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CN107201316A - 一种曲霉菌及其生产肺念菌素b0的方法 - Google Patents

一种曲霉菌及其生产肺念菌素b0的方法 Download PDF

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CN107201316A CN201710575306.3A CN201710575306A CN107201316A CN 107201316 A CN107201316 A CN 107201316A CN 201710575306 A CN201710575306 A CN 201710575306A CN 107201316 A CN107201316 A CN 107201316A
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Abstract

本发明公开了一种新的曲霉菌菌株及其应用。该菌株命名为Glarea lozoyensis HS‑2158，保藏编号为CGMCC NO.13367。本发明的菌株HS‑2158为肺念菌素B0高产菌，而且产生的肺念菌素C0、E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物占肺念菌素B0的百分比含量都较低，降低了肺念菌素B0的提取和分离难度，因此本发明菌株HS‑2158有很好的应用价值。

Description

一种曲霉菌及其生产肺念菌素B0的方法
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一种曲霉菌及其在制备肺念菌素B0(Pneumocandin B0)中的应用。
背景技术
卡泊芬净(Caspofungin)由默克公司开发，商品名科赛斯(Cancidas)，结构式如下式1所示，2001年首次在美国上市，已在70多个国家被广泛使用。目前，该产品已成为全身用抗真菌药市场的王牌药物。
卡泊芬净是葡聚糖合成酶抑制剂(该酶在哺乳动物的细胞内没发现，是许多致病性真菌合成细胞壁主要部分所需要的酶)。该酶可催化转运尿苷二磷酸中的葡聚糖基生成β-1，3-D-葡聚糖。β-1，3-D-葡聚糖合成酶为真菌生长所必需，抑制该酶可使细胞壁结构异常，致使细胞破坏，细胞内容物渗漏。卡泊芬净具有广谱抗真菌活性，可以治疗对氟康唑耐药的念珠菌属、曲霉菌属和某些地方性真菌病，对卡式肺囊虫病等有效，通过非竞争性抑制的真菌细胞壁内的β-1，3-D-葡聚糖合成酶的活性，进而引起真菌细胞壁的裂解以及细胞内外渗透压的改变从而将真菌细胞彻底杀死。
肺念菌素B0(Pneumocandin B0)是合成卡泊芬净的原料，是一类由Glarealozoyensis产生的天然抗真菌脂肽类抗生素，Glarea lozoyensis除能产生A0和B0两种主要产物外，还能产生C0、D0、E0、B1、和B2等16种类似物，不同氨基酸侧链修饰或氨基酸连接顺序的不同导致了肺念菌素类化合物的结构多样性。目前已知的肺念菌素类化合物及其类似物的结构如下式2和下表1所示：
表1肺念菌素类化合物的取代基
Pneumocandin R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
A0 CH3 OH OH OH CH3 OH OH
B0 H OH OH OH CH3 OH OH
C0 OH H OH OH CH3 OH OH
D0 OH OH OH OH CH3 OH OH
E0 H H OH OH CH3 OH OH
A1 CH3 OH OH OH CH3 H OH
A2 CH3 OH H H CH3 OH OH
A3 CH3 OH OH H CH3 H H
A4 CH3 OH H H CH3 H H
B1 H OH OH OH CH3 H OH
B2 H oH H H CH3 OH OH
B5 H OH OH H CH3 OH OH
B6 H oH H oH CH3 OH OH
D2 OH OH H H CH3 OH OH
B0Serine analogue H OH OH OH H OH OH
B5Serine analogue H OH OH H H OH OH
秦婷婷等在中国抗生素杂志2016年3月第41卷第3期(原生质体诱变筛选高产纽莫康定B0的菌株)报道了默克公司经过亚硝基胍诱变选育出肺念菌素B0产生菌ATCC74030的来源，发酵效价为241μg/ml，经过碳源优化将甘露醇作为碳源的条件下，肺念菌素B0效价达到800μg/ml。再经过原生质体的制备和再生，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变筛选出肺念菌素B0高产菌株，效价为1130μg/ml。
WO00/08197公开了菌株ATCC74030发酵制备肺念菌素B0时，以125g/L果糖为碳源，通过添加氨基酸和微量元素来降低杂质的方法，其中添加15g/L脯氨酸可以将肺念菌素C0降低到4.4％，但肺念菌素E0增加到2.7％，添加微量元素锌使肺念菌素B0丝氨酸类似物及B5含量分别降低了1％，但是肺念菌素E0含量增加了一倍且肺念菌素B0效价降低了50％，添加微量元素钴可以使肺念菌素E0含量从2.2％降低到1.8％，但是肺念菌素B0丝氨酸类似物及B5含量增加一倍且肺念菌素B0效价降低了25％，且在发酵过程中添加氨基酸和微量元素，增加了生产成本。
即便通过大体积的硅胶柱可以有效分离肺念菌素B0的结构类似物，但在菌种水平提高肺念菌素B0的效价并同时降低副产物的含量，从而降低下游分离的成本很有必要，因此，寻找一种新的、高效的、副产物低的、易于提取的肺念菌素B0(Pneumocandin B0)的生产菌种的工作仍然在继续进行中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的菌株Glarea lozoyensis HS-2158其保藏编号为CGMCC NO.13367。
本发明的目的还在于提供的菌株HS-2158在制备肺念菌素B0或其类似物中的应用，所述类似物为肺念菌素A0，C0，D0，E0，A1，A2，A3，A4，B1，B2，B5，B6，D2，B0丝氨酸类似物，B5丝氨酸类似物，优选为肺念菌素C0、B5、E0、B0丝氨酸类似物。
本发明还提供了一种采用菌株HS-2158制备肺念菌素B0的方法。该方法包括将菌株HS-2158在固体培养基进行菌落培养，然后在种子培养基进行种子培养，再接种于发酵培养基中进行发酵培养。
在优选的实施方案中，所述菌落培养的时间为5～15天，优选7～12天；所述种子培养的时间为24～120小时，优选48～100小时；所述种子培养的温度为20～30℃，优选22～28℃。所述发酵培养的时间为96～360小时，优选216-340小时；所述发酵培养的温度为20～30℃，优选22～28℃。
在优选的实施方案中，所述的种子培养基各组分在培养基中的浓度为：碳源5.0～70.0g/L，氮源5.0～60.0g/L，无机盐0～5.5g/L，所述的种子培养基的pH为5.0～7.0；和/或
发酵培养基各组分在培养基中的浓度为：碳源5.0～170.0g/L，氮源5.0～65.0g/L，无机盐0～21.0g/L，氨基酸5.0～30.0g/L，所述的发酵培养基的pH为5.0～7.5；
在优选的实施方案中，所述的种子培养基的碳源选自葡萄糖、玉米淀粉、乳糖、麦芽糊精中的一种或几种，所述的种子培养基的氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、花生饼粉、玉米浆干粉中的一种或几种，所述的种子培养基的无机盐选自硝酸钠，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸锌中的一种或几种；和/或
所述的发酵培养基的碳源选自葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糊精、玉米淀粉、豆油、油酸甲酯中的一种或几种，所述的发酵培养基的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮中的一种或几种，所述的发酵培养基的无机盐选自氯化铵、硝酸铵，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或几种，所述的发酵培养基的氨基酸选自L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。
优选的，所述的种子培养基含有玉米淀粉5.0～20.0g/L、葡萄糖10.0～50.0g/L、黄豆饼粉10.0～30.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、花生饼粉5.0～15.0g/L、磷酸二氢钾0.5～2.0g/L、硫酸铵0.5～1.5g/L、碳酸钙0.5～2.0g/L，所述的种子培养基的pH为6.0～7.0；和/或
所述的发酵培养基含有山梨醇90.0～150.0g/L、葡萄糖5.0～50.0g/L、黄豆饼粉5.0～20.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、棉籽饼粉10.0～30.0g/L、磷酸二氢钾1.0～7.0g/L、硫酸铵0.5～4.0g/L、氯化钙0.5～5.0g/L、硫酸锌0.8～5.0g/L、L-脯氨酸5.0～30.0g/L，所述的发酵培养基的pH为5.0～7.0。
更优选的，所述的种子培养基含有玉米淀粉10.0g/L、葡萄糖30.0g/L、黄豆饼粉20.0g/L、蛋白胨8.0g/L、花生饼粉10.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸铵0.8g/L、碳酸钙1.0g/L，所述的种子培养基的pH为6.5；和/或
所述的发酵培养基含有山梨醇100.0g/L、葡萄糖5.0g/L、黄豆饼粉20.0g/L、蛋白胨5.0g/L、棉籽饼粉30.0g/L、磷酸二氢钾5.0g/L、硫酸铵3.0g/L、氯化钙4.0g/L、硫酸锌1.0g/L、L-脯氨酸15.0g/L，所述的发酵培养基的pH为7.0。
肺念菌素B0及其类似物可以通过以下条件进行液相(HPLC)检测：
a、肺念菌素B0、B5、E0、B0丝氨酸类似物的高效液相分析方法：色谱柱：ODS柱4.6mm×250mm，柱温：40℃；流动相∶乙腈∶水＝60∶40(体积比)，流速：1.0ml/min，检测波长：210nm，进样量：10μl；
b、肺念菌素B0与C0的高效液相分析方法：色谱柱：硅柱4.6mm×250mm；流动相∶正己烷∶甲醇∶水＝70∶30∶2(体积比)，流速：1.0ml/min，检测波长：276nm，进样量：10μl。
备注：进行HPLC检测时，首先通过检测方法a检测肺念菌素B0、B5、E0、B0丝氨酸类似物的效价，然后通过检测方法b得到肺念菌素B0与C0的比值，再以检测方法a中肺念菌素B0的效价计算肺念菌素C0的效价。
本发明所述粘度可以在下述条件下进行检测，仪器：BROOKFIELD，转子：16s，转速：30rpm。
本发明菌株HS-2158与现有技术中肺念菌素B0的产生菌相比具有以下优点：
①本发明菌株HS-2158产生肺念菌素B0的发酵单位高，且能稳定生产肺念菌素B0。
②本发明菌株HS-2158降低了肺念菌素C0、E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物占肺念菌素B0的百分比含量，降低了肺念菌素B0的提取和分离难度，有利于得到高纯度的肺念菌素B0。
③现有技术中披露了肺念菌素B0产生菌的发酵碳源为果糖或甘露醇，而本发明菌株HS-2158能很好的利用山梨醇，可以在以山梨醇为主要碳源的发酵培养基中发酵，且肺念菌素B0的效价最高可达到7625μg/ml，远远高于已知的其他产生菌，培养后得到的发酵液粘度低，降低了发酵产物的提纯难度。
④现有技术中披露了通过添加脯氨酸、苏氨酸、微量元素锌、镍等来分别降低某些杂质，而本发明菌株HS-2158可以同时降低肺念菌素C0、E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物占肺念菌素B0的百分比含量。
⑤本发明菌株HS-2158的遗传稳定性好，具有良好的工业应用前景。
本发明所采用的肺念菌素B0产生菌为Glarea lozoyensis HS-2158(CGMCCNO.13367)。
本发明菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)的微生物菌种于2017年01月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.13367，分类命名为Glarea lozoyensis，并登记入册，证明存活。
具体实施方式
下述实施例中调节培养基料液pH值所采用的试剂均为本领域常规使用的NaOH溶液或盐酸。
下述实施例中固体培养基采用去离子水定容，种子及发酵培养基采用自来水进行定容，各培养基按所述配方称取原料，将各原料进行充分混合，再加水至所需体积，最后通过NaOH溶液或盐酸调节至所需pH值。
实施例1菌株来源
本发明菌株HS-2158系从浙江新安江中分离得到的原始菌株，再通过诱变得到的突变菌株。
原始菌株在PDA斜面培养基中25℃培养13天后，在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下，在磨口试管中磨碎菌丝体并悬浮于无菌水中，制得菌悬液，供NTG(亚硝基胍)诱变处理。
称取NTG晶体5mg，溶解在5ml无菌Tris缓冲液(pH8.0)中，用移液管吸取3ml NTG溶液加入到2ml菌悬液，置于25℃培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。余下的具体步骤如下：
(1)菌丝体的制备与培养
PDA固体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却到50-60℃倒入平板，将处理过的菌悬液经适当稀释，吸取0.1ml菌悬液涂布于PDA平板上，未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于PDA平板作为对照，置于25℃恒温培养箱培养，菌落培养13天后，菌丝成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉10.0、葡萄糖30.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨8.0、花生饼粉10.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸铵0.8、碳酸钙1.0，pH6.5，摇瓶装液量为20ml/250ml，121℃灭菌30分钟。每个种子摇瓶接入0.5个菌落左右为宜，培养温度22～28℃，培养湿度40～60％，摇瓶机振幅5cm，转速250rpm，培养周期88小时。
(3)肺念菌素B0发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方Ⅰ(g/L)：麦芽糊精100.0、葡萄糖5.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、磷酸二氢钾5.0、硫酸铵3.0、氯化钙4.0、硫酸锌1.0、L-脯氨酸15.0；pH7.0，摇瓶装液量为30ml/250ml，121℃灭菌30分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入发酵培养基，培养温度22～28℃，培养湿度40～60％，摇瓶机振幅5cm，转速250rpm，培养周期239小时。
挑选经过NTG诱变后的单菌落1000株，进行摇瓶发酵，HPLC检测肺念菌素B0的产量。筛选出产肺念菌素B0最高产的突变菌株即菌株HS-2158。其主要生物学特征为：成熟时的菌落呈黑绿色，并产黄绿色孢子，高耸扎实，菌落圆形稍不规则，直径0.8-1.2cm，无水溶性色素产生。
实施例2菌种鉴定
参照《普通真菌学》、《常见细菌系统鉴定手册》、《分子克隆实验指南》及《中国药典》(2005版XIH)等书中的有关内容进行实验。
1.培养特征：采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、查氏、PDA、苹果酸钙、营养和高氏一号培养基10种培养基，28℃培养7～10天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。菌株的培养特征见表3。
表3菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在10种培养基上的培养特征
培养基 生长情况 基质菌丝 气生菌丝 可溶色素
ISP1 2 橄榄绿色 白色 无
ISP2 4 橄榄绿色 黄绿色 无
ISP3 4 橄榄绿色 黄绿色 无
ISP4 1 黄绿色 白色 无
ISP5 1 淡粉色 淡粉色 无
查氏 2 褐绿色 白色 无
PDA 4 橄榄绿色 黄绿色 无
苹果酸钙 3 黑绿色 白色 无
营养 3 棕黑色 褐色 无
高氏一号 1 褐绿色 白色 无
2.生理生化试验：除温度实验外，均为28℃培养5～7天。
a)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，见表4。
b)无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为1.0％，见表4。
c)降解试验和NaCl耐受实验采用基础培养基为GYEA(pH6.0)，降解试验结果见表5，NaCl耐受实验结果见表6。
d)氧化酶和过氧化氢酶试验、pH试验和温度试验均采用PDA培养基。氧化酶和过氧化氢酶试验结果见表7，pH试验结果见表8，温度试验结果见表9.
e)M.R、V.P实验：采用《常见细菌系统鉴定手册》方法。其结果见表7.
生理生化特征：见表4～表9。
表4菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)的碳源和氮源的利用情况
表5菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果＊ 降解物 降解物浓度 结果
腺嘌呤 0.5％ 3，- 酪蛋白 1.0％ 4，-
鸟嘌呤 0.5％ 3，- 酪氨酸 1.0％ 3，-
黄嘌呤 0.4％ 3，- Tween-40 1.0％ 4，-
次黄嘌呤 0.4％ 2，- Tween-60 1.0％ 3，-
木聚糖 0.4％ 3，- Tween-80 1.0％ 2，-
表6菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)对NaCl的耐受性
NaCl浓度 1％ 4％ 7％ 10％
菌株生长情况 3 1 0 0
表7菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 + 硫化氢产生 - 过氧化氢酶 -
淀粉水解 - V.P实验 - 氧化酶 -
牛奶凝固 - M.R实验 -
牛奶胨化 - 硝酸盐还原 +
表8菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)生长的pH试验
pH 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
生长情况 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4
表9菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)生长的温度试验
温度(℃) 7 14 28 37 45
生长情况 0 2 4 3 1
*注：表3-9中：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
3. 26S rDNA序列分析：收集PDA培养的新鲜菌体，采用液氮破壁方法提取总DNA模板，采用Fungi Identification PCR Kit(TaKaRa)进行26S rDNA基因D1/D2区域扩增，PCR产物经琼脂糖电泳检测后，直接进行序列测定，PCR产物的纯化与测序由上海生工生物工程技术有限公司进行。菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)所测的26S rDNA基因D1/D2区域序列经校对后，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。
HS-2158(CGMCC NO.13367)的26S rDNA D1/D2序列(见序列表)与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表10(表中只列出同源性较高的菌株)。
表10菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)和相关菌株的同源性
通过对菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)26S rDNA D1/D2区域测序，发现其和曲霉菌(Glarea lozoyensis)有很高同源性，最高的达99％，同时对菌株HS-2158(CGMCCNO.13367)进行表观特征试验，发现该菌株和曲霉菌(Glarea lozoyensis)分类相关参数非常接近，故将菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)鉴定为曲霉菌(Glarea lozoyensis)的菌株。
实施例3菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在发酵培养基主要碳源为山梨醇和麦芽糊精时
的发酵工艺研究
(1)PDA固体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却到50-60℃倒入平板，接入0.1ml菌悬液培养13d后，菌丝成熟。
(2)种子培养基配方及培养条件等同实施例1中步骤(2)，培养周期87小时。
(3)肺念菌素B0发酵培养基的制备与培养。
发酵培养基配方Ⅰ等同实施例1中步骤(3)；
发酵培养基配方Ⅱ(g/L)：山梨醇50.0、麦芽糊精50.0、葡萄糖5.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、磷酸二氢钾5.0、硫酸铵3.0、氯化钙4.0、硫酸锌1.0g、L-脯氨酸15.0，pH7.0；
发酵培养基配方Ⅲ(g/L)：山梨醇100.0、葡萄糖5.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、磷酸二氢钾5.0、硫酸铵3.0、氯化钙4.0、硫酸锌1.0g、L-脯氨酸15.0，pH7.0。
摇瓶装液量均为30ml/250ml，121℃灭菌30分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入发酵培养基，培养温度22～28℃，培养湿度40～60％，摇瓶机振幅5cm，转速250rpm，培养周期240小时。粘度及HPLC检测，三组发酵的结果见表11。
表11HS-2158(CGMCC NO.13367)在不同发酵配方时的发酵结果
FMⅠ：发酵培养基配方Ⅰ
FMⅡ：发酵培养基配方Ⅱ
FMⅢ：发酵培养基配方Ⅲ
由表可知，发酵培养基碳源为麦芽糊精或山梨醇时，菌株HS-2158产肺念菌素B0的效价均比较高，其中碳源优选山梨醇，发酵效价更高，粘度更低。
实施例4菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在发酵培养基碳源为麦芽糊精和山梨醇时发酵工艺研究
(1)PDA固体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却到50-60℃倒入平板，接入0.1ml菌悬液培养13d后，菌丝成熟。
(2)种子培养基配方及培养条件等同实施例1中步骤(2)，培养周期87小时。
(3)肺念菌素B0发酵培养基的制备与培养。
发酵培养基配方Ⅰ等同实施例1中步骤(3)；
发酵培养基配方Ⅲ(g/L)：山梨醇100.0、葡萄糖5.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、磷酸二氢钾5.0、硫酸铵3.0、氯化钙4.0、硫酸锌1.0g、L-脯氨酸15.0，pH7.0。
摇瓶装液量均为30ml/250ml，121℃灭菌30分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入发酵培养基，培养温度22～28℃，培养湿度40～60％，摇瓶机振幅5cm，转速250rpm，培养周期240小时。粘度及HPLC检测，三组发酵的结果见表12。
表12HS-2158(CGMCC NO.13367)在FMⅠ和FMⅢ上的发酵比较结果
FMⅠ：发酵培养基配方Ⅰ
FMⅢ：发酵培养基配方Ⅲ
由表可知，无论发酵培养基碳源为山梨醇还是麦芽糊精，本发明菌株HS-2158产生的肺念菌素C0、E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物占肺念菌素B0的百分比含量接近且均较低。
与公开的专利WO00/08197进行比较，该专利具体公开了添加15g/L脯氨酸可以将肺念菌素C0降低到4.4％，但肺念菌素E0增加到2.7％，添加微量元素锌使肺念菌素B0丝氨酸类似物及B5含量分别降低了1％(B0丝氨酸类似物为1.9％，B5为3.9％)，但是肺念菌素E0含量增加了一倍(肺念菌素E0为4.3％)且肺念菌素B0效价降低了50％，添加微量元素钴可以使肺念菌素E0含量从2.2％降低到1.8％，但是肺念菌素B0丝氨酸类似物及B5含量增加一倍(肺念菌素B0丝氨酸类似物为6.0％，B5为7.2％)且肺念菌素B0效价降低了25％。
通过比较可知虽然发酵中都含有脯氨酸，但本专利中的肺念菌素C0的百分含量更低；肺念菌素E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物与已公开专利工艺相比，其百分含量也都更低；此外，已公开专利通过添加脯氨酸、微量元素锌、镍等来分别降低某些杂质，而本发明菌株HS-2158可以同时降低肺念菌素C0、E0、B5、B0丝氨酸类似物等副产物占肺念菌素B0的百分比含量。
实施例5菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在发酵培养基碳源为不同浓度的山梨醇时的发酵工艺研究
(1)固体培养基配方及培养条件等同实施例3中步骤(1)
(2)种子培养基配方及培养条件等同实施例1中步骤(2)，培养周期87小时。
(3)肺念菌素B0发酵培养基的制备与培养
发酵培养基基础配方Ⅳ(g/L)：葡萄糖5.0、黄豆饼粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、磷酸二氢钾5.0、硫酸铵3.0、氯化钙4.0、硫酸锌1.0、L-脯氨酸15.0。在发酵培养基基础配方Ⅳ中添加山梨醇，山梨醇浓度分别为90.0g/L、110.0g/L、130.0g/L、150.0g/L，得到四组不同浓度山梨醇的发酵培养基，pH7.0，摇瓶装液量为30ml/250ml，121℃灭菌30分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入这四组不同浓度山梨醇的发酵培养基中，培养温度22～28℃，培养湿度40～60％，摇瓶机振幅5cm，转速250rpm，培养周期分别为240、286小时。HPLC检测，结果见表12。
表13不同浓度的山梨醇发酵结果比较
山梨醇浓度(g/L) 90.0 110.0 130.0 150.0
240小时HPLC B0(μg/ml) 5613 6711 6102 5615
286小时HPLC B0(μg/ml) 4522 7194 7625 7013
实施例6菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在50L发酵罐上的小试研究
(1)种子罐种子液的制备
在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比同实施例1，同时添加0.05％的PPG作为消泡剂)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入200ml摇瓶种子液，培养温度22～28℃，搅拌转速100～500rpm，通气量0.5～1.0vvm，溶氧20～70％，培养86小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例3中发酵配方Ⅲ相同，但要添加0.05％PPG作为消泡剂，发酵罐装量为35L/50L，pH7.0，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，冷却后，接入约3.5L种子罐培养液，发酵温度22～28℃，搅拌转速200～500rpm，通气量为0.5～1.0vvm，发酵培养252小时，发酵放罐时发酵液进行HPLC检测，测得肺念菌素B0发酵效价为7010μg/ml。C0发酵效价156μg/ml，B5发酵效价44μg/ml，E0发酵效价32μg/ml，B0丝氨酸类似物发酵效价34μg/ml。
实施例7菌株HS-2158(CGMCC NO.13367)在5000L发酵罐上的放大培养
(1)种子罐种子液的制备
在500L种子罐中投入300L的种子培养基(种子培养基的配比同实施例1，同时添加0.05％的PPG作为消泡剂)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入1800ml摇瓶种子液，培养温度22～28℃，搅拌转速50～200rpm，通气量0.6～1.2vvm，溶氧30～70％，培养98小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例3中发酵配方Ⅲ相同，但要添加0.05％PPG作为消泡剂，发酵罐装量为3000L/5000L，pH7.0，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，冷却后，接入约300L种子罐培养液，发酵温度22～28℃，搅拌转速300～500rpm，通气量为0.5～1.5vvm，发酵培养280小时，发酵放罐时发酵液进行HPLC检测，测得肺念菌素B0发酵效价为6845μg/ml。C0发酵效价138μg/ml，B5发酵效价38μg/ml，E0发酵效价34μg/ml，B0丝氨酸类似物发酵效价29μg/ml。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海正药业股份有限公司
<120> 一种曲霉菌及其生产肺念菌素B0的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 曲霉菌（Glarea lozoyensis）
<400> 1
ggatctagac ggcagtgatt ccagctcggt accaccggga tcctctgcga gtgcaccagt 60
aacagctcaa atttgaaatc tggctctttt agggtccgag ttgtaatttg tagaagatgc 120
ttcgggtgta gctccggtct aagttccttg gaacaggacg tcatagaggg tgagaatccc 180
gtatgtgact ggtggctttc gcccatgtga agctctttcg acgagtcgag ttgtttggga 240
atgcagctct aaatgggtgg taaatttcat ctaaagctaa atattggcca gagaccgata 300
gcgcacaagt agagtgatcg aaagatgaaa agcactttgg aaagagagtt aaacagtacg 360
tgaaattgtt gaaagggaag cgcttgcaac cagatttgca ccccgtcgat catcccccgt 420
tctcggaggt gcactcggcg gggttcaggc cagcatcggt ttcggtggtg ggataaaggc 480
cttgggaacg tagctcctct cggggagtgt tatagccctc ggtgcaatgc cgcctaccgg 540
gaccgaggac cgcgcttcgg ctaggatgct ggcgtaatgg ttgtaagcga cccgtcttga 600
aacacggacc cctgtgtgaa attgttatcc gctcaatcgt cgacctgcag gcatgcaagc 660
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 720
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 780
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 840
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 900
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 960
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcaggg 999

Claims (10)

1.一种菌株Glarea lozoyensis HS-2158，其保藏编号为CGMCC NO.13367。
2.根据权利要求1所述的菌株HS-2158在制备肺念菌素B0或其类似物中的应用，所述类似物为肺念菌素A0，C0，D0，E0，A1，A2，A3，A4，B1，B2，B5，B6，D2，B0丝氨酸类似物，B5丝氨酸类似物，优选为肺念菌素C0、B5、E0、B0丝氨酸类似物。
3.一种肺念菌素B0的制备方法，其特征在于，该方法包括将如权利要求1所述菌株Glarea lozoyensis HS-2158在固体培养基进行菌落培养，然后在种子培养基进行种子培养，再接种于发酵培养基中进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菌落培养的时间为5～15天，优选7～12天。
5.根据权利要求3-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养的时间为24～120小时，优选48～100小时；所述种子培养的温度为20～30℃，优选22～28℃。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为96～360小时，优选216-340小时；所述发酵培养的温度为20～30℃，优选22～28℃。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于：
所述的种子培养基各组分在培养基中的浓度为：碳源5.0～70.0g/L，氮源5.0～60.0g/L，无机盐0～5.5g/L，所述的种子培养基的pH为5.0～7.0；和/或
所述的发酵培养基各组分在培养基中的浓度为：碳源5.0～170.0g/L，氮源5.0～65.0g/L，无机盐0～21.0g/L，氨基酸5.0～30.0g/L，所述的发酵培养基的pH为5.0～7.5。
8.根据权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于：
所述的种子培养基的碳源选自葡萄糖、玉米淀粉、乳糖、麦芽糊精中的一种或几种，所述的种子培养基的氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、花生饼粉、玉米浆干粉中的一种或几种，所述的种子培养基的无机盐选自硝酸钠，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸锌中的一种或几种；和/或
所述的发酵培养基的碳源选自葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糊精、玉米淀粉、豆油、油酸甲酯中的一种或几种，所述的发酵培养基的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮中的一种或几种，所述的发酵培养基的无机盐选自氯化铵、硝酸铵，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或几种，所述的发酵培养基的氨基酸选自L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。
9.根据权利要求3～8所述的制备方法，其特征在于：
所述的种子培养基含有玉米淀粉5.0～20.0g/L、葡萄糖10.0～50.0g/L、黄豆饼粉10.0～30.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、花生饼粉5.0～15.0g/L、磷酸二氢钾0.5～2.0g/L、硫酸铵0.5～1.5g/L、碳酸钙0.5～2.0g/L，所述的种子培养基的pH为6.0～7.0；和/或
所述的发酵培养基含有山梨醇90.0～150.0g/L、葡萄糖5.0～50.0g/L、黄豆饼粉5.0～20.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、棉籽饼粉10.0～30.0g/L、磷酸二氢钾1.0～7.0g/L、硫酸铵0.5～4.0g/L、氯化钙0.5～5.0g/L、硫酸锌0.8～5.0g/L、L-脯氨酸5.0～30.0g/L，所述的发酵培养基的pH为5.0～7.0。
10.根据权利要求3～9所述的制备方法，其特征在于：
所述的种子培养基含有玉米淀粉10.0g/L、葡萄糖30.0g/L、黄豆饼粉20.0g/L、蛋白胨8.0g/L、花生饼粉10.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸铵0.8g/L、碳酸钙1.0g/L，所述的种子培养基的pH为6.5；和/或
所述的发酵培养基含有山梨醇100.0g/L、葡萄糖5.0g/L、黄豆饼粉20.0g/L、蛋白胨5.0g/L、棉籽饼粉30.0g/L、磷酸二氢钾5.0g/L、硫酸铵3.0g/L、氯化钙4.0g/L、硫酸锌1.0g/L、L-脯氨酸15.0g/L，所述的发酵培养基的pH为7.0。
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