CN107216408A - 一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法。通过壳聚糖与胍基乙酸进行酰胺化反应，得到抗菌功能化的壳聚糖衍生物。包括以下步骤：1)将壳聚糖溶解在稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸水溶液；2)胍基乙酸进行羧基活化，得到活化胍基乙酸混合液；3)将步骤2)中混合液与壳聚糖稀酸水溶液混合，搅拌反应；4)向反应液中加入盐酸羟胺终止反应；5)反应液过滤后在去离子水中透析，透析完成后进行冷冻干燥处理，即得抗菌功能化壳聚糖衍生物。该制备方法避免了传统使用精氨酸进行胍基功能化中氨基酸自聚的问题，反应流程简单、条件温和，适合工业化生产。所制备的抗菌功能化壳聚糖衍生物在保证较高生物安全性的同时提高了抗菌性、溶解性。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖制备领域，具体涉及一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法。
背景技术
壳聚糖(β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖)是一种具有良好的生物相容性和生物可降解性的天然碱性多糖，由地球上储量仅次于纤维素的天然有机化合物甲壳素脱乙酰后得到。壳聚糖因其特殊的理化性质和生物学特性而具有降低血糖、调节脂质代谢、抑制微生物生长、吸湿保湿等诸多优良功能，被称为第六生命要素，在医药、食品、化工及环保等领域具有广阔的应用前景。尤其是作为抗菌大分子，由于其生物相容性好、毒性低、可降解等特点成为近年来绿色天然抗菌剂开发的研究热点之一。但由于抗菌活性基团氨基的活性较低，并且由于壳聚糖分子间存在较强的氢键作用导致的难溶和抗菌活性低等问题，极大地限制了壳聚糖作为抗菌材料的推广和应用。
壳聚糖分子结构中含有的羟基、氨基等官能团是引入其它功能基团得到功能化壳聚糖衍生物的关键活性位点。通过控制与羟基或氨基的反应条件，可对壳聚糖进行如酰基化、羧基化、醚化、烷基化、酯化、水解等功能化反应[J.Adv.Drug.Deliv.Rev.,2001,50,591.]，从而改变其物理化学性能，赋予壳聚糖更多的特定功能，以适应更多领域的需要，进一步拓宽壳聚糖的应用范围。
胍基是目前自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，其在生理pH介质中能够质子化，在中性、酸性和碱性条件下均能形成带正电的基团。胍基基团具有抗炎症、降压降血脂、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，同时具有强碱性、强稳定性、较好的生物活性和抗菌性能。胍基化合物在天然产物中产量丰富，正电性、碱性以及溶解性均较强，在医药、农业、建筑、服装、化工等领域均有广泛应用。壳聚糖上的氨基具有较高的反应活性，因此通过氨基对壳聚糖进行胍基化改性赋予其与胍类化合物类似的性能，进而提高壳聚糖的抑菌抗菌性能，在这方面的研究国内外已有诸多报道(Hu Y.,et.al.,Carbohyd.Polym.,2007,67,66；BioresourTechnol，2010，101，5693；Zhai X.,et.al.,J.Appl.Polym.Sci.,2011,121,3569.)。Xiao等人在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下，使精氨酸与壳聚糖在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液中常温反应，得到了精氨酸改性的胍基功能化壳聚糖衍生物(Xiao B.,et.al.,Carbohyd.Polym.,2011,83,144.)。然而，由于精氨酸中α氨基的存在，同样可以和羧基活化后的氨基酸发生反应，使得精氨酸自聚严重从而导致精氨酸改性所得的胍基功能化壳聚糖衍生物侧链取代度低，并没有充分改善壳聚糖的水溶性以及抑菌性能，这在很大程度上影响了其作为绿色天然抑菌剂的应用。而作为肌酸前体物的胍基乙酸，是甘氨酸的胍基衍生物，常被用作饲料添加剂、有机合成中间体，因为其分子中不含活性氨基，所含羧基具有一定的化学活性，在保证与壳聚糖分子上的氨基反应的同时，又不会产生自聚，适合用于壳聚糖的抗菌功能化改性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法，壳聚糖与胍基乙酸进行酰胺化反应，得到抗菌功能化的壳聚糖衍生物。
优选地，包括以下步骤：
1)将壳聚糖溶解在稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸水溶液；
2)胍基乙酸进行羧基活化；
3)将活化后的胍基乙酸混合液与壳聚糖稀酸水溶液混合，搅拌反应；
4)向反应液中加入盐酸羟胺终止反应；
5)反应液过滤后在去离子水中透析，透析完成后进行冷冻干燥处理，即得抗菌功能化壳聚糖衍生物。
优选地，步骤1)中所述的壳聚糖数均分子量为102-107，脱乙酰度为50-99％。
优选地，步骤1)中所述的稀酸为盐酸或乙酸，酸的浓度为0.1-0.5M，壳聚糖溶液质量百分比为0.1％-50％。
优选地，步骤2)中胍基乙酸进行羧基活化的具体条件为：
胍基乙酸在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)存在的条件下，在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液中进行活化；
优选地，所述MES缓冲液的浓度为10-100mM，pH为4.5-7.5；
优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与胍基乙酸的物质的量之比为0.5-5:1；
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的物质的量之比为1:1。
优选地，步骤2)胍基乙酸进行羧基活化的温度为0-35℃，活化时间为0.5-3小时。
优选地，步骤3)中胍基乙酸与壳聚糖的物质的量之比为0.1-10:1。
优选地，步骤3)中的反应温度应为0-35℃，反应时间为12-72小时。
优选地，步骤4)中所述盐酸羟胺与胍基乙酸的物质的量之比为1:1。
优选地，步骤5)中透析条件为每5-10小时换水一次，换水6-8次后，即完成透析。
本发明所述的一种优选地方案如式1所示：
本发明的有益效果如下：
本发明所述的抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法，使用胍基乙酸直接与壳聚糖进行酰胺化，避免了传统使用精氨酸进行胍基功能化过程中氨基酸自聚的问题。并且操作简单、条件温和，所用主要原料壳聚糖与胍基乙酸来源广泛，价格相对较低，无毒无害，生产过程中不会造成环境污染；反应流程简单，并且由于后处理采用冷冻干燥技术，所得抗菌功能化的壳聚糖衍生物具有三维大孔网络结构，有利于溶解过程中溶剂分子的快速渗入，提高了溶解性。利用该方法制备得到的抗菌功能化壳聚糖衍生物，在保证了产物较高生物安全性的同时提高了抗菌性和溶解性，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据以上发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
实施例1：
称取0.1克壳聚糖加入到100毫升0.1M的稀盐酸中，室温下机械搅拌使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为0.1％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在冰水浴中活化3小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为10mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝4.5)20mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为10:1:5:5，于35℃下持续搅拌反应12小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔5小时换水一次，换水6次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率56％。
实施例2：
称取1.0克壳聚糖加入到100毫升0.2M的稀盐酸中，室温下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为1.0％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在15℃下活化2小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为25mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝5.0)35mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为2:2:5:5，于室温下持续搅拌反应24小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔7小时换水一次，换水7次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率59％。
实施例3：
称取10.0克壳聚糖加入到100毫升0.3M的稀盐酸中，室温下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量体积百分比浓度为9.1％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在室温下活化1小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为50mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝6.5)20mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为1:5:5:5，于15℃下持续搅拌反应48小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔8小时换水一次，换水6次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率63％。
实施例4：
称取100克壳聚糖加入到100毫升0.5M的稀盐酸中，50℃水浴下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为50％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在35℃下活化0.5小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为100mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝7.5)20mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为1:10:5:5，于冰水浴下持续搅拌反应72小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔10小时换水一次，换水8次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率45％。
实施例5：
称取0.1克壳聚糖加入到100毫升0.1M的稀乙酸中，60℃水浴下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为0.1％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在冰水浴下活化3小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为10mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝4.5)30mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为10:1:5:5，于35℃下持续搅拌反应72小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔5小时换水一次，换水7次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率48％。
实施例6：
称取1.0克壳聚糖加入到100毫升0.2M的稀乙酸中，60℃水浴下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为1.0％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在15℃下活化2小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为25mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝5.0)40mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为2:2:5:5，于室温下持续搅拌反应48小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔7小时换水一次，换水6次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率58％。
实施例7：
称取10.0克壳聚糖加入到100毫升0.3M的稀乙酸中，60℃油浴下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为9.1％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在室温下活化1小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为50mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝6.5)50mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为1:5:5:5，于15℃下持续搅拌反应24小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔8小时换水一次，换水7次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率55％。
实施例8：
称取20.0克壳聚糖加入到100毫升0.5M的稀乙酸中，60℃油浴下机械搅拌以使壳聚糖溶解完全，从而得到质量百分比为16.7％的壳聚糖稀酸溶液；然后将在35℃下中活化0.5小时的胍基乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的混合溶液(溶剂为100mM的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)的缓冲溶液，pH＝7.5)50mL加入上述壳聚糖稀酸溶液中，其中壳聚糖、胍基乙酸、NHS、EDC的物质的量之比为1:10:5:5，于冰水浴中持续搅拌反应12小时后加入与胍基乙酸等物质的量的盐酸羟胺终止反应；过滤除去反应液中的不溶物，接着将滤液转入透析袋，将透析袋两端封紧投入去离子水中透析，每隔10小时换水一次，换水8次后将透析液放入-86℃冰箱中冷冻1小时后，放入冻干机直至冷冻干燥充分，即可得所述抗菌功能化的壳聚糖衍生物，产率55％。
Claims (10)
1.一种抗菌功能化壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，壳聚糖与胍基乙酸进行酰胺化反应，得到抗菌功能化的壳聚糖衍生物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将壳聚糖溶解在稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸水溶液；
2)胍基乙酸进行羧基活化，得到活化胍基乙酸混合液；
3)将步骤2)中混合液与壳聚糖稀酸水溶液混合，搅拌反应；
4)向反应液中加入盐酸羟胺终止反应；
5)反应液过滤后在去离子水中透析，透析完成后进行冷冻干燥处理，即得抗菌功能化的壳聚糖衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的壳聚糖数均分子量为102-107，脱乙酰度为50-99％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的稀酸为盐酸或乙酸，酸的浓度为0.1-0.5M，壳聚糖溶液质量百分比为0.1％-50％。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中胍基乙酸进行羧基活化的具体条件为：
胍基乙酸在N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在的条件下，在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液中进行活化；
所述2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液的浓度为10-100mM，pH为4.5-7.5。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与胍基乙酸的物质的量之比为0.5-5:1，N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1:1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中混合溶液在0-35℃之间恒温搅拌活化0.5-3小时。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中胍基乙酸与壳聚糖的物质的量之比为0.1-10:1；反应温度应为0-35℃，反应时间为12-72小时。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸羟胺与胍基乙酸的物质的量之比为1:1。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中透析条件为每5-10小时换水一次，换水6-8次后，即完成透析。
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