 粗糙脉胞孢霉（Neurospora crassa）

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(553)

<223> HGT-1

<400> 2

Met Ser Ser Ala His Glu Lys Glu Thr Ala Pro Thr Ala Ala His Ile

1 5 10 15

Gly Leu Ala His Thr Gln Asp Val Glu Arg Ile Glu Ala Pro Val Thr

20 25 30

Trp Lys Ala Tyr Leu Ile Cys Ala Phe Ala Ser Phe Gly Gly Ile Phe

35 40 45

Phe Gly Tyr Asp Ser Gly Tyr Ile Asn Gly Val Leu Gly Ser Gln Ile

50 55 60

Phe Ile Asp Ala Val Glu Gly Thr Ser Pro Val Arg Asp Ala Leu Ser

65 70 75 80

Glu Ser His Gln Ser Leu Val Val Ser Ile Leu Ser Cys Gly Thr Phe

85 90 95

Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asp Leu Ala Asp Met Ile Gly Arg Lys

100 105 110

Trp Thr Val Ile Leu Gly Cys Leu Ile Tyr Leu Ile Gly Cys Val Ile

115 120 125

Gln Met Ile Thr Gly Leu Gly Asp Ala Leu Gly Ala Ile Val Ala Gly

130 135 140

Arg Leu Ile Ala Gly Ile Gly Val Gly Phe Glu Ser Ala Val Val Ile

145 150 155 160

Leu Tyr Met Ser Glu Ile Cys Pro Arg Lys Val Arg Gly Ala Leu Val

165 170 175

Ala Gly Tyr Gln Phe Cys Ile Thr Ile Gly Leu Met Leu Ala Ser Cys

180 185 190

Val Val Tyr Ala Thr Gln Asp Arg Pro Asp Thr Gly Ala Tyr Arg Ile

195 200 205

Pro Ile Ala Ile Gln Phe Ile Trp Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Leu

210 215 220

Met Cys Leu Pro Asp Ser Pro Arg Tyr Phe Val Lys Lys Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ala Ala Ala Thr Ser Ser Leu Ser Arg Leu Arg Gly Gln Asp Pro Asn

245 250 255

Ser Glu Tyr Ile Gln Val Glu Leu Ala Glu Ile Val Ala Asn Glu Glu

260 265 270

Tyr Glu Arg Gln Leu Ile Pro Ser Thr Thr Trp Phe Gly Ser Trp Ala

275 280 285

Asn Cys Phe Lys Gly Ser Leu Trp Lys Ala Asn Ser Asn Leu Arg Lys

290 295 300

Thr Ile Leu Gly Thr Ser Leu Gln Met Met Gln Gln Trp Thr Gly Val

305 310 315 320

Asn Phe Ile Phe Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Leu Lys Ser Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Ser Asn Thr Phe Leu Ile Ser Met Val Phe Thr Ile Ile Asn Val

340 345 350

Phe Ser Thr Pro Ile Ser Phe Trp Thr Val Glu Arg Phe Gly Arg Arg

355 360 365

Thr Ile Leu Phe Trp Gly Ala Leu Gly Met Leu Ile Cys Gln Phe Leu

370 375 380

Val Ala Ile Ile Gly Val Thr Val Gly Phe Asn Lys Thr His Met Gly

385 390 395 400

Pro Asp Gly Glu Ser Met Ala Asn Asn Val Ser Ala Val Asn Ala Gln

405 410 415

Ile Ala Phe Ile Ala Ile Phe Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Gly

420 425 430

Pro Gly Ala Trp Ile Leu Ile Gly Glu Ile Phe Pro Leu Pro Ile Arg

435 440 445

Ser Arg Gly Val Gly Leu Ser Thr Ala Ser Asn Trp Leu Trp Asn Thr

450 455 460

Ile Ile Ala Val Ile Thr Pro Tyr Met Val Gly Glu Gln Arg Gly Asn

465 470 475 480

Leu Lys Ser Ser Val Phe Phe Val Trp Gly Gly Leu Cys Thr Cys Ala

485 490 495

Phe Ile Tyr Thr Tyr Phe Leu Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu

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Glu Gln Val Asp Lys Met Met Glu Glu Thr Thr Pro Arg Thr Ser Ala

515 520 525

Lys Trp Lys Pro Arg Thr Thr Phe Ala His Ala Ala Glu Asp Gly Met

530 535 540

Leu Asn Val Pro Ala Glu Lys Gln Val

545 550

<210> 3

<211> 1584

<212> DNA

<213> 粗糙脉胞孢霉（Neurospora crassa）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1584)

<223> HGT-2

<400> 3

atgggcttgt cactcaagaa gcctgaaggt gtgccgggca agtcatggcc cgccattgtc 60

attggcttgt ttgtcgcctt tggtggtgta ctctttgggt atgacactgg cactattggc 120

ggtatccttg ctatgcccta ttggcaagat ttgttttcga caggttacag aaacccagag 180

catcacttgg acgttaccgc gtcgcagtct gccactatcg tctccattct gtctgctgga 240

accttctttg gcgctcttgg tgccgctccc cttgccgact gggctggacg acgcttgggc 300

cttattctgt cgtcgtttgt gtttatcttc ggtgtcatcc tgcagaccgc agccgtcagc 360

attcctcttt ttctggctgg ccgattcttt gctggattgg gagttggtct catatcggca 420

accatccccc tctatcaatc cgagactgcc ccgaaatgga ttcgtggtgt catcgtcggg 480

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cataacatgc agaacaccgg ctgctatcgc atccccatag ctgtccaatt tgcatgggcg 600

atcatcctga tcgttggcat gatcattctt cccgaaactc cacgctttca tatcaagaga 660

gacaatctcc cagccgccac taggtctcta gctatcctcc gccgtctgga gcagaaccat 720

ccagcgatca tcgaagagct ttccgagatc caagccaatc atgaatttga gaagagcctc 780

gggaaggcga cctacttgga ctgcctcaag ggcaatttac tcaagcggct ccttactggc 840

tgttttctcc agagcctgca gcagttgact ggcatcaact ttatcttcta ctacggcaca 900

cagttcttca aaaactccgg attctcagac tcgtttctga tatccttgat cactaatctt 960

gtcaatgtcg tgtcgaccct tcccggactc tacgccatcg acaaatgggg ccggaggcct 1020

gttttactct ggggagctgt tgggatgtgt gtctgccagt tcatcgttgc tattcttggg 1080

acaacaacga caagtcaaga tgcaagcgga atgatcattg tgcataatct cgccgcacag 1140

aaagcagcta ttgcattcat ctgcttctac atctttttct tcgctgcatc ttggggtcca 1200

gttgcctggg tcgttacagg cgagatcttc ccccttaaag tccgcgccaa gtcgctctcc 1260

ataactacag cgtcgaattg gctgctcaac tgggccattg cttacagcac accttacctt 1320

gtcaactacg gccctggcaa tgcgaacctg cagtccaaga tcttcttcgt ctggggcgga 1380

tgctgcttca tctgcatcgc attcgtttac ttcatgatct atgagacaaa aggtctcaca 1440

ctggagcagg ttgacgagct atatgaagag gtctcggatg ccaggaagag tattggttgg 1500

gtgccgacca tcactttccg ggagatccgg gaggaaaaga aagtaaggga tccagttgtt 1560

gatatcactg aagaggcagc ttga 1584

<210> 4

<211> 527

<212> PRT

<213> 粗糙脉胞孢霉（Neurospora crassa）

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(527)

<223> HGT-2

<400> 4

Met Gly Leu Ser Leu Lys Lys Pro Glu Gly Val Pro Gly Lys Ser Trp

1 5 10 15

Pro Ala Ile Val Ile Gly Leu Phe Val Ala Phe Gly Gly Val Leu Phe

20 25 30

Gly Tyr Asp Thr Gly Thr Ile Gly Gly Ile Leu Ala Met Pro Tyr Trp

35 40 45

Gln Asp Leu Phe Ser Thr Gly Tyr Arg Asn Pro Glu His His Leu Asp

50 55 60

Val Thr Ala Ser Gln Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Leu Ser Ala Gly

65 70 75 80

Thr Phe Phe Gly Ala Leu Gly Ala Ala Pro Leu Ala Asp Trp Ala Gly

85 90 95

Arg Arg Leu Gly Leu Ile Leu Ser Ser Phe Val Phe Ile Phe Gly Val

100 105 110

Ile Leu Gln Thr Ala Ala Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Ala Gly Arg

115 120 125

Phe Phe Ala Gly Leu Gly Val Gly Leu Ile Ser Ala Thr Ile Pro Leu

130 135 140

Tyr Gln Ser Glu Thr Ala Pro Lys Trp Ile Arg Gly Val Ile Val Gly

145 150 155 160

Ser Tyr Gln Leu Ala Ile Thr Ile Gly Leu Leu Leu Ala Ser Ile Val

165 170 175

Asn Asn Ala Thr His Asn Met Gln Asn Thr Gly Cys Tyr Arg Ile Pro

180 185 190

Ile Ala Val Gln Phe Ala Trp Ala Ile Ile Leu Ile Val Gly Met Ile

195 200 205

Ile Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe His Ile Lys Arg Asp Asn Leu Pro

210 215 220

Ala Ala Thr Arg Ser Leu Ala Ile Leu Arg Arg Leu Glu Gln Asn His

225 230 235 240

Pro Ala Ile Ile Glu Glu Leu Ser Glu Ile Gln Ala Asn His Glu Phe

245 250 255

Glu Lys Ser Leu Gly Lys Ala Thr Tyr Leu Asp Cys Leu Lys Gly Asn

260 265 270

Leu Leu Lys Arg Leu Leu Thr Gly Cys Phe Leu Gln Ser Leu Gln Gln

275 280 285

Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ile Phe Tyr Tyr Gly Thr Gln Phe Phe Lys

290 295 300

Asn Ser Gly Phe Ser Asp Ser Phe Leu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Val Asn Val Val Ser Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Ala Ile Asp Lys Trp

325 330 335

Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Trp Gly Ala Val Gly Met Cys Val Cys

340 345 350

Gln Phe Ile Val Ala Ile Leu Gly Thr Thr Thr Thr Ser Gln Asp Ala

355 360 365

Ser Gly Met Ile Ile Val His Asn Leu Ala Ala Gln Lys Ala Ala Ile

370 375 380

Ala Phe Ile Cys Phe Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ala Ser Trp Gly Pro

385 390 395 400

Val Ala Trp Val Val Thr Gly Glu Ile Phe Pro Leu Lys Val Arg Ala

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Ile Thr Thr Ala Ser Asn Trp Leu Leu Asn Trp Ala

420 425 430

Ile Ala Tyr Ser Thr Pro Tyr Leu Val Asn Tyr Gly Pro Gly Asn Ala

435 440 445

Asn Leu Gln Ser Lys Ile Phe Phe Val Trp Gly Gly Cys Cys Phe Ile

450 455 460

Cys Ile Ala Phe Val Tyr Phe Met Ile Tyr Glu Thr Lys Gly Leu Thr

465 470 475 480

Leu Glu Gln Val Asp Glu Leu Tyr Glu Glu Val Ser Asp Ala Arg Lys

485 490 495

Ser Ile Gly Trp Val Pro Thr Ile Thr Phe Arg Glu Ile Arg Glu Glu

500 505 510

Lys Lys Val Arg Asp Pro Val Val Asp Ile Thr Glu Glu Ala Ala

515 520 525

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 5

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgc ccaccccaga cccagcact 49

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 6

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<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 7

ctccttcaat atcatcttct gtctccgaca gctgcatatt ttgagctcct cgtg 54

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 8

gcggataaca atttcacaca ggaaacagcc gcacacgtcc gcacttcct 49

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 9

gtcggagaca gaagatgata ttgaaggagc 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 10

gttggagatt tcagtaacgt taagtggat 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 11

cgcacacgtc cgcacttcct 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 12

tgcaataggt caggctct 18

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 13

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt agctacctac ctcgagacg 49

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 14

atccacttaa cgttactgaa atctccaact gtagtacagg aggctttgc 49

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 15

ctccttcaat atcatcttct gtctccgaca gctgcccatc taaaggaaca gtcg 54

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 16

gcggataaca atttcacaca ggaaacagcg acacagttcg aatagcagc 49

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 17

gacacagttc gaatagcagc 20

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 18

cggactagta tgtcgtccgc ccacgag 27

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 19

ccggaattca acctgcttct cagcag 26

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 20

ggactagtat gggcttgtca ctcaagaag 29

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 21

ccggaattca gctgcctctt cagtgatatc 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 22

cggactagta tgggcttgtc actcaagaag 30

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 23

cgcggatcct caagctgcct cttcagtg 28

Claims

1.一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解能力、获得或提高丝状真菌葡萄糖转运吸收能力、和/或提高生物量生长以及以生物质或其衍生糖为原料发酵生产生物基化学品能力，包括步骤：利用敲除，突变，导入等基因工程方法对丝状真菌高亲和力葡萄糖转运蛋白进行基因工程改造（含表达水平变化），得到的工程菌株具备上述能力。所述转运蛋白基因包括粗糙脉孢菌NCU10021（HGT-1）及其同源基因和NCU04963（HGT-2）及其同源基因。

2.所述的丝状真菌包括但不限于：脉孢菌（Neurospora）、毁丝霉(Myceliophthora)、木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillin)、镰刀霉(Fusarium)等。

3.所述的葡萄糖转运蛋白包括：(a) 具有SEQ ID NO.: 2、或4中任一条所示氨基酸序列的多肽以及同源性达到或超过70%的氨基酸序列；或(b) 将SEQ ID NO.: 2、或4中任一条所述氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、同源性达到或超过70%、具有己糖转运活性的衍生多肽；其中，所述的己糖转运活性是指将己糖自细胞外转运至细胞内。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制包括敲除、或突变、和/或下调所述的葡萄糖转运蛋白的表达和/或活性。

5.一种所述葡萄糖转运蛋白或其基因的抑制剂的用途，其特征在于，(a)用于提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达；和/或(b)用于提高丝状真菌的纤维素降解能力；和/或(c)用于提高丝状真菌葡萄糖转运吸收和生物量生长；和/或(d)用于提高丝状真菌以生物质（或其衍生糖）为碳源发酵生产生物基化学品能力。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括所述葡萄糖转运蛋白的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA 以及转运蛋白的活性抑制剂。

7. 一种如权利 要求1所述的工程菌，其特征在于，工程菌中所述葡萄糖转运蛋白被敲除、或突变、或表达水平被下调。

8. 一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，其特征在于，在纤维素原料的存在下，培养权利要求7所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。

9. 一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，其特征在于，在木质素原料的存在下，培养权利要求7所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。

10.一种提高五碳糖-六碳糖共利用的方法，其特征在于，在已糖-戊糖共存的条件下，培养权利要求7所述的工程菌，提高混合糖的发酵利用。

11. 权利要求1所述工程菌，其特征在于，工程菌中被过表达外源或上调内源所述葡萄糖转运蛋白基因。

12. 一种增强丝状真菌葡萄糖转运吸收和提高生物量生长的方法，其特征在于，在葡萄糖或者生物质水解液为碳源，培养权利要求11所述的工程菌，工程菌葡萄糖转运吸收能力增强，和/或生物量得到提高。

13.一种增强丝状真菌生物基化学品发酵能力的方法，其特征在于，在葡萄糖或者生物质水解液为碳源，培养权利要求11所述的工程菌，工程菌有机酸或有机醇等生物基化学品发酵能力得到提高。

14.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸为选自下组的序列：(A)编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列；(B)编码SEQ ID NO.: 2、或4中任一所示多肽或同源性达到或超过70%的核苷酸序列；(C)如SEQ ID NO.: 1、或3中任一所示或同源性达到或超过70%的核苷酸序列；(D)与(A)-(C)任一所述或同源性达到或超过70%的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

15. 一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞染色体整合有外源或者上调权利要求14所述的多核苷酸。

16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括酵母（Saccharomyces）属、克鲁维酵母菌属、梭状芽胞杆菌属、或丝状真菌。

17. 权利要求3所述多肽、权利要求14所述多核苷酸、或权利要求15所述宿主细胞的用途，其特征在于用于将己糖自细胞外转运至细胞内。

18. 一种促进宿主细胞转运己糖的方法，其特征在于，包括步骤：在己糖存在下，培养权利要求15所述的宿主细胞。