CN107184613A - 一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及其应用，所述益生菌组合物选自：双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌中的一种或多种。本发明通过体外动物实验确定这些益生菌组合干预对于HBV小鼠清除HBV能力的影响。本发明最终确定两种不同的益生菌组合在血清HBsAg水平、血清HBV DNA水平、肝组织pgRNA及cccDNA水平，均表现出显著促进HBV清除的作用，而且这种促进清除的效果是通过益生菌改变肠道菌群来实现的，有望在临床治疗乙肝的策略中开拓新的局面。

Description

一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学及免疫学技术领域，特别是涉及一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，是目前世界上最常见的流行性病毒之一。HBV慢性感染与肝硬化及肝癌关系密切，是肝细胞肝癌(HCC)最为重要的诱发因素。血清学证据证实全球人口中有30％曾感染过HBV，其中约2.5亿人是HBV慢性感染者。清除慢性感染的HBV是从根本上治愈HBV相关肝细胞肝癌的关键，也是目前HCC临床治疗的难点。

现常用的乙肝抗病毒药物一共有两大类，共五种，分别是干扰素类(普通干扰素、长效干扰素)和核苷类(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦)。自1997年，第一种具有抗HBV活性的口服抗病毒药物拉夫米定投入使用并取得了良好的治疗效果，随后恩替卡韦和替诺福韦等更高抗性的药物也相继问世，长期口服抗病毒药物有效的抑制了HBV活性，降低了肝硬化及肝癌的发病率。但是同时也伴随着多种缺点，首先，这些抗病毒药物仅对少数HBV患者有效，如有明显病毒血症、高水平ALT和肝脏纤维化的患者；其次，治疗成本较高且可能产生病毒抗性；最后，目前尽管口服抗病毒药具有公认的安全性和耐受性，但长期使用仍可能导致一些高危人群的累积毒性，如恩替卡韦与临床前研究中的致癌作用有关。

治疗乙肝除了抗病毒药物之外，还有其它多种策略，例如，TLR7激动剂GS-9620、PD1和PD-L1抑制剂等调节固有免疫和适应性免疫细胞抗HBV；NVR3-778、GLP-2、ALN-HBV等多种小分子药物抑制HBV复制周期；以及利用siRNA沉默HBV基因的转录产物进而阻断蛋白合成。但是，这些治疗策略的效果均不理想，相对于乙肝难以治愈的现状，通过乙肝疫苗预防乙肝仍是目前的主要手段。因此，探索新的、安全的、经济的、耐受性良好的治疗手段仍迫在眉睫。

已有研究表明，在影响肝炎发展和预后的众多因素中，肠道菌群平衡起着非常重要的作用，临床研究发现，HBV患者的肠道菌群与健康人相比发生了显著的改变。但目前的研究主要集中在肠道菌群平衡与肝炎发展及预后的关系上，而对于如何通过外源益生菌清除乙型肝炎病毒目前尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及应用。本发明的益生菌组合物能够通过干预肠道菌群以促其对HBV的清除，实现对乙肝的治疗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供益生菌组合物在制备促进乙型肝炎病毒清除的产品中的应用；

所述益生菌组合物选自：双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌中的一种或多种。

作为一种优选的方案，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份、乳杆菌4-6份、大肠杆菌1-3份和粪肠球菌2-4份组成。

作为另一种优选的方案，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份和大肠杆菌1-3份组成。

上述的益生菌组合中，所述双歧杆菌包括但不限于：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)或长型双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

所述的乳杆菌包括但不限于：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。

所述的大肠杆菌优选为尼氏大肠杆菌。

优选的，所述益生菌组合物中的益生菌均为活菌；进一步的，所述益生菌组合物中的活菌含量不低于1×10⁷CFU/g。

优选的，所述益生菌组合物是有效剂量益生菌作为活性成分制成的活菌制剂。

所述产品包括：药物、食品或保健品。

本发明的第二方面，提供一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物，所述益生菌组合物选自：双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌中的一种或多种。

优选的，上述益生菌组合物中，活菌含量均不低于1×10⁷CFU/g。

本发明的第三方面，提供一种促进乙型肝炎病毒清除的药物制剂，所述药物制剂由上述的益生菌组合和药学上可接受的辅料制成。

所述药物制剂的剂型是口服制剂。

进一步的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、滴丸剂、凝胶剂或散剂。

所述药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料，优选为微晶纤维素、甜菜碱、淀粉、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。

本发明的第四方面，提供上述益生菌组合和/或药物制剂在调节动物肠道菌群中的用途。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“动物”所指的动物种类不受特别限制，该动物可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠、人，最优选人。

本发明的第五方面，提供一种治疗乙型肝炎的方法，该方法包括给予面临乙型肝炎风险或经诊断患有乙型肝炎的受试者有效量的上述益生菌组合。

本发明的有益效果：

本发明从调节乙型肝炎病毒患者肠道菌群平衡出发，筛选出了能促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物，并通过体外动物实验验证了本发明的益生菌组合在血清HBsAg水平、血清HBV DNA水平、肝组织pgRNA及cccDNA水平，均表现出显著促进HBV清除的作用，可以用于乙肝的治疗，与现有治疗乙肝的策略相比，采用本发明的益生菌组合进行治疗，安全经济并具有良好的耐受性，对于临床治疗乙肝具有重要意义。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：益生菌活性的验证结果；图中，(a)PBS、(b)益生菌A、(c)益生菌B涂板结果图。

图2：整体实验流程图。

图3：益生菌组合物促进HBV清除的效果图；图中，(a)血清HBsAg水平(b)血清HBVDNA水平(c)肝组织pgRNA水平(d)肝组织cccDNA水平。

图4：高通量测序中PCA分析益生菌改变肠道菌群的结构图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前的研究主要集中在肠道菌群平衡与肝炎发展及预后的关系上，而对于如何通过外源益生菌清除乙型肝炎病毒目前尚未见报道，基于此，本申请提出了一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物及其应用。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份、乳杆菌4-6份、大肠杆菌2-4份和粪肠球菌1-3份组成。

在本申请的另一种实施方案中，提供了一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份和大肠杆菌2-4份组成。

本申请还通过体外动物实验验证了上述实施方案中的益生菌组合物干预对于HBV小鼠(尾静脉高压pAAV/HBV1.2质粒)清除HBV能力的影响，结果表明，上述的益生菌组合在血清HBsAg水平、血清HBV DNA水平、肝组织pgRNA及cccDNA水平，均表现出显著促进HBV清除的作用。由此提出了上述益生菌组合物在制备促进乙型肝炎病毒清除的药物中用途。

需要说明的是，肠道菌群是一个大的生态系统，肠道菌群平衡的调节是目前研究的难点所在，通过外源加入益生菌来调节肠道菌群平衡，进而促进对体内乙型肝炎病毒的清除更是目前技术上的空白。因为外源加入益生菌要发挥作用必须达到足够的活性菌数量，益生菌的活性问题也限制了益生菌的广泛应用；另一方面，由于肠道菌群是一个大的生态系统，若盲目的采用外源益生菌的加入进行调节，很容易引起新发菌群的失调。本申请通过反复的试验，对益生菌的种类选择和用量复配进行考察，研究发现，相较于其他的益生菌或者其组合，采用本申请的益生菌组合物能够恢复肠道菌群平衡，促进乙型肝炎病毒的清除，同时不会引发新的菌群失调。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例和对比例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

本发明实施例中所用到的益生菌均为常规的市售产品，例如可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买得到；或者从益生菌生产厂家购买得到。

实施例1：促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物

由两歧双歧杆菌8份、嗜酸乳杆菌5份、尼氏大肠杆菌1份和粪肠球菌3份组成；该益生菌组合物命名为益生菌A(Probiotic A)。

上述益生菌组合物中的益生菌均为活菌；活菌含量不低于1×10⁷CFU/g。

实施例2：促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物

由两歧双歧杆菌8份、尼氏大肠杆菌1份组成；该益生菌组合物命名为益生菌B(Probiotic B)。

上述益生菌组合物中的益生菌均为活菌；活菌含量不低于1×10⁷CFU/g。

试验例1：本发明的益生菌组合物对HBV清除作用的考察

1.试验方法：

将实施例1和实施例2制备的益生菌组合物用无菌PBS稀释后，按一定剂量灌胃给尾静脉高压pAAV/HBV1.2质粒构建的HBV小鼠，通过检测血清HBsAg、HBV DNA等水平考察本发明的益生菌组合物对HBV的清除作用。具体方法如下：

(1)准备益生菌悬液：

在超净台中，将益生菌组合物用无菌1×PBS稀释至1×10⁷CFU/ml，分装至1.5mlEP管中，在4℃保存备用。

(2)验证益生菌活性：

将益生菌悬液稀释后涂布于LB平板中，每个平板中涂约50-100CFU；37℃、厌氧培养18h左右，观察LB平板中菌落的有无及数量；若有菌落则证明益生菌为活菌可用于灌胃，若菌落数目可达100CFU则证明灌胃剂量合适。

(3)动物试验：

动物试验的试验流程图如图2所示。

1)由于小鼠肠道菌群在其6周左右即达到稳态，故在小鼠3周时即灌胃益生菌干预小鼠肠道菌群，随后再尾静脉高压pAAV/HBV1.2质粒以构建HBV小鼠模型。

2)将3周龄、雄性C57BL/6J小鼠分为两组，一组为Control组，灌胃1×PBS；另一组为Probiotic组，灌胃益生菌，灌胃剂量均为100μl/mice。

3)持续灌胃2周后，即小鼠5周龄时进行尾静脉高压pAAV/HBV1.2质粒以构建HBV小鼠模型，高压剂量为10μg质粒稀释于小鼠体重8％的1×PBS中，并在5秒内完成尾静脉高压注射。

4)此后仍每天持续灌胃，持续6周，并且每周收集一次血清、粪便，尾静脉高压一周后的血清或粪便命名为1wpi(weeks postinjection)并依次类推。

5)血清收集方法：小鼠内眦采血约100-200μl，静置30min后，12000rpm，5min，吸取血清至一新1.5ml EP管，可收集约50-100μl血清，存于-80℃，血清应避免反复冻融。

6)粪便收集方法：在超净台中收集粪便，将小鼠置于鼠笼中，牙签采集小鼠排出的粪便于无菌1.5ml EP管中，收集约200mg粪便后将EP管置于冰上，再收集下一只小鼠粪便，最终将粪便存于-80℃，并避免反复冻融。

采用ELISA检测血清HBsAg：

酶联免疫法检测血清HBsAg的原理是在微孔条上预包被纯化的乙肝表面抗体(HBsAb)，配以酶标记抗体(HBsAb-HRP)及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测血清HBsAg。具体方法如下：

1)将血清用1×PBS稀释，不同时间点的血清按不同的稀释倍数稀释使最终的OD450-OD630数值处于标准曲线范围之内，以便于计算准确的HBsAg浓度。

2)平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温，取出所需数量微孔板，剩余者使用自封袋封存。

3)配液：浓缩洗涤液配制前使结晶充分融化并摇匀，将其和蒸馏水按1:19稀释后方可使用。

4)编号：取所需数量微孔条固定于支架。

5)稀释：每孔加入20μl样品稀释液。

6)加样：分别在相应孔中加入100μl阴、阳性对照血清或待测样本。

7)温育：37℃温育60min。

8)加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50μl。

9)温育：37℃温育30min。

10)洗涤：用洗涤液洗涤5次，每次洗涤应保持30-60秒的浸泡时间，洗涤后扣干。

11)显色：每孔加底物A、B各50μl，轻拍混匀，37℃暗置30min。

12)终止：每孔加入终止液50μl，轻拍混匀。

13)测定：终止反应后，用酶标仪双波长450nm/630nm测定各孔OD值，并根据标准曲线计算出相应HBsAg浓度。

qPCR检测血清HBV DNA：

使用乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)实现血清中HBVDNA的定量检测；首先采用磁珠法纯化技术实现病毒核酸纯化，样本前处理液将样本中的病毒颗粒富集，然后裂解液将病毒颗粒裂解，释放出病毒核酸，磁珠表面具有大量的羧基修饰，经RM活化液活化，这些羧基会吸附蛋白质杂质而不会吸附核酸，因此可将核酸分离纯化；PCR荧光探针法采用PCR反应液扩增HBV基因组目的片段，扩增反应同时将特异性荧光探针水解而释放发光基团，通过检测及分析自由发光基团受激光产生的荧光信号可实现对HBV DNA的检测和定量。具体方法如下：

1)在1.5ml EP管中加入100μl样品前处理液、100μl待测血清样本(对照品、定量标准品视作样品同样处理)，振荡混匀；

2)15000g 4℃离心10min，吸弃上清(离心时注意固定离心管方向、吸弃上清时尽可能不碰沉淀)；

3)加入25μl裂解液，彻底振荡混匀，100℃干浴或沸水浴10min；

4)15000g 4℃离心10min；

5)配制qPCR反应体系(PCR反应液29.6μl，活化液15μl，Taq酶0.4μl，UNG酶0.06μl)，充分混匀，在8联排中每孔加入22.5μl上述配制的溶液，再加入第4)步中上清2.5μl，qPCR扩增条件为37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃40s，45个循环；荧光信号收集设置在60℃，反应体系为25μl。

PCR检测肝组织cDNA的pgRNA水平：

具体方法如下：

1)利用Trizol一步法提取肝组织RNA，首先将组织样品按50-100μg/ml加入Trizol，利用电动匀浆器匀化组织；

2)室温放置5min，加200μl氯仿，充分振荡15s；

3)室温放置2-15min，4℃，12000rpm，离心15min；

4)离心后混合物将会出现分层现象，分为三层：底层是氯仿层，中间层是DNA和蛋白质的白色云雾层，上层是水相层含有RNA；

5)吸取上层水相于另一新1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；

6)室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min；

7)小心吸弃上清，在EP管底部形成的白色沉淀即为RNA，加入1ml冷的含DEPC的75％乙醇，洗涤沉淀；

8)4℃，12000rpm，离心5min；

9)弃乙醇，室温干燥，加20-30μl 1％DEPC水充分溶解，测量RNA浓度及纯度，存于-80℃或立即进行逆转录实验；

10)将提的RNA逆转录为cDNA，首先在冰浴的1.5ml EP管中加入1μg RNA，1μlOligo(dT)₁₈primer，无核酸酶的水定量至12μl，混匀；

11)65℃水浴5min，瞬离后冰上静置；

12)再在管中加入5×Reaction Buffer 4μl，Ribolock RNase Inhibitor 1μl，10mM dNTP Mix 2μl，RevertAid M-MuLV RT 1μl，混匀；

13)42℃水浴60min；

14)70℃水浴5min终止反应，cDNA可暂存于-20℃；

15)以逆转录获得的cDNA为模板，扩增actin及pgRNA，扩增体系均为25μl(2×PCRmix 12.5μl，cDNA 1μl，上、下游引物各0.5μl，ddH₂O 10.5μl),扩增条件为(95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，28个循环；72℃5min；4℃保存)；

16)配制1％琼脂糖凝胶，将PCR产物进行电泳，110V 30min，在琼脂糖凝胶成像仪中成像。

qPCR检测肝组织DNA的cccDNA水平：

具体方法如下：

1)利用试剂盒提取肝组织中DNA，首先取米粒大小肝组织加入200μl缓冲液GA，20μl Proteinase K溶液，混匀；

2)56℃水浴4h或过夜(可适当将组织捣碎)；

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬离以去除管盖内壁的水珠；

4)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)；

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中，重复此操作一次；

8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液；

9)将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl双蒸水，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)检测所得DNA样品的浓度和纯度，可放于-20℃冰箱保存；

12)检测cccDNA前，所得样品中需要加入Plasmid-safe TM ATP-Dependent DNase(PASD)酶(Epicentre)(此酶能够有效的降解非完整双链的DNA，提高HBV cccDNA的含量)，反应体系为(25mM ATP 2μl，10×Reaction Buffer 5ul，Plasmid-safe DNase(10U)1ul，DNA 2ug，双蒸水补齐至50μl)，37℃水浴1h，70℃水浴30min终止反应，保存于-20℃冰箱；

13)以酶消化处理的DNA为模板，qPCR扩增cccDNA，以未处理的DNA为模板扩增β-globin(β-globin是一种管家基因，将cccDNA以β-globin为内参进行标化)扩增体系均为20μl(2×qPCR mix 10μl，cDNA 1μl/1μg，上、下游引物各0.5μl，ddH₂O补齐至20μl),扩增条件为(95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，28个循环；72℃5min；4℃保存)。

提取粪便基因组DNA用于高通量测序检测粪便菌群：

具体方法如下：

1)称取粪便样本180-220mg至2ml离心管中，并将管子置于冰上；

2)向样本中加入1.4ml缓冲液GSL，间歇振荡1min至样本混匀；

3)70℃孵育5min；

4)涡旋15s，12000rpm离心1min，转移上清液1.2ml至新的2ml离心管；

5)加入一个抑制剂吸附片InhibitEX，振荡至吸附片彻底打开重悬，室温孵育1min，使吸附片能充分作用；

6)12000rpm离心3min，将所得上清液转移至新的1.5ml离心管，可重复离心一次；

7)转移所得上清液200μl至新的1.5ml离心管，加入15μl Proteinase K；

8)加入200μl缓冲液GB，涡旋15s；

9)70℃孵育10min；

10)加入200μl无水乙醇，涡旋混匀；

11)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中；

12)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中；

13)向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CR2放入收集管中，重复洗涤一次；

14)将吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

15)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl双蒸水，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

16)采用高通量测序检测粪便菌群，利用PCA分析益生菌组合对肠道菌群的改变。

2.试验结果：

(1)益生菌活性的验证结果：

益生菌的涂板结果如图1所示，由图1可以看出：涂布益生菌A及益生菌B的平板均有菌落生长且菌落数目可达100CFU，故两种益生菌均为活菌可用于灌胃。

(2)血清HBsAg水平、血清HBV DNA水平、肝组织pgRNA水平和肝组织cccDNA水平的检测结果：

血清HBsAg水平的检测结果如图3a所示，血清HBV DNA水平的检测结果如图3b所示，肝组织pgRNA水平的检测结果如图3c所示，肝组织cccDNA水平的检测结果如图3d所示。由上述检测结果可以看出：本发明的益生菌组合(益生菌A、益生菌B)均可应用于加快HBV的清除。

(3)高通量测序检测粪便菌群的实验结果：

高通量测序中PCA分析益生菌改变肠道菌群的结构图如图4所示，PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。通过分析不同样本群落组成可以反映样本间的差异和距离，PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映样品间差异的两个特征值。如样本物种组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。从图中可以发现益生菌组小鼠的粪便菌群与对照组小鼠的粪便菌群各自成群，说明益生菌的确改变了小鼠的肠道菌群，而且通过改变的肠道菌群促进HBV清除。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.益生菌组合物在制备促进乙型肝炎病毒清除的产品中的应用；其特征在于，所述益生菌组合物选自：双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份、乳杆菌4-6份、大肠杆菌1-3份和粪肠球菌2-4份组成。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌组合物由双歧杆菌5-10份和大肠杆菌1-3份组成。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌组合物中的益生菌均为活菌。

5.一种促进乙型肝炎病毒清除的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物选自：双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌中的一种或多种。

6.如权利要求5所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中，益生菌的活菌含量均不低于1×10⁷CFU/g。

7.一种促进乙型肝炎病毒清除的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂由权利要求5或6所述的益生菌组合物和药学上可接受的辅料制成。

8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型推荐采用口服制剂。

9.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自微晶纤维素、甜菜碱、淀粉、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。

10.权利要求5所述的益生菌组合和/或权利要求7所述的药物制剂在调节动物肠道菌群中的用途。