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CN107109383A - 不耐热性核酸外切酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与其至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段(i)通过在由10mM Tris‑HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；(ii)对于单链DNA基本上特异性；和(iii)具有3’‑5’核酸外切酶活性。本发明还提供了其中使用核酸外切酶或其酶促活性片段的从样品中去除单链DNA的方法，核酸扩增方法，逆转录方法和核酸序列分析方法。本发明还进一步提供了编码所述核酸外切酶或其酶促活性片段的核酸以及包含其的试剂盒或组合物。

Description

不耐热性核酸外切酶
技术领域
本发明涉及不耐热性核酸外切酶及其从含有生物分子的样品中去除单链DNA的用途，所述生物分子特别是核酸扩增或逆转录反应的产物(例如双链DNA、RNA和DNA:RNA双链体)。本发明因此可特别视为涉及通过去除单链DNA来提纯含有双链DNA、RNA和/或DNA:RNA双链体的样品。更具体地，本发明涉及从核酸扩增或逆转录反应的产物中去除过量寡脱氧核糖核苷酸引物。从核酸扩增反应的产物中去除过量寡脱氧核糖核苷酸引物可增强这种产物的下游序列分析，因为降低了来自过量寡脱氧核糖核苷酸引物的干扰。本发明因此还涉及用于最佳化核酸扩增或逆转录反应产物的序列分析(例如通过核酸测序或寡核苷酸探针阵列)的方法。本发明还提供了用于最佳化未得自核酸扩增反应的核酸的序列分析的方法。
背景技术
核酸酶是破坏DNA或RNA聚合物中的糖-磷酸盐主链中的磷酸二酯键的酶。核酸酶是非常多样化的一组酶。作用方式可以是高度特异性的或非常一般的，这取决于其靶功能。核酸酶可优选单链(ss)聚合物或双链(ds)聚合物。一些核酸酶在特定核苷酸序列处切割(例如限制性核酸内切酶)，而其他核酸酶在不依赖于核苷酸序列的聚合物中的位置处切割。在细胞中，核酸酶具有各种功能，并且涉及DNA复制、重组、突变、转录和修复以及分解RNA和DNA的冗余小片。核酸酶也可在宿主防御机制中发挥作用。
所有核酸酶可基于其催化机制涉及两个、一个还是零个金属离子分为三个主要类别(双金属离子依赖性、单金属离子依赖性和金属不依赖性核酸酶超家族)。每个类别包括许多不同的家庭和超家族。关于核酸酶分类的更多细节，参见Yang,W.,2011,"Nucleases:diversity of structure,function and mechanism."Q Rev Biophys 44(1):1-93。
基于底物偏好，核酸酶可分类为脱氧核糖核酸酶(DNA酶)或核糖核酸酶(RNA酶)，即分别切割DNA或RNA的磷酸二酯键的酶。基于DNA或RNA聚合物内的切割键的位置，核酸酶还可分类为核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶在聚合物内的位置处切割DNA或RNA的磷酸二酯键，而核酸外切酶涉及修剪RNA和DNA聚合物的末端，切割链中最外面的磷酸二酯键。核酸外切酶还可通过5’至3’相对于3’至5’极性分成两组。核酸酶还可展示在单链和双链核酸之间的特异性。特定的核酸酶可以是严格单链特异性、单链优先、严格双链特异性、双链优先或切割两者的核酸酶。
许多核酸外切酶是已知的，其中大肠杆菌(Escherichia coli)酶是得到最充分表征的酶。核酸外切酶的共同特征是它们在释放单核苷酸的单一结合事件中降解高达1000个核苷酸的高持续合成能力。核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶VII(ExoVII)和RecJ核酸外切酶均被报道为涉及DNA修复中的ssDNA特异性核酸外切酶。然而，它们的作用极性不同。ExoI具有3’至5’核酸外切酶活性，而RecJ仅具有5’至3’活性。与其他核酸外切酶形成对比，ExoVII具有5'至3'和3'至5'核酸外切酶活性两者。
核酸例如DNA和RNA中的核苷酸序列的测定已成为现代分子生物学的重要目标。通过分析这样的序列，可获得关于核酸源的信息。例如，某些进化上可变的遗传元件的核苷酸序列可提供关于它来源于其的生物的身份的指示。相应地，检测携带样品中的特定微生物特征性核苷酸序列的核酸可指示样品中微生物的存在或甚至定量样品中这种生物的量。序列分析还可帮助高等生物的分类学分类，这在诸如农业和兽医学的技术领域中可能是重要的。在人中，核苷酸序列分析可鉴定个体及其谱系，因此具有法医应用，并且可鉴定医学或生理相关的基因型，例如突变。靶细胞或细胞群(例如组织、肿瘤或培养物)的RNA转录物的测序可获得关于靶的转录组的信息，其依次又可在医学和科学领域中具有许多应用。还可获得携带独特核苷酸序列的基于核酸的身份标签，其检测需要分析标签的核苷酸序列。在其他代表性应用中，技术人员可能希望确定他/她正在其中工作的核酸的核苷酸序列，可能是为了证实操作已成功或理解新型分子的构成。
核酸序列分析可采用测序技术的形式。桑格双脱氧核苷酸测序方法是用于测序核酸的众所周知和广泛使用的技术。然而，最近以来，所谓的“下一代”或“第二代”测序方法(提及作为“第一代”方法的桑格双脱氧核苷酸方法)已变得普遍。这些较新的技术的特征在于高通量，例如由于使用平行的例如大规模平行测序反应，或通过耗时较少的步骤。不同的高通量测序方法提供单分子测序，并且使用诸如焦磷酸测序、可逆终止子测序、通过连接的可切割探针测序、通过连接的不可切割探针测序、DNA纳米球和实时单分子测序的技术。
核酸序列分析还可采取基于寡核苷酸杂交探针的方法的形式，其中通过检测探针与其靶之间的特异性杂交事件来证实靶核苷酸序列的存在。在这些方法中，寡核苷酸探针通常作为较宽阵列例如固定的核酸微阵列的部分提供。
进一步的方法是可获得的并且可在将来开发，但作为共同的主题，通常(虽然不是必需的)各自对在核酸扩增反应中扩增或通过逆转录(RT)合成的核酸执行。通常需要扩增以确保存在足够的核酸样品用于序列分析。这样的技术包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶扩增反应(LAR；也称为连接酶链反应(LCR))、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA；也称为3SR(自我持续序列复制))，并且可在逆转录反应之前。这些扩增技术和逆转录技术经常导致最终产物中存在非靶单链DNA，主要是因为最初经常供应过量的单链寡脱氧核糖核苷酸引物，而当聚合不完全时也可出现单链DNA扩增子。这种单链DNA通过下述干扰扩增产物的序列分析：与其他试剂例如寡核苷酸探针竞争，并本身经历测序，由此污染由反应输出的测序信息。这潜在地降低了分析的灵敏度和准确性。
为了减轻这种干扰，可用核酸外切酶处理核酸扩增反应或逆转录反应的产物，以降解单链DNA(例如未掺入的引物)。还能够包括实现任何未掺入的NTP(例如dNTP)的脱磷酸的处理，例如用碱性磷酸酶例如热不稳定性虾碱性磷酸酶(SAP)处理。目前来自大肠杆菌的核酸外切酶I(ExoI)是这种反应中最常用的核酸外切酶。核酸外切酶I反应通常通过将酶添加到核酸扩增或逆转录反应的产物中并在37℃下温育15分钟来执行。然而，为了防止核酸外切酶干扰下游过程，例如序列分析，通常需要使酶失活。使用来自大肠杆菌的常用核酸外切酶I，失活需要使酶在80℃下温育15-20分钟。长失活时间和相对高的失活温度使得该过程耗时并且对目的样品相对苛刻。
RecJ和ExoVII也已提议用于这种用途，但是不常用，因为RecJ具有低比活性，并且ExoVII由两种不同的多肽链组成。RecJ的推荐失活条件涉及在65℃下的20分钟温育，并且ExoVII的推荐失活条件涉及在95℃下的10分钟温育。
因此，需要提供能够在15分钟内特异性降解单链DNA和/或在65℃以下的温度下和/或在少于15-20分钟内可基本上不可逆地失活的酶。这种不耐热性(在本文中也可互换地称为热不稳定性(HL))酶将通过使其对目的样品分子显著地更加时间有效和更温和来改善分子生物学技术。
可能期望在其他背景下从样品中去除单链DNA。例如，为了消化核酸结合蛋白与之结合的单链DNA。在这些背景下，能够在少于15分钟内特异性降解单链DNA和/或在65℃以下的温度下和/或在少于15-20分钟内可基本上不可逆地失活的酶将有利地超过来自大肠杆菌的核酸外切酶I、RecJ和ExoVII，其原因与上文讨论的时间效率和温和加工相同。
目前已发现得自在冷水小生境中发现的希瓦氏菌属(Shewanella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、弧菌属(Vibrio)、嗜冷单胞菌属(Psychromonas)和莫里特拉菌属(Moritella)物种(例如Moritella viscosa和沃当弧菌(Vibrio wodanis))的大肠杆菌sbcB基因(其编码大肠杆菌核酸外切酶I)的同源物令人惊讶地具有这些有利的性质。
发明内容
因此，在第一个方面，本发明提供了核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与其至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段
(i)通过在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；
(ii)对于单链DNA基本上特异性；和
(iii)具有3’-5’核酸外切酶活性。
“至少约50％”意指序列同一性可以为至少49％、49.5％或49.9％。在优选实施例中，本发明的核酸外切酶具有与SEQ ID No.1至少60％、优选至少70％、80％、85％、90％或95％、例如至少98％或99％或99.5％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，核酸外切酶由SEQ ID No.1的氨基酸序列组成。本发明还提供了其酶促活性片段。
具有与SEQ ID No.1至少50％相同的氨基酸序列的核酸外切酶可得自在冷水小生境中发现的原核生物。“原核生物”意指缺乏细胞核的任何生物，即来自细菌和古细菌域的任何生物。优选地，生物是细菌。优选地，生物不是真核生物，例如分类在分类学动物界、植物界、真菌界或原生生物界中的生物。更优选地，生物选自希瓦氏菌属、嗜盐单胞菌属、弧菌属、嗜冷单胞菌属和莫里特拉菌属。
在某些实施例中，具有与SEQ ID No.1至少约50％相同的氨基酸序列的核酸外切酶可选自SEQ ID No.2(来自嗜盐单胞菌属物种的SbcB同源物)、SEQ ID No.3(来自沃当弧菌的SbcB同源物)、SEQ ID No.4(来自嗜冷单胞菌属物种的SbcB同源物)或SEQ ID No.5(来自Moritella viscosa的SbcB同源物)。
因此，在本发明的另一个方面，本发明提供了核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID No.1或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(b)SEQ ID No.2或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(c)SEQ ID No.3或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(d)SEQ ID No.4或与其至少65％相同的氨基酸序列，或
(e)SEQ ID No.5或与其至少65％相同的氨基酸序列，
其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段
(i)通过在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；
(ii)对于单链DNA基本上特异性；和
(iii)具有3’-5’核酸外切酶活性。
在本发明该方面的优选实施例中，核酸外切酶具有与SEQ ID No.1、2、3、4或5至少70％、优选至少80％、85％、90％或95％、例如至少98％或99％或99.5％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，核酸外切酶由选自SEQ ID No.1、2、3、4和5的氨基酸序列组成。本发明还提供了其酶促活性片段。
根据本发明的序列同一性百分比可使用广泛可用的算法中的任何来计算，例如，使用Clustal W2多重序列比对程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2)，使用缺省参数(DNA缺口开放罚分＝15.0；DNA缺口延伸罚分＝6.66；DNA矩阵＝同一性；蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA ENDGAP＝-1；蛋白质/DNA GAPDIST＝4)。
上述SEQ ID No的变体包括这样的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的一个或多个氨基酸已经历保守置换，或者已替换为所述一个或多个氨基酸的修饰形式或并非天然存在的氨基酸，例如所述一个或多个氨基酸的D异构体。优选地，这样的置换和修饰是沉默置换和修饰，因为本发明的核酸外切酶的修饰形式具有与未修饰形式相同的酶促和失活特征。
核酸外切酶是能够通过水解核苷酸间磷酸二酯键从多核苷酸链的一个或多个末端切割核苷酸，而无核苷酸序列特异性的酶。通常核酸外切酶从5'末端(并且因此表征为5'-3'核酸外切酶或具有5'-3'核酸外切酶活性)或3'末端(并且因此表征为3'-5'核酸外切酶或具有3'-5'核酸外切酶活性)切割核苷酸。根据本发明，核酸外切酶是3'-5'核酸外切酶。在一些实施例中，本发明的核酸外切酶基本上不具有针对单链DNA的5'-3'核酸外切酶活性，这意指在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以0.1至1.0U/μl的浓度，经过1小时温育过程，本发明的核酸外切酶展示针对单链DNA很少、可忽略不计或基本上没有的5'-3'核酸外切酶活性。以数字表示，在这种条件下小于10％、例如小于5％、4％、3％、2％或1％的单链DNA底物(例如约5pmol的所述底物，例如其可以是寡脱氧核糖核苷酸)将在5'-3'方向上降解。优选地，在这种浓度下将不存在可检测的5'-3'核酸外切酶活性。
技术人员将能够设计合适的测定来测量相对5'-3'和3'-5'核酸外切酶活性。例如，实例中描述的基于凝胶的核酸外切酶测定使用5’(FAM)标记的单链寡脱氧核糖核苷酸来监测从3'末端的降解，因为这种活性将获得从3'末端缩短的不同长度的可检测片段。从5'末端降解将仅获得单个标记的核苷酸。为了证实这些结果，可替代地可用3'标记的单链DNA底物执行相同的测定，并且应该观察到相反的凝胶图谱。
“对于单链DNA基本上特异性”意指本发明的核酸外切酶针对双链DNA的活性等于或小于在相同条件下针对等量单链DNA的活性的15％，所述相同条件例如在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中约0.1U/μl的酶浓度和约5pmol的核酸底物，伴随10分钟或更短的温育时间和约30℃的温育温度。在其他实施例中，本发明的核酸外切酶针对双链DNA的活性等于或小于在相同条件下针对等量单链DNA的活性的10％、例如等于或小于8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％。
在进一步更具体的实施例中，“对于单链DNA基本上特异性”还意指本发明的核酸外切酶针对单链RNA的活性等于或小于在相同条件下针对等量单链DNA的活性的15％，所述相同条件例如在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中约0.1U/μl的酶浓度和约5pmol的核酸底物，伴随10分钟或更短的温育时间和约30℃的温育温度。在其他实施例中，本发明的核酸外切酶针对单链RNA的活性等于或小于在相同条件下针对等量单链DNA的活性的10％、例如等于或小于8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％。
在某些实施例中，“针对单链DNA基本上特异性”意指本发明的核酸外切酶降解单链DNA，但是在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以约0.1U/μl的浓度，经过约10分钟温育过程，存在很少、可忽略不计或基本上无可检测的约5pmol合适双链DNA底物(例如双链寡脱氧核糖核苷酸)的降解。以数字表示，等于或小于15％、例如等于或小于10％、8％、5％、4％、3％、2％或1％的合适双链DNA底物将在这种条件下降解。优选地，在这种浓度下，不存在双链DNA底物的可检测的降解。
在进一步更具体的实施例中，“针对单链DNA基本上特异性”还意指本发明的核酸外切酶降解单链DNA，但是在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以约0.1U/μl的浓度，经过约10分钟温育过程，存在很少、可忽略不计或基本上无可检测的约5pmol合适单链RNA底物(例如单链寡核糖核苷酸)的降解。以数字表示，等于或小于15％、例如等于或小于10％、8％、5％、4％、3％、2％或1％的合适单链RNA底物将在这种条件下降解。优选地，在这种浓度下，不存在单链RNA底物的可检测的降解。
在某些实施例中，“针对单链DNA基本上特异性”还意指本发明的核酸外切酶降解单链DNA，但是在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以0.1至1.0U/μl(优选0.1U/μl)的浓度，经过1小时温育过程，存在很少、可忽略不计或基本上无可检测的非单链DNA核酸底物的降解。如本文使用的，术语“非单链DNA核酸底物”在一些实施例中指双链核酸例如双链DNA和单链非DNA核酸两者，尽管在优选实施例中，该术语仅指双链核酸，例如双链DNA。以数字表示，小于10％、例如小于5％、4％、3％、2％或1％(例如约5pmol)的合适非单链DNA底物(即双链核酸和/或单链非DNA核酸)在这种条件下将被降解。优选地，在这种浓度下，不存在可检测的非单链DNA核酸底物(即双链核酸和/或单链非DNA核酸)的降解。
技术人员将容易地能够设计实验来作出针对单链和双链核酸的相对核酸酶活性的比较。例如，测试中的核酸外切酶可与放射性标记的PCR产物的两份样品(例如约5pmol的所述PCT产物)一起温育，在一份样品中产物已在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mMKCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以0.1至1.0U/μl(优选0.1U/μl)的浓度变性10分钟(即单链)，并且在另一个样品中产物未变性(即双链)。随后可如实例8和9所述分析酸可溶性核苷酸的释放。
可替代地，测试中的核酸外切酶可与上述PCR产物样品(例如约5pmol的所述PCT产物)在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以0.1至1.0U/μl(优选0.1U/μl)的浓度一起温育一小时，并且随后在合适的电泳凝胶例如琼脂糖上分离产物。针对单链和/或双链核酸的活性可通过相对于未经处理对照的条带位置来观察。
另一种方法测量来自在5'末端用荧光团FAM(荧光素)和在3'末端用TAMRA标记的寡核苷酸的荧光的增加。当两个标记接近时，来自FAM的发射光被TAMRA吸收(淬灭)。测试中的核酸外切酶对寡核苷酸的切割导致FAM与TAMRA的分离和来自FAM的荧光的增加，所述荧光可在荧光计中用激发波长485nm和发射波长520nm进行测量。双链底物可通过将标记的寡核苷酸和与标记的寡核苷酸互补的第二寡核苷酸混合来制备。当然，可类似地使用其他合适的荧光团对。实例7更详细地描述了合适的测定。
包括在术语DNA内的是其保留磷酸二酯连接的脱氧核糖-磷酸盐主链的修饰。常见的单链DNA的例子包括寡脱氧核糖核苷酸引物和寡脱氧核糖核苷酸探针和DNA适体。核酸识别标签和标记也可以是单链DNA。单链DNA也在逆转录期间，以及在DNA复制和DNA转录期间的双链体解旋后出现。在核酸扩增反应和逆转录反应中，单链DNA可起于部分延伸的引物和任何过量的引物，所述引物未被延伸并整合到完全合成的双链体内。
在进一步的实施例中，本发明的核酸外切酶基本上不具有核酸内切酶活性。“基本上无核酸内切酶活性”意指在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中以0.1至1.0U/μl的浓度，经过1小时温育过程，本发明的核酸外切酶展示针对环状单链核酸或环状双链核酸很少、可忽略不计或基本上没有的核酸酶活性。以数字表示，在这种条件下，小于10％、例如小于5％、4％、3％、2％或1％(例如约5pmol)的单链或双链核酸底物被断裂(例如，成为寡核苷酸)。优选地，在这种浓度下，不存在可检测的核酸内切酶活性。
SEQ ID No.1-5的酶促活性片段和变体分别展示SEQ ID No.1-5的酶的酶促功能的至少70％、优选至少85％、更优选至少95％、且最优选至少99％。如其他地方所讨论的，可使用常规技术容易地评价核酸外切酶的活性。
在下文讨论中，提及本发明的核酸外切酶也是提及其酶促活性片段，除非上下文另有说明。
“基本不可逆地失活的”意指在指定时间和指定缓冲液条件下加热至指定温度时，酶至少90％失活，优选95％、98％、99％、99.5％或99.9％失活。失活百分比可方便地通过下述进行估计：在合适的缓冲液(例如Tris、HEPES、PBS)中，在合适的pH(例如pH 7.5)合适的温度(例如30℃)下，以及在Mg2+(例如5mM)的存在下，使适当标记的(例如5'FAM标记的)单链DNA样品(例如标准PCR引物，例如具有SEQ ID No.21-GCTAACTACCACCTGATTAC的核苷酸序列的脱氧核糖核酸引物)与失活的核酸外切酶或未失活的核酸外切酶一起温育30分钟；通过电泳在合适的凝胶(例如丙烯酰胺/脲凝胶)上分离反应产物，并在UV光下测量DNA条带的相对荧光强度，例如如实例5和6中所示。技术人员可设计替代方法来测量失活和未失活的核酸外切酶的相对活性，特别是可以使用由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mMMgCl2组成的缓冲液。
即使当反应混合物的温度回到室温时，本发明的核酸外切酶也无法恢复活性，即基本上不存在残留活性；具体地，小于10％、优选小于5％、2％、1％、0.5％或0.1％、最优选不残留可检测的核酸外切酶活性。
基本上不可逆的失活在指定的缓冲液条件下在以55℃或约55℃例如53至57℃的温度下的10分钟温育内出现。例如在约55℃下温育7、8或9分钟内。如实例5中所示，在其他实施例中，本发明的核酸外切酶在以55℃或约55℃例如53至57℃的温度下，在5分钟内例如在2、3或4分钟内，在指定的缓冲液条件下基本上不可逆地失活。在进一步的实施例中，本发明的核酸外切酶在以50℃或约50℃例如48至53℃的温度下，在10分钟内例如在7、8或9分钟内，在指定的缓冲液条件下基本上不可逆地失活。在再进一步的实施例中，本发明的核酸外切酶在以50℃或约50℃例如48至53℃的温度下，在5分钟内例如在2、3或4分钟内，在指定的缓冲液条件下基本上不可逆地失活。由SEQ ID No.1和4表示的核酸外切酶及其变体是这些后面实施例的例子。
在其他实施例中，本发明的核酸外切酶的基本上不可逆的失活在指定的缓冲液条件下在以80℃或约80℃例如70至90℃、75至85℃、78至82℃或79至81℃的温度下的1分钟温育内出现。例如，在约80℃下温育至少约30、40、50或55秒内。
当使用时，本发明的核酸外切酶可在更低的温度下或经过更短的时间基本上不可逆地失活，这取决于酶在其中使用的条件，例如在55℃下5分钟或在50℃下5至15分钟例如10至15分钟，但根据本发明，在指定的缓冲液条件下在约55℃下加热10分钟必须足以使酶基本上不可逆地失活。对于技术人员显而易见的是，对这两个参数之一的调整可通过调整另一个来补偿。例如，增加失活温度可允许减少温育的持续时间。相反，增加温育的持续时间可允许使用较低的失活温度。当然，如本领域技术人员显而易见和实例中所示的，当本发明的核酸外切酶用于本发明的方法中时，可使用长于10分钟的温育时间，并且可使用大于约55℃的失活温度，如果可行的话(例如，失活可在80℃下进行1分钟，在60℃下进行5至10分钟，在55℃下进行15分钟或在50℃下进行15分钟)。然而，根据本发明，如果在指定的缓冲液条件下在以55℃或约55℃的温度下温育10分钟，则核酸外切酶必须显示大量失活。
本发明的核酸外切酶的失活温度和时间应通过将核酸外切酶在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中温育进行评价。核酸外切酶应当以约0.1至1.0U/μl，优选0.1至1.5U/μl、0.1至5U/μl或0.1U/μl至10U/μl存在。
在最优选的实施例中，本发明的核酸外切酶可具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的氨基酸序列(或由其组成)。
在本发明的另一个方面，提供了具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的氨基酸序列(或由其组成)的核酸外切酶。完全由氨基酸序列定义意指上述特定功能特征不一定适用于该方面。然而，如实例中所示，这些特异性核酸外切酶中的每一种在本文所述的本发明的方法中具有实用性。
本发明的核酸外切酶可以修饰形式提供，例如作为具有在核酸外切酶的分离、增溶和/或纯化或鉴定过程中有用的氨基酸基序的融合蛋白提供。这种氨基酸基序(也称为蛋白质标签)包括但不限于多组氨酸(His)标签。本发明的加上多组氨酸标签的核酸外切酶的例子在SEQ ID No.11至15中显示。这样的酶构成本发明的进一步方面。
进一步的修饰包括将小化学基团引入多肽的可用原子，例如关于多肽的N和C末端的保护基团或非必需氨基酸残基的R基团。在其他实施例中，本发明的核酸外切酶可固定化在固体支持物上提供，所述固体支持物例如选自颗粒、小丸、珠、片、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管、芯片、微滴定条、载玻片、管、板或孔等。优选地，支持物是磁性的(优选顺磁性或超顺磁性的)，例如磁性颗粒，例如磁珠和颗粒。再进一步的修饰形式包括本发明的核酸外切酶的二聚体或三聚体。这样的实体在其单体组成中可是均相的或非均相的。
本发明还提供了编码本发明的核酸外切酶的核酸分子及其酶促片段。对应于SEQID No.1至5的氨基酸序列的核苷酸序列分别公开于SEQ ID No.6至10中，并且本发明的核酸可包含这些核苷酸序列。对应于SEQ ID No.11至15的氨基酸序列的核苷酸序列分别公开于SEQ ID No.16至20中，并且本发明的核酸可包含这些核苷酸序列。遗传密码的简并性意指SEQ ID No.6至10和16至20各自仅是分别编码SEQ ID No.1至5和11至15的氨基酸序列的许多可能的核苷酸序列中的每一个。相应地，本发明延伸至包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列是SEQ ID No.6至10和16至20的简并形式。本发明的核酸分子可是核酸载体，例如克隆载体或表达载体。优选的载体是与细菌和/或酵母细胞相容的质粒。
本发明的核酸外切酶的酶促活性和失活特征使得这样的酶尤其适合于从含有生物大分子的样品中去除单链DNA，所述生物大分子特别是核酸扩增或逆转录反应的产物，例如双链DNA、RNA和DNA:RNA双链体。
因此，在一个进一步的方面，本发明提供了从样品优选生物大分子的样品中去除单链DNA的方法，所述方法包括使样品与如上定义的核酸外切酶接触。
本发明的核酸外切酶因此用于降解样品中存在的单链DNA。特别地，该方法涉及在允许消化样品中存在的单链DNA的至少一部分的条件下，使样品与本发明的核酸外切酶接触，并且随后任选地加热样品以使所述核酸外切酶失活。这些消化和失活步骤通常是温育，并且在本文中特别是在实例中描述。实现样品中的单链DNA消化的合适温育条件是本领域已知的，并且可方便地包括在10至45℃下，例如在以20至40℃或约20℃至40℃或30℃下温育1至30分钟，例如1至20分钟、1至15分钟或1至10分钟，优选约5分钟或更少。如果使用在这些范围的较高端的温度，则温育的持续时间可在这些范围的较低端，并且反之亦然。失活条件可基于上文给出的这些参数的讨论。
“去除单链DNA”意指样品中的单链DNA的量减少到一定程度。包括其中单链DNA的量减少到可检测水平以下的实施例，以及其中单链DNA的量减少到更小但仍可检测的量的实施例。优选地，单链DNA的量被充分减少以改善如通过相关上下文所限定的样品的质量，例如其在核酸序列分析反应中的应用。以数字表示，样品中的单链DNA的量可减少至少10％、例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％或100％。实际上，根据本发明，从样品中去除单链DNA或减少样品中的单链DNA的量是降解样品中存在的单链DNA的至少一部分。术语“至少一部分”应当与前文一致加以解释。
在一个优选实施例中，样品是含有以下的制备物：目的核酸(例如DNA、RNA、PNA)，例如双链核酸或DNA:RNA双链体；目的蛋白质，例如重组产生的目的蛋白质，例如酶；碳水化合物聚合物；或脂质。可替代地，目的蛋白质可以是期望从原材料中纯化的分析物或其他蛋白质。目的蛋白质可以是抗体或抗体片段。蛋白质(例如抗体)可用于诊断或治疗方法中。因此，可使用上述方法以便确保诊断或治疗蛋白质不含污染性单链DNA，使得其可安全施用。目的蛋白质可以是DNA结合蛋白或与核酸特别是溶液中的单链DNA结合的其他蛋白质。相应地，制备物可来源于细胞裂解产物或组织样品或体液和/或可以是核酸扩增或逆转录反应的产物。本发明的方法因此可视为包括通过去除单链DNA来精制或富集包含双链DNA、RNA和/或DNA:RNA双链体的样品的方法。这种方法将包括使样品与如上文定义的核酸外切酶接触。
在优选实施例中，样品是核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物，并且因此本发明提供了从核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物中去除单链DNA的方法，所述方法包括使用如上文定义的核酸外切酶。该方法通常包括使核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物与如上文定义的核酸外切酶接触。
本发明的核酸外切酶因此用于降解存在于核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物中的单链DNA。特别地，该方法涉及在允许消化其中存在的单链DNA的至少一部分的条件下，使核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物与本发明的核酸外切酶接触，并且任选地加热混合物以使所述核酸外切酶失活。上文描述了消化和失活步骤的特征。
术语“核酸扩增反应”指用于增加核酸的靶序列或其互补序列的拷贝数的任何体外方法。优选地，扩增方法将涉及“热循环”，即涉及高温循环。扩增方法包括但不限于PCR及其修饰、3SR、SDA、LAR或LCR和LAMP及其修饰。PCR和LCR及其修饰是热循环方法。方法可导致靶序列的拷贝数的线性或指数增加。“修饰”包括但不限于实时扩增、定量和半定量扩增、竞争性扩增、热启动PCR等等。适当时，逆转录可与其他核酸扩增反应组合。
优选地，核酸扩增方法是基于使用寡核苷酸引物作为核酸合成的引发剂的方法，例如PCR、LAR、SDA、LAMP和NASBA。
取决于所选择的扩增方法，用于扩增反应的靶核酸可以是DNA或RNA。例如，对于PCR，靶是DNA，尽管当与逆转录步骤组合时，靶可视为RNA序列。3SR直接扩增RNA靶序列。
“逆转录”是其中单链RNA模板转录成互补单链DNA(cDNA)的过程。这些核酸链作为双链体存在直到应用变性条件。单链DNA随后还可用作模板，以在所谓的第二链cDNA合成步骤中形成双链cDNA。一些核酸聚合酶能够产生第一cDNA链并合成第二链以形成双链cDNA，而其他核酸聚合酶仅对于两个步骤中的一个是特异性的。
“核酸扩增反应的产物”因此视为包含从所讨论的反应的最终扩增步骤直接获得的组分中的基本上全部。可加入其他组分或某些组分可经历一定修饰或加工，但是组分中基本上无一或至少核酸组分中无一已被去除。优选地，核酸扩增反应的产物是最终扩增步骤的直接产物；然而，也可优选核酸扩增反应的产物经历处理以实现任何未掺入的NTP的脱磷酸，例如，在用本发明的核酸外切酶处理之前，用碱性磷酸酶优选不耐热性碱性磷酸酶，例如热不稳定性虾碱性磷酸酶(SAP)的处理。除非上下文另有说明，否则本文对NTP的提及具体包括对dNTP的提及。在其他实施例中，NTP的脱磷酸可在用本发明的核酸外切酶处理之后或与用本发明的核酸外切酶处理同时发生。有利的重组SAP可得自ArcticZymesTM AS。
相应地，从核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物中去除单链DNA的上述定义的方法还可包括使用碱性磷酸酶，优选不耐热性碱性磷酸酶，以在使用核酸外切酶去除单链DNA之前、与使用核酸外切酶去除单链DNA同时、或在使用核酸外切酶去除单链DNA之后，即在使扩增或逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之前、与使扩增或逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤同时、或在使扩增或逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之后，使任何未掺入的NTP脱磷酸。特别地，在这些方法中使用碱性磷酸酶涉及在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之前、与使所述产物与本发明的核酸外切酶接触同时、或在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之后，使碱性磷酸酶与扩增/逆转录反应的产物接触。
优选地，任何碱性磷酸酶处理可在任何热失活步骤之前。在其不进行的实施例中，可使用进一步的热失活步骤。
在结构方面，根据本发明的核酸扩增反应的产物将包含模板核酸和NTP，并且通常另外包含聚合酶和可部分延伸的至少一个寡核苷酸引物。另外通常地，大部分产物将由合适的核酸扩增缓冲液，例如如本文例示的缓冲液构成。优选的核酸扩增反应的产物包括这些元件中的全部。
在这些实施例中，适当时，本发明的处理去除(即降解)过量的未延伸的DNA引物、部分延伸的DNA引物、单链DNA模板、单链DNA扩增子、变性的DNA扩增子等等。
“逆转录反应的产物”应当根据核酸扩增反应的产物的定义来解释，记住逆转录反应可能仅具有一个RNA依赖性核酸聚合步骤，并且任选地，可具有一个或多个第二链cDNA合成步骤。优选地，本发明的核酸外切酶应用于其的逆转录反应的产物是包含cDNA:RNA双链体和/或双链cDNA的产物。
在本发明的一个进一步方面，本发明提供了核酸扩增方法，所述方法包括在使用如本文定义的核酸外切酶从核酸扩增反应的产物中去除单链DNA的最终扩增步骤之后的步骤。通常，去除单链DNA的步骤包括使核酸扩增反应的产物，优选最终扩增步骤的直接产物，与如本文定义的核酸外切酶接触。所述方法还可包括在最终扩增步骤之后，使用碱性磷酸酶优选不耐热性碱性磷酸酶的步骤，以在使用核酸外切酶去除单链DNA之前、与使用核酸外切酶去除单链DNA同时、或在使用核酸外切酶去除单链DNA之后，即在使扩增反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之前、与使扩增反应的产物与核酸外切酶接触的步骤同时、或在使扩增反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之后，使任何未掺入的NTP脱磷酸。特别地，在这些方法中使用碱性磷酸酶涉及在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之前、与使所述产物与本发明的核酸外切酶接触同时、或在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之后，使碱性磷酸酶与扩增反应的产物接触。
在本发明的一个进一步方面，本发明提供了逆转录的方法，所述方法包括在最终逆转录步骤和/或可能存在的最终第二链cDNA合成步骤之后，使用如本文定义的核酸外切酶从逆转录反应的产物中去除单链DNA的步骤。通常，去除单链DNA的步骤包括使逆转录反应的产物，优选最终逆转录步骤的直接产物，和/或可能存在的最终第二链cDNA合成步骤的直接产物，与如本文定义的核酸外切酶接触。优选地，这种产物将是包含cDNA:RNA双链体和/或双链cDNA的产物。所述方法还可包括在最终逆转录步骤和/或可能存在的最终第二链cDNA合成步骤之后，使用碱性磷酸酶，优选不耐热性碱性磷酸酶的步骤，以在使用核酸外切酶去除单链DNA之前、与使用核酸外切酶去除单链DNA同时、或在使用核酸外切酶去除单链DNA之后，即在使逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之前、与使逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤同时、或在使逆转录反应的产物与核酸外切酶接触的步骤之后，使逆转录反应的产物中的任何未掺入的NTP脱磷酸。特别地，在这些方法中使用碱性磷酸酶涉及在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之前、与使所述产物与本发明的核酸外切酶接触同时、或在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之后，使碱性磷酸酶与逆转录反应的产物接触。
本发明的核酸外切酶因此用于降解存在于核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物中的单链DNA。特别地，该方法涉及在允许消化其中存在的单链DNA的至少一部分的条件下，使核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物与本发明的核酸外切酶接触，并且任选地加热混合物以使所述核酸外切酶失活。上文描述了消化和失活步骤的特征。优选地，任何碱性磷酸酶处理可在热失活步骤之前。在其不进行的实施例中，可使用进一步的热失活步骤。
通常将逆转录与一个或多个核酸扩增反应组合。将多个核酸扩增反应组合成单个多级方案也是常见的。立即显而易见的是，这些多级方案中的每一部分可视为本发明的核酸扩增方法或逆转录方法本身，并且因此本发明的核酸外切酶可根据本发明用于这种多级方案的任何或所有部分中。
在本发明的一个进一步方面，本发明提供了最佳化核酸序列分析的方法，所述方法包括使用如本文定义的核酸外切酶从待分析的样品中去除单链DNA。该方法通常包括使样品与如本文定义的核酸外切酶接触。
优选地，在这个方面，样品是例如如上文定义的扩增反应的产物或逆转录反应的产物，但可使用其他样品，例如直接由生物材料制备的或含有生物材料的那些，所述生物材料例如微生物、体液、真核细胞、培养物、肿瘤和组织。优选地，样品是上述样品的至少部分纯化的核酸制备物，例如，DNA和RNA制备物。
术语“最佳化”包括核酸序列分析(例如核酸扩增或逆转录反应的产物)的准确度和/或灵敏度中的改善。根据本发明，这种改善至少部分是去除单链DNA的结果，所述单链DNA可干扰序列分析反应和/或与序列分析反应竞争，降低其对靶模板的有效性，和/或其本身被测序并因此造成系统中的背景噪声，从而使得对输出信号的分析较不敏感。
在本发明的一个进一步方面，本发明提供了核酸序列分析方法，所述方法包括在使用如本文定义的核酸外切酶从待分析的样品中去除单链DNA的分析步骤之前的样品制备步骤。该方法通常包括使样品与如本文定义的核酸外切酶接触。
在其中样品是扩增反应的产物或逆转录反应的产物的这些后面的方面，样品还可经历用碱性磷酸酶优选不耐热性碱性磷酸酶的处理，以使任何未掺入的NTP脱磷酸。因此，上述限定的核酸序列分析方法可包括在使用核酸外切酶去除单链DNA之前、与使用核酸外切酶去除单链DNA同时、或在使用核酸外切酶去除单链DNA之后，即在使待分析的样品与核酸外切酶接触的步骤之前、与使待分析的样品与核酸外切酶接触的步骤同时、或在使待分析的样品与核酸外切酶接触的步骤之后，使用碱性磷酸酶来使任何未掺入的NTP脱磷酸的进一步的样品制备步骤。特别地，在这些方法中使用碱性磷酸酶涉及在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之前、与使所述产物与本发明的核酸外切酶接触同时、或在使所述产物与本发明的核酸外切酶接触之后，使碱性磷酸酶与待分析的样品接触。
在这些后面的方面，本发明的核酸外切酶因此用于降解待分析的样品例如上述讨论的那些样品中存在的单链DNA。特别地，该方法涉及在允许消化其中存在的单链DNA的至少一部分的条件下，使样品与本发明的核酸外切酶接触，并且任选地加热混合物以使所述核酸外切酶失活。上文描述了消化和失活步骤的特征。优选地，任何碱性磷酸酶处理可在热失活步骤之前。在其不进行的实施例中，可使用进一步的热失活步骤。
优选地，在这些后面的方面，核酸序列分析是测序技术，例如桑格双脱氧核苷酸测序方法或者“下一代”或“第二代”测序方法(例如，涉及焦磷酸测序、可逆终止子测序、通过连接的可切割探针测序、通过连接的不可切割探针测序、DNA纳米球和实时单分子测序的那些)或基于寡核苷酸杂交探针的方法，其中通过检测探针及其靶之间的特异性杂交事件来证实靶核苷酸序列的存在。
核酸序列分析可提供在生物的基因分型中有用的信息，例如用于分类、鉴定、定量、预后、诊断和/或法医应用，或可用于细胞或细胞群的转录组的概况分析，例如用于预后、诊断和/或研究应用。本发明包括本文定义的核酸外切酶在本文所述的用于这种目的的方法中的用途。
本发明还提供了如本文定义的核酸外切酶从样品中且更具体地在本文所述的方法中去除单链DNA的用途。
适当时，本发明的核酸外切酶可从天然源中分离，例如，从上述生物的提取物中分离，或在宿主细胞中重组产生并且从中分离且纯化。本发明的核酸外切酶因此可以是重组酶，特别是分离的重组酶。在某些实施例中，核酸外切酶通过重组技术在宿主细胞中产生，所述宿主细胞不是或不来自与核酸外切酶在其中天然发现的那种相同的生物，即是异源宿主细胞。可替代地，无细胞表达系统可用于产生核酸外切酶。这些方法可导致改变的糖基化模式。
如本文所述的用于分离和纯化核酸外切酶或其酶促活性片段的方法代表本发明的一个进一步方面。因此，在这个方面，本发明提供了这样的方法，所述方法包括培养核酸外切酶在其中表达的细胞，并且随后从所述细胞和/或所述细胞已在其中进行培养的培养基中分离核酸外切酶。优选地，该方法包括在合适的异源宿主细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达所述核酸外切酶，并且随后从所述宿主细胞和/或所述细胞已在其中进行培养的培养基中分离核酸外切酶。所述核酸外切酶的表达可通过将编码所述核酸酶的表达载体掺入合适的宿主细胞内来实现，所述表达载体例如包含编码SEQ ID No.1至5或11至15的氨基酸序列中任何的核酸分子，例如包含SEQ ID No.6至10或16至20中任何的核苷酸序列的核酸分子。包含这些表达载体和核酸分子的宿主细胞由本发明包括。
核酸外切酶可使用本领域已知和文献中广泛描述的用于蛋白质的纯化技术中的任何或其任何组合从宿主细胞/培养基中分开或分离。这样的技术可包括例如沉淀、超滤、透析、不同层析技术例如凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、电泳、离心等。如上文讨论的，本发明的核酸外切酶可进行修饰，以携带氨基酸基序或其他蛋白质或非蛋白质标签，例如多组氨酸标签，以帮助分离、增溶和/或纯化或鉴定。本发明的加上多组氨酸标签的核酸外切酶的例子在SEQ ID No.11至15中叙述。
同样地，宿主细胞的提取物也可使用本领域众所周知的技术例如均质化、冻融等进行制备，并且从该提取物中可纯化本发明的核酸外切酶。
本发明的核酸外切酶的冷库贮存可方便地用5mM Tris/HCl，pH7.5(在25℃下)，250mM NaCl，5mM MgCl2，0.25mM EDTA，50％甘油的贮存缓冲液来实现，尽管可使用其他缓冲液。
本发明还提供了包含至少根据本发明的核酸外切酶或编码根据本发明的核酸外切酶的核酸的试剂盒。试剂盒还可含有必需试剂、缓冲液、酶等中的一些或全部，以进行核酸扩增和/或逆转录和/或序列分析反应。更特别地，试剂盒可含有核苷酸三磷酸(包括用于SDA的dNTPαS)、寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、逆转录酶、DNA聚合酶优选热稳定性聚合酶例如Taq聚合酶或Bst聚合酶(及其热启动形式)，或在LAR的情况下，DNA连接酶(优选热稳定性DNA连接酶，例如或在US6280998中公开的从强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)中分离的那种)、碱性磷酸酶优选热不稳定性碱性磷酸酶(例如SAP)、或限制性酶(优选热稳定性限制性酶，例如BsoB1)。包含本发明的核酸外切酶和碱性磷酸酶优选不耐热性碱性磷酸酶(例如SAP)例如本文公开的那些中的任何的试剂盒是值得注意的。
本发明还提供了包含本发明的核酸外切酶和进行核酸扩增和/或逆转录和/或序列分析反应和方法的必需试剂中一种或多种例如上文所述的那些组分的组合物。通常这种组合物是水性的并用标准缓冲液如Tris、HEPES等缓冲。本发明还提供了包含在缓冲液中的本发明的核酸外切酶的组合物。
附图说明
本发明现在将参考以下附图通过非限制性实例进行描述，在所述附图中：
图1显示了希瓦氏菌属物种核酸外切酶的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.6)。
图2显示了嗜盐单胞菌属物种核酸外切酶的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ IDNo.2和SEQ ID No.7)。
图3显示了沃当弧菌核酸外切酶的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.8)。
图4显示了嗜冷单胞菌属物种核酸外切酶的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ IDNo.4和SEQ ID No.9)。
图5显示了Moritella viscosa的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.5和SEQID No.10)。
图6显示了用ClustalW多重比对工具生成的SEQ ID No.1-5与大肠杆菌核酸外切酶I(SEQ ID No.22)的氨基酸序列的比对。共有序列显示于底部。*，所有序列中的相同残基；序列中高度保守的残基；序列中弱保守的残基。
图7显示了希瓦氏菌属核酸外切酶的His标签形式的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.11和SEQ ID No.16)。
图8显示了嗜盐单胞菌属核酸外切酶的His标签形式的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.12和SEQ ID No.17)。
图9显示了沃当弧菌核酸外切酶的His标签形式的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.13和SEQ ID No.18)。
图10显示了嗜冷单胞菌属核酸外切酶的His标签形式的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.14和SEQ ID No.19)。
图11显示了Moritella viscosa核酸外切酶的His标签形式的氨基酸和核苷酸序列(分别为SEQ ID No.15和SEQ ID No.20)。
图12显示了多个聚丙烯酰胺凝胶的图像，在其上已分离了单链DNA寡核苷酸和各种热不稳定性(HL)核酸外切酶之间的各种反应的产物，从而指示酶针对单链DNA的活性。缓冲液条件如实例2中所述。(-)Cont-阴性对照。图12a：在不同温度(20至37℃)下在不同时间间隔(1至10分钟)下的HL-ExoI(Ha)活性。不同的稀释因子取决于温育时间(4x共1至5分钟和10x共10分钟)。图12b：在不同温度(20至37℃)下在不同时间间隔(1至10分钟)下的HL-ExoI(Ps)活性。不同的稀释因子取决于温育时间(3x共1分钟，8x共5分钟和12x共10分钟)。图12c：在不同温度(20至37℃)下在不同时间间隔(1至10分钟)下的HL-ExoI(Sh)活性。不同稀释度(4x共1分钟和5分钟，以及10x共10分钟)。图12d：在不同温度(20至37℃)下在不同时间间隔(1至10分钟)下的HL-ExoI(Mv)活性。不同的稀释因子取决于温育时间(1x共1分钟和5分钟，以及2x共10分钟)。
图13显示了聚丙烯酰胺凝胶的图像，在其上已分离了单链DNA寡核苷酸和各种热处理的核酸外切酶之间的各种反应的产物，从而指示酶针对单链DNA的活性。缓冲液条件如实例3中所述。(-)Cont-阴性对照。四种商购可得的大肠杆菌ExoI酶(ExoI A-D)、一种商购可得的酶促PCR清除试剂盒和HL-ExoI(Sh)在易于热失活方面进行比较。在底物添加和残留活性温育前，使样品在80℃下温育1分钟。
图14显示了来自实例4的测序反应的代表性测序结果。图14a：基于GoTaq PCR缓冲液–ExoSAP-IT的反应对应于实例4中所述的30分钟方案，并且HL-ExoI(Sh)/SAP对应于实例4中所述的5分钟方案。图14b：分别如图14a，但是使用TEMPase Extra PCR缓冲液代替GoTaq。图14c：如图14a，但是ExoSAP-IT和HL-ExoI(Sh)/SAP对应于实例4中所述的5分钟方案。
图15显示了多个聚丙烯酰胺凝胶的图像，在其上已分离了单链DNA寡核苷酸和本发明的HL-ExoI之间的各种反应的产物，从而指示在针对单链DNA的热处理之后的残留酶活性。缓冲液条件如实例5中所述。15a：HL-ExoI(Ha)；15b：HL-ExoI(Sh)；15c：HL-ExoI(Ps)；15d：HL-ExoI(Mv)；15e：HL-ExoI(Vw)。(-)Cont-阴性对照。在底物添加和残留活性温育(其在30℃下执行30分钟，并且随后在95℃下执行2分钟)前，使样品在不同温度(40℃-60℃)下温育5分钟、10分钟或15分钟。
图16显示了多个聚丙烯酰胺凝胶的图像，在其上已分离了单链DNA寡核苷酸和本发明的HL-ExoI之间的各种反应的产物，从而指示测试ExoI在增加稀释度下针对单链DNA的活性。缓冲液条件如实例6中所述。16a：HL-ExoI(Ha)；16b：HL-ExoI(Sh)；16c：HL-ExoI(Ps)；16d：HL-ExoI(Mv)；16e：HL-ExoI(Vw)。(-)Cont-阴性对照。100％-未稀释的酶，10％-酶稀释10倍，1％-酶稀释100倍，0.1％-酶稀释1000倍，0.01％-酶稀释10,000倍。使样品在30℃下温育30分钟，并且随后在95℃下温育2分钟。
图17显示了HL-ExoI(Ha、Ps、Sh、Vw、Mv)以及大肠杆菌ExoI的3'至5'方向性。测定条件在实例11中描述。当FAM在5'末端处进行标记时，可见部分暗淡和强烈的中间产物条带的梯，指示ExoI从3'末端降解底物。当寡核苷酸在3'末端处进行FAM标记时，立即切断荧光团，仅生成3'FAM单体。(-)Cont-阴性对照。ExoI-大肠杆菌ExoI。
图18显示了在的分辨率下与ssDNA(dT13)复合的HL-ExoI(Mv)的晶体结构。实验设置在实例12中描述。活性位点残基Asp23、Glu25和Asp194指示为棒。在HL-ExoI(Mv)的三维结构中，dT13的3'-末端清楚地位于酶的活性位点中。
图19显示了在其上比较HL-ExoI(Ps、Sh、Vw、Mv)和大肠杆菌ExoI的活性和失活的聚丙烯酰胺凝胶。缓冲液条件和反应设置如实例12中所述。所有酶均在30℃下就活性以及在相同的时间和温度条件下在80℃下温育1分钟后的残留活性测试15分钟。为了模拟PCR后的清除测定，反应在PCR后的缓冲液中执行。
图20显示了在其上比较HL-ExoI(Sh)和大肠杆菌ExoI的活性和失活的聚丙烯酰胺凝胶。缓冲液条件和反应设置如实例12中所述。所有酶均在加入底物和在30℃下温育15分钟之前在80℃下温育1、5、10或20分钟。为了模拟PCR后的清除测定，反应在PCR后的缓冲液中执行。在80℃下的1分钟温育后，在HL-ExoI(Sh)中未检测到残留活性，而在ExoI A的情况下，在5分钟后以及甚至在80℃下的20分钟温育后，对于两种商业大肠杆菌ExoI观察到显著的残留活性。
图21显示了来自实例14的测序反应的代表性测序结果(A：阴性对照；B：ExoSAP-IT；C：HL-ExoI(Sh)/SAP；D：HL-ExoI(Ps)/SAP；E：HL-ExoI(Mw)/SAP；F：HL-ExoI(Vw)/SAP。所有图像均显示在PCR清除前加入过量反向引物后所得到的层析图。所有测序结果均基于GoTaq PCR缓冲液。ExoSAP-IT对应于30分钟方案，而HL-ExoI/SAP对应于5分钟方案，两者均在实例14中描述。
具体实施方式
实例
实例1–核酸外切酶的克隆、重组表达和部分纯化
来自Moritella viscosa(HL-ExoI(Mv))、沃当弧菌(HL-ExoI(Vw))、嗜盐单胞菌属(HL-ExoI(Ha))、嗜冷单胞菌属(HL-ExoI(Ps))和希瓦氏菌属(HL-ExoI(Sh))gDNA的sbcB外切脱氧核糖核酸酶I(exoI)基因通过将克隆基因插入到用于在大肠杆菌TOP10中表达的pTrc99A表达载体内，通过具有C末端His标签的重叠延伸PCR克隆(Bryksin和Matsumura，2010,Biotechniques,48(6),463–465)进行克隆。使用的引物在表1中列出。遗传源材料得自从挪威近海水域中分离的细菌。
表1：用于克隆ExoI基因的引物。
粗体字母，pTrc99A特定序列；大写字母，基因特异性序列；小写字母，间隔物和标签序列。
根据用于Z感受态细胞(Zymo Research,U.S.A.)的方案，将pTrc99A-exoI载体转化到大肠杆菌TOP10内。细胞在有挡板的摇瓶中在Terrific Broth(TB)培养基中生长；将大约1.5％的过夜预培养物转移至在1000ml生长培养瓶中含有100μg/ml氨苄青霉素的250mlTB培养基中，并在37℃、200rpm下温育直至OD600达到0.4-0.6。将温度降低至15℃，并使细胞温育30分钟，然后用0.5mM IPTG诱导4小时。通过离心收获细胞，并将细胞团块在-20℃下冷冻。
将来自250ml培养物的细胞团块在冰上解冻，加入40ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(在25℃下pH 7.5)、5mM咪唑、1M NaCl、0.1％Triton X-100、10％甘油、10mM MgCl2)，并使用Branson Sonifier使混合物在冰水浴中超声处理10分钟(25％幅度，0.1秒打开，0.2秒关闭)。将裂解产物在50ml试管中以25,000g离心20分钟，并且上清液通过0.45μM过滤器过滤。将过滤的裂解产物用50ml裂解缓冲液稀释至90ml的总体积。所有纯化步骤均用冰冷的缓冲液和在冰上冷却的柱执行。使用1ml/分钟的流量将90ml裂解产物应用于在裂解缓冲液中平衡的HisTrap HP 1ml柱。用5个柱体积(CV)的裂解缓冲液和10CV的缓冲液A2(50mMTris-HCl、(在25℃下pH 7.5)、5mM咪唑、500mM NaCl)洗涤柱。随后将蛋白质用20CV的0-30％梯度的缓冲液B(50mM Tris-HCl、(在25℃下pH 7.5)、500mM咪唑、500mM NaCl)至缓冲液A2以1ml级分洗脱。合并含有ExoI活性的级分，并针对10mM Tris-HCl(在25℃下pH 7.5)、500mM NaCl和0.5mM EDTA或10mM Tris-HCl(在25℃下pH 7.5)、500mM NaCl，10mM MgCl2和0.5mM EDTA透析，并且随后用100％甘油1:1稀释并贮存在-20℃下。
另外两个的核酸外切酶I序列(未公开)已进行检查，但未能有效表达和分离。
实例2–核酸外切酶的活性概况分析：关于催化活性的最佳温度
产生温度曲线以更好地表征来自实例1的不同重组HL-ExoI。将不同的HL-ExoI稀释至能够区别凝胶上的底物降解的浓度。由于不同的稀释因子，样品不能直接相互比较，但可估计活性中的相对温度依赖性差异。将样品温育不同的时间间隔，以测定酶是否可维持设定温度更长的时间段。
详述方法
将HL-ExoI稀释(10mM Tris-HCl在25℃下pH 7.5，5mM MgCl2)至被认为在样品之间给出最佳区别的那种。为了模拟PCR清除方案，使用PCR后溶液作为反应缓冲液。通过使用基于两种不同PCR缓冲液的PCR后溶液平行运行实验来实现稳固性；GoTaq(Promega)或TEMPase Key(VWR)。作为底物，向每个反应中加入5pmol的5'FAM标记的寡核苷酸(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)。在ExoI添加后，每个样品的总体积为7μl。将样品在热循环仪中在20℃、25℃、30℃或37℃下温育1分钟、5分钟或10分钟，随后在80℃下温育5分钟。加入TBE-Urea Sample Buffer(Bio-Rad)，并且将样品应用于浇铸的20％丙烯酰胺/7M脲凝胶上，并在180V下运行大约45分钟。除非另有说明，否则所有试剂在完全方案期间均保持在冰上，并且工作流在冷却块上执行。
结果
结果显示于图12中。一般而言，所有HL-ExoI在用于制备PCR后样品的两种缓冲液中类似地执行，显示所观察到的效应对PCR缓冲液组成并非特异性的。
HL-ExoI(Ha)显示高达37℃的总体增加的活性，并且可耐受该温度至少10分钟(图12a)。在较低温度下也可见良好的总体活性。
HL-ExoI(Ps)显示在30℃下的总体最佳活性，伴随当使用37℃作为温育温度时的活性丧失(图12b)。在较低温度下也可见良好的总体活性。
HL-ExoI(Sh)显示在37℃下的总体最佳活性，并且可耐受该温度至少10分钟(图12c)。在所有温度下也可见良好的总体活性。
HL-ExoI(Mv)显示在30℃下的总体最佳活性，而在37℃下温育导致活性丧失(图12d)。在较低温度下也可见良好的活性。
使用PAGE用于活性概况分析看起来给出了关于HL ExoI如何随着时间过去取决于温度表现的良好估计。
实例3–核酸外切酶的活性概况分析：关于催化活性的失活温度
在该实例中，将HL-ExoI(Sh)的热失活特性与不同的商购可得的大肠杆菌ExoI进行比较。
将四种不同的商购可得的大肠杆菌ExoI和一种商购可得的酶促PCR清除试剂盒的热失活特征与HL-ExoI(Sh)进行比较。为了确保任何观察到的效应与反应缓冲液的选择无关，两种不同的PCR后溶液用作反应缓冲液(TEMPase Key,TEMPase Extra,VWR)。所有反应均接受约10U的ExoI，以允许ExoI活性和热失活的容易性之间的比较。HL-ExoI(Sh)的核酸外切酶活性如实例8中所述进行计算。对于商业ExoI，核酸外切酶活性如由制造商陈述的获得。每个反应的最终体积为7μl。使样品在80℃下温育1分钟，随后冷却并加入5pmol 5'FAM标记的寡核苷酸(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)。使样品在37℃下进一步温育15分钟。温育后，加入TBE-Urea Sample Buffer(Bio-Rad)，并且将样品应用于浇铸的20％丙烯酰胺/7M脲凝胶上，并在180V下运行大约45分钟。除非另有说明，否则所有试剂在完全方案期间均保持在冰上，并且工作流在冷却块上执行。
结果显示于图13中。在80℃下温育1分钟后，所有大肠杆菌ExoI都具有足够的活性，以完全降解所有底物。HL-ExoI(Sh)是唯一完全失活的ExoI，未显示残留活性的迹象。
实例4-HL-ExoI(Sh)在核酸测序之前的快速PCR清除中的效用证明
设置实验以验证HL-ExoI(Sh)在快速PCR清除的情况下可令人满意地执行。对于比较和阳性对照，平行样品用主导品牌的酶促PCR清除试剂ExoSAP-IT(Affymetrix)进行处理。
为了验证HL-ExoI(Sh)使5分钟酶促PCR清除方案成为可能，设计实验来应激测试方案限制。因此，对于所有测试中的PCR后溶液，在PCR后加入过量的引物或dNTP。如果在测序反应之前未去除，则残留引物将导致相反方向的序列反应，并由此强烈地损害反应的长度和质量，并且dNTP将导致无法获得高质量序列的ddNTP:dNTP比率，。通过使用不同的PCR试剂和扩增子实现稳固性。
PCR后，将10pmol引物或40nmol dNTP加入到PCR后溶液中。
根据制造商方案处理要用ExoSAP-IT处理的样品。向PCR溶液中加入反向引物或dNTP后，样品接受2μl的清除试剂，得到7μl的最终体积。使样品在37℃下温育15分钟，随后在80℃下温育15分钟。使用两种不同的PCR缓冲液建立样品，并将所有样品设置为一式三份。
待用HL-ExoI(Sh)处理的样品接受与上述相同量的加入引物和dNTP，随后加入1μlHL-ExoI(Sh)(10U/μl，如实例8中计算的)和1μl SAP(2U/μl)。与阳性对照一样，样品的最终体积为7μl。使样品在37℃下温育4分钟，随后在80℃下温育1分钟。使用两种不同的PCR缓冲液建立样品，并将所有样品设置为一式三份。
为了评估ExoSAP-IT在与HL-ExoI相同的方案下如何执行，在加入2μl ExoSAP-ITPCR清除试剂之前，用反向引物掺入样品。将样品设置为一式两份。
作为阴性对照，样品接受反向引物或dNTP，但是代替酶促清洁溶液，样品接收2μl水。将样品设置为一式两份。
表2提供了上述实验设置的概述。
表3提供了PCR清除温育的概述
PCR清除处理后，立即在冰上冷却样品。将制备的测序反应主混合物等分到分开的管中。将总共2.5μl的每种处理的/未经处理的溶液加入每个管中，以用作后续测序反应中的模板。将样品立即转移至热循环仪，并起始测序程序。
将序列递送到University of的DNA测序核心设施，以使用AppliedBiosystems 3130xl Genetic Analyzer进行纯化和测序。使用Sequence ScannerSoftware v1.0(LifeTech)分析结果。
所选择的结果显示于图14中。掺料有dNTP的序列获得总体良好的序列长度和质量，并且无法检测到用ExoSAP-IT或HL-ExoI/SAP处理的样品之间的差异(结果未显示)。图14a的序列图是来自在GoTaq PCR缓冲液中掺料有反向引物的序列的结果的例子。由阴性对照显而易见的是，功能性PCR清除的缺乏强烈损害序列的长度和质量。用ExoSAP-IT(30分钟方案)或HL-ExoI/SAP(5分钟方案)处理的样品显示非常好的序列质量。这些图像是所有重复的代表。
图14b的序列图是来自在TEMPase Extra PCR缓冲液中掺料有反向引物的序列的结果的例子。具有加入的反向引物的样品显示在用PCR清除溶液中任一处理后非常良好的序列长度和质量。在ExoSAP-IT处理的样品(30分钟方案)或HL-ExoI/SAP处理的样品(5分钟方案)之间不存在显著差异。PCR清除处理的缺乏导致较低质量的较短序列。这些图像是所有重复的代表。
另一方面，图14c示出了当必须执行与HL-ExoI/SAP方案相同的5分钟方案时ExoSAP-IT清除溶液如何执行。由该图显而易见的是用ExoSAP-IT的处理不导致高质量的序列。这很可能是由于添加的引物的降解不足以及残留的ExoI活性降解测序引物的组合。由于残留的ExoI活性降解测序引物，很可能使用在室温下的反应设置将进一步损害这些结果。用HL-ExoI/SAP处理的样品显示整体优异的序列长度和质量。
实例5-测定关于本发明的某些热不稳定性核酸外切酶的最小失活时间和温度的失活实验。
在给定的测定条件下，对于测试中的每种HL-ExoI测定最低失活温度和时间。这通过在不同温度下温育HL-ExoI不同的时间间隔来实现。热处理后，加入5'标记的单链DNA，并显现底物降解的程度(图15)。将底物降解的量与图16的结果进行比较，并估计热处理后的残留活性。
将未稀释的HL-ExoI加入反应缓冲液(10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mMKCl，5mM MgCl 2)中，得到9μl的最终体积。使样品在40℃、45℃、50℃或55℃下温育5分钟、10分钟或15分钟，或在60℃下温育5分钟或10分钟。样品冷却后，加入5pmol的5’FAM标记的寡核苷酸(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)。样品还在30℃下温育30分钟，并且随后在95℃下温育2分钟。加入TBE-Urea Sample Buffer(Bio-Rad)，并且将样品应用于预制的20％丙烯酰胺/7M脲凝胶上，并在180V下运行大约45分钟。除非另有说明，否则所有试剂在完全方案期间均保持在冰上，并且工作流在冷却块上执行。PAGE结果使用MolecularImager PharosFX系统(Bio-Rad)进行成像。
结果显示于图15中，并且指示取决于用于热温育的温度和时间间隔观察到不同程度的底物降解。总之，在55℃下温育10分钟或更长时间后，HL-ExoI无一显示任何底物降解的迹象。所有HL-ExoI在55℃下5分钟或在50℃下10分钟的温育显示基本上无底物降解，或至多1和10％之间的底物降解。
实例6–通过测量关于核酸外切酶的稀释系列的底物降解程度来测定失活实验的灵敏度阈值
为了测定关于前述实例的不同HL-ExoI的最低失活温度，测定实例5的失活测定的灵敏度阈值。使用核酸外切酶的系列稀释并估计每个稀释度的底物降解程度来制备半定量测定法。对于比较测量，此处也应用了与失活测定中使用的相同的测定条件和反应设置。
将测试中的每种HL-ExoI稀释1、10、100、200、1000和10,000倍，对应于100％、10％、1％、0.5％、0.1％和0.01％的活性。与用作反应缓冲液的相同的缓冲液也用作稀释缓冲液(10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl，5mM MgCl2)。反应缓冲液和5pmol FAM标记的底物(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)在HL-ExoI添加之前进行预混合。反应总体积为10μl。使样品在30℃下温育30分钟，随后在95℃下温育2分钟。加入TBE-Urea SampleBuffer(Bio-Rad)，并且将样品应用于预浇铸的20％丙烯酰胺/7M脲凝胶上，并在180V下运行大约45分钟。除非另有说明，否则所有试剂在完全方案期间均保持在冰上，并且工作流在冷却块上执行。PAGE结果使用Molecular Imager PharosFX系统(Bio-Rad)进行成像。
结果显示于图16中，并且指示在给定的测定条件下，核酸外切酶的活性可检测至大约1％的活性。
实例7-用于测定双链和单链核酸外切酶活性的测定
通过使测试核酸外切酶与大约20个核苷酸的短的5’-FAM-DNA-TAMRA-3’标记的单链或双链底物一起温育来测量核酸外切酶活性。如果核酸外切酶能够降解底物，则这将立即开始并且荧光团将被释放。可跟踪随着时间过去的活性，因为释放的荧光团可在光激发后重新发射光。
具体地，测定混合物由1μl 10μM ssDNA/dsDNA、10μl 5x TDB(250mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，5mM DTT，1mg/ml BSA，10％甘油)和29μl MiliQ H2O组成。将40μl测定混合物转移至黑色平底96孔板的孔中，并且将5μl MiliQ H2O或稀释缓冲液(作为阴性对照)和酶样品加入孔中。通过使用多通道移液管加入5μl 50mM MgCl2引发反应，使反应的最终体积为50μl。立即测量荧光(激发485nm和在520nm处的发射)，并且随后在适当的时间间隔时，包括振荡步骤，并且允许反应进行15分钟。荧光的增加指示发生了底物的降解。
实例8-用于定量单链核酸外切酶活性的测定
通过使酶与变性的3H-dATP掺入的PCR产物一起温育来测量单链DNA核酸外切酶活性。如果核酸外切酶能够降解底物，则核酸外切酶将释放酸可溶性核苷酸，其可在闪烁计数器中检测。用三氯乙酸(TCA)沉淀过量的高分子量底物DNA。在该测定中，一个单位(1U)定义为在30℃下在30分钟内在20μl的最终体积中催化10nmol酸可溶性核苷酸的释放的酶量。
具体地，测定混合物由4μl 5x核酸外切酶缓冲液(250mM Tris-HCl，在25℃下pH7.5，50mM MgCl2，5mM DTT)、5μl变性底物(通过在100℃下温育3分钟变性且立即转移至冰水浴3分钟)和6μl MiliQ H2O组成。将15μl转移至在冰上的1.5ml微量离心管中。必要时稀释测试中的酶，并将各5μl的酶样品、对照和空白样品加入测定混合物中，并且通过上下吹吸混合。使样品在30℃下的水浴中温育10分钟。温育后，将反应置于冰上，并且立即加入20μl冰冷的小牛胸腺DNA(1mg/ml)和250μl冰冷的10％(w/v)TCA。随后使样品在冰上温育15分钟，并在4℃下以13,000rpm离心10分钟。将上清液200μl转移至24孔板，随后加入0.8mlUltima Gold XR闪烁液。用密封带密封孔，并且通过振荡使样品充分混合。使样品在MicroBeta2板计数器中计数5分钟。
实例9-用于定量双链核酸外切酶活性的测定
以与实例8相同的方式测量双链DNA核酸外切酶活性，除了在与酶温育之前PCR底物不变性之外。
实例10–本发明的热不稳定性核酸外切酶的双链和单链核酸外切酶活性的比较
通过使测试酶与变性的掺入3H-dATP的PCR产物一起温育来测量单链DNA核酸外切酶活性。类似地测量双链DNA核酸外切酶活性，除了使酶与未变性的掺入3H-dATP的PCR产物一起温育之外。如果核酸外切酶能够降解底物，则核酸外切酶将释放酸可溶性核苷酸，其可在闪烁计数器中检测。用三氯乙酸(TCA)沉淀过量的高分子量底物DNA。在该测定中，一个单位(1U)定义为在30℃下在30分钟内在20μl的最终体积中催化10nmol酸可溶性核苷酸的释放的酶量。具体地，测定混合物由4μl 5x缓冲液(50mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，250mMKCl和25mM MgCl2)、5μl底物(为了获得ssDNA，dsDNA底物通过在100℃下温育3分钟变性且立即转移至冰水浴3分钟)和3μl MiliQ H2O组成。将测定混合物12μl转移至在冰上的1.5ml微量离心管中。稀释测试中的酶，并将8μl的酶样品加入测定混合物中，并且通过上下吹吸混合。对照和空白样品也包括在设置中。使样品在30℃下的水浴中温育10分钟。温育后，将反应置于冰上，并且立即加入20μl冰冷的小牛胸腺DNA(1mg/ml)和250μl冰冷的10％(w/v)TCA。随后使样品在冰上温育15分钟，并在4℃下以13,000rpm离心10分钟。将上清液200μl转移至24孔板，并加入0.8ml Ultima Gold XR闪烁液。用密封带密封孔，并且通过振荡使样品充分混合。使样品在MicroBeta2板计数器中计数5分钟。
结果概括于表4中，并且显示与针对单链DNA的活性相比较，本发明的HL-ExoI展示针对双链DNA非常小的活性。然而，难以断定针对双链DNA的低活性量是与酶的固有性质相关还是仅由酶的污染引起。测试的两种商业ExoI(ExoI A和ExoI B)也展示针对双链DNA非常低的活性。
表4.HL-ExoI和商业Exoi针对ssDNA和dsDNA的活性。
实例11–核酸外切酶活性概况分析：使用脲聚丙烯酰胺凝胶的方向性测定
执行该实验以便验证本发明的HL-ExoI显示出3'至5'核酸外切酶活性和基本上没有5'至3'核酸外切酶活性。在聚丙烯酰胺凝胶上使用5'FAM或3'FAM标记的寡核苷酸(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)分析底物特异性。
将测试中的每种HL-ExoI稀释至约0.1U/μl的最终浓度。制备两种主混合物，一种用于5'FAM标记的寡核苷酸，并且一种用于3'FAM标记的寡核苷酸。主混合物含有反应缓冲液(10mM Tris pH 8.5、50mM KCl、5mM MgCl2)和各自的FAM标记的底物，获得0.25pm ol底物/反应的最终量。包括含有稀释缓冲液而不是酶溶液的阴性对照和使用来自大肠杆菌的Exo I的阳性对照两者。将酶移液到预冷却的反应管内，并且随后加入具有反应缓冲液和底物的主混合物。所有反应均由10μl的最终体积组成，并在30℃下温育1小时。通过加入2.5μl样品上样缓冲液(95％甲酰胺、10mM EDTA、二甲苯)终止反应，并在95℃下温育5分钟。为了分析，将6μl样品装载到12％丙烯酰胺/7M脲凝胶上。凝胶在50W下运行1小时45分钟。在反应的设置期间，所有试剂和样品均保持在冰上。
结果显示于图17中。观察到5'FAM标记的底物和3'FAM标记的底物之间的清楚差异，指示不同的HL-ExoI以及大肠杆菌ExoI对照的3'至5'方向性。当FAM在5'末端处进行标记时，可见部分暗淡和强烈的中间产物条带的梯，指示ExoI从3'末端降解底物。当寡核苷酸在3'末端处进行FAM标记时，立即切断荧光团，仅生成3'FAM单体。
实例12–核酸外切酶的活性概况分析：结晶结构上的方向性
为了进一步支持具有3'-5'方向性的本发明的HL-ExoI I酶的方向性，使HL-ExoI(Mv)与ssDNA一起结晶，并测定复合物的结构。
蛋白质结晶用5.4mg/ml的蛋白质浓度执行。脱盐的13聚体寡核苷酸(dT13)购自Sigma Aldrich，并以1.2摩尔过量加入蛋白质中。为了抑制核酸外切酶I对ssDNA的降解，加入10mM EDTA。使用坐滴蒸气扩散技术，在具有Phenix(Art Robbin Instruments)的MRC2Well Crystallization Plates(Swissci,Hampton Research)中以96孔格式自动设置液滴。滴大小为0.4μl(0.2μl+0.2μl)，并且储液的体积为60μl。使结晶板在4℃下温育。
与dT13/EDTA共结晶的晶体用20.02％PEG MME 5000、0.1M乙酸钠pH 4.5和0.09M乙酸钙生长。X射线衍射实验在Grenoble(法国)的ESRF处执行。晶体衍射至分辨率。通过用大肠杆菌ExoI(PDB:1FXX)作为搜索模型的分子替换执行结构测定。
在早期的精制循环中，ssDNA的电子密度变得可见，并且所有核苷酸可拟合。ssDNA以与对于大肠杆菌Exo I可见的相似方式与活性位点中的3'-末端结合(Korada等人，Nucleic Acids Research,2013,41(11):5887-97)，提供了HL-ExoI(Mv)3'-5'方向性的结构证据。
实例13–核酸外切酶的活性概况分析：本发明的某些HL-ExoI在80℃下的快速失活。
执行该实验以证实本发明的某些HL-ExoI在快速PCR清除的情况下可令人满意地执行。在该实验中，将在80℃下测试的HL-ExoI的热失活特征与两种商购可得的大肠杆菌ExoI(ExoI A和ExoI B)进行比较。
本发明的HL-ExoI针对ssDNA的活性如实例8中所述进行计算，除了1x测定混合物由包括3H dA标记的DNA的67mM Glycin-KOH，pH 9.5，63.5mM NaCl，9.2mM MgCl2，10mM DTT组成之外。对于商业大肠杆菌ExoI，活性如由制造商陈述的获得。为了模拟在PCR清除设置中的设置，使用PCR后缓冲液作为反应缓冲液。反应缓冲液的组成为10mM Tris-HCl pH 8.5(25℃)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、DyNAzyme II(Thermo Fisher ScientificTM，以前的FinnzymesTM)和dNTP残余物(在PCR反应运行前起始各200μM)、引物残余物(在PCR反应运行前起始200nM的每种引物)和模板。
每个反应接受10U ExoI，得到7μl的最终反应体积。实验含有所有ExoI的活性对照，以及热温育后的残留活性的检查。对于活性对照，将反应缓冲液、ExoI和5pmol底物(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)混合，并在30℃下温育15分钟，随后在95℃下温育20分钟。对于就在80℃下失活而言的待分析样品，在80℃下温育1分钟并随后冷却后加入底物。随后使这些样品在30℃下温育15分钟，随后在95℃下温育20分钟。在所有温育步骤后，加入TBE-Urea Sample Buffer，并且将样品应用于预浇铸的20％丙烯酰胺/7M脲凝胶上，并在180V下运行大约45分钟。
结果显示于图19中。所有Exo I在该测定中都具有足够的活性。仅HL-ExoI在80℃下温育1分钟后失活，而两种商购可得的大肠杆菌Exo I显示足够的残留活性，降解100％的底物。HL-ExoI，但不是商业ExoI，与快速5分钟PCR清除方案相容。
为了进一步比较HL-ExoI(Sh)与两种商购可得的大肠杆菌ExoI的失活的容易性，将10U的每种ExoI在80℃下温育1、5、10或20分钟，随后冷却并加入5pmol 5'FAM标记的底物(GCTAACTACCACCTGATTAC；SEQ ID No.21)。使样品在30℃下进一步温育15分钟，随后在95℃下温育20分钟。反应设置在其他方面与上述实验相同，使用与反应缓冲液相同的PCR后缓冲液。对于三种ExoI包括活性对照，并且这些样品在30℃温育15分钟之前不进行热温育。如上所述在脲-PAGE凝胶上显现残留活性。
结果显示于图20中。在80℃下热处理后，对于几乎所有持续时间，在两种商购可得的ExoI中均观察到实质的残留活性。相比之下，用在80℃下处理甚至一分钟的HL-ExoI(Sh)处理的样品中无法检测到残留活性。
实例14–在核酸测序之前在快速单管PCR清除中HL-ExoI的效用证明。
进行该实例以显示在PCR清除的情况下本发明的某些HL-ExoI的功能性。实验设置与实验4非常相似。如在实例4中，在PCR后，对测试中的PCR后溶液加入过量的引物(10pmol)。然而，与实例4不同，仅使用一种PCR缓冲液(GoTaq,Promega)，将用HL-ExoI处理的样品的温育温度从37℃降低到30℃，并且仅针对ExoSAP-IT测试了常规的30分钟方案。
在起始实验之前，每种HL-ExoI的活性如实例8所述进行计算，除了1x测定混合物由包括3H dA标记的DNA的67mM Glycin-KOH，pH 9.5，63.5mM NaCl，9.2mM MgCl2，10mM DTT组成之外。在加入2μl预混合的HL-ExoI(10-20U/μl)和SAP(1.5U/μl)之前，用HL-ExoI处理的样品接受如上所述量的引物。每个清除反应的总体积为7μl。样品在30℃下温育4分钟，随后在80℃下温育1分钟。将样品设置为一式三份。
对于比较和阳性对照，样品用主导品牌的酶促PCR清除；ExoSAP-ITTM(AffymetrixTM)进行处理。用ExoSAP-IT处理的样品根据制造商方案进行处理。向PCR溶液中加入引物后，样品接受2μl PCR清除试剂，得到7μl的最终体积。ExoSAP-IT处理的样品在37℃下温育15分钟，随后在80℃下温育15分钟。将样品设置为一式三份。
建立阴性对照，并且这些接受与处理样品相同量的引物。代替酶促清除溶液，这些样品接收2μl水。将样品设置为一式三份。
关于更多细节应当参考实例4。
将序列递送到University of的DNA测序核心设施，以使用AppliedBiosystems 3500xl Genetic Analyzer进行纯化和测序。使用Sequence ScannerSoftware v2.0(LifeTech)分析结果。
所选择的结果显示于图21中，其中序列图是来自在GoTaq PCR缓冲液中掺料有反向引物的序列的结果的代表性例子。由阴性对照显而易见的是，功能性PCR清除的缺乏强烈损害序列的长度和质量。用ExoSAP-IT(30分钟方案)或HL-ExoI/SAP(5分钟方案)处理的样品显示非常好的序列质量。

Claims (27)

1.一种核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与其至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段
(i)通过在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；
(ii)对于单链DNA基本上特异性；和
(iii)具有3’-5’核酸外切酶活性。
2.一种核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID No.1或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(b)SEQ ID No.2或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(c)SEQ ID No.3或与其至少65％相同的氨基酸序列，
(d)SEQ ID No.4或与其至少65％相同的氨基酸序列，或
(e)SEQ ID No.5或与其至少65％相同的氨基酸序列，
其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段
(i)通过在由10mM Tris-HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl2组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；
(ii)对于单链DNA基本上特异性；和
(iii)具有3’-5’核酸外切酶活性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸外切酶或其酶促活性片段，其中所述核酸外切酶具有选自SEQ ID No.1至5和SEQ ID No.11至15中任一个的氨基酸序列。
4.一种编码根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，所述核酸分子包含选自SEQ ID No.6至10和SEQ IDNo.16至20中任一个的核苷酸序列，或SEQ ID No.6至10和16至20的简并形式。
6.一种从样品中去除单链DNA的方法，所述方法包括在允许消化所述样品中存在的任何单链DNA的至少一部分的条件下，使所述样品与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段接触。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括加热所述核酸外切酶处理的样品，以使所述核酸外切酶或其酶促活性片段失活。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述样品是生物大分子的样品。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述样品包含核酸、蛋白质、碳水化合物聚合物或脂质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品包含双链核酸、目的DNA:RNA双链体或重组产生的蛋白质。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述样品是核酸扩增反应的产物或逆转录反应的产物。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述核酸扩增反应选自PCR、3SR、SDA、LAR/LCR和LAMP。
13.一种核酸扩增方法，所述方法包括在最终扩增步骤之后，在允许消化所述产物中存在的任何单链DNA的至少一部分的条件下，使所述核酸扩增反应的产物与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段接触，以及任选地随后加热所述混合物以使所述核酸外切酶或其酶促活性片段失活的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述产物是所述最终扩增步骤的直接产物。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述方法还包括在所述最终扩增步骤之后，在使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之前、与使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触同时、或在使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之后，在允许所述产物中存在的任何未掺入的核苷酸三磷酸脱磷酸的条件下，使碱性磷酸酶与所述扩增反应的产物接触。
16.一种逆转录方法，所述方法包括在最终逆转录步骤和/或可能存在的最终第二链cDNA合成步骤之后，在允许消化所述产物中存在的任何单链DNA的至少一部分的条件下，使所述逆转录反应的产物与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段接触，以及任选地随后加热所述混合物以使所述核酸外切酶或其酶促活性片段失活的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述产物是所述最终逆转录步骤的直接产物，和/或可能存在的所述最终第二链cDNA合成步骤的直接产物。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括在所述最终逆转录步骤和/或可能存在的所述最终第二链cDNA合成步骤之后，在使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之前、与使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触同时、或在使所述产物与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之后，在允许所述产物中存在的任何未掺入的核苷酸三磷酸脱磷酸的条件下，使碱性磷酸酶与所述逆转录反应的产物接触。
19.一种核酸序列分析方法，所述方法包括在分析步骤之前的样品制备步骤，所述样品制备步骤包括在允许消化所述样品中存在的任何单链DNA的至少一部分的条件下，使待分析的样品与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段接触，并且任选地随后加热所述混合物以使所述核酸外切酶或其酶促活性片段失活。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述样品制备步骤还包括在使所述样品与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之前、与使所述样品与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触同时、或在使所述样品与所述核酸外切酶或其酶促活性片段接触之后，在允许所述样品中存在的任何未掺入的核苷酸三磷酸脱磷酸的条件下，使碱性磷酸酶与所述待分析的样品接触。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述核酸序列分析是测序技术或基于寡核苷酸杂交探针的技术。
22.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段从样品中去除单链DNA的用途。
23.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段在根据权利要求6至21中任一项所述的方法中的用途。
24.一种用于分离和纯化根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段的方法，所述方法包括培养所述核酸外切酶或其酶促活性片段在其中表达的细胞，并且随后从所述细胞和/或所述细胞已在其中进行培养的培养基中分离所述核酸外切酶或其酶促活性片段。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法包括在合适的异源宿主细胞中表达所述核酸外切酶或其酶促活性片段，所述异源宿主细胞包含编码所述核酸外切酶或其酶促活性片段的表达载体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述表达载体包含SEQ ID No.6至10或16至20中任何的核苷酸序列。
27.一种试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含：
(a)根据权利要求1至3中任一项所述的核酸外切酶或其酶促活性片段，
(b)根据权利要求4和权利要求5所述的核酸分子，
以及任选的下述中的一种或多种：
(i)核苷酸三磷酸
(ii)寡核苷酸引物
(iii)寡核苷酸探针
(iv)逆转录酶
(v)DNA聚合酶
(vi)DNA连接酶
(vii)碱性磷酸酶，优选不耐热性碱性磷酸酶，更优选SAP；和
(viii)限制性酶。
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