CN107096037B - 一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶。与现有技术相比，本发明通过酶促进小分子肽转化为凝胶因子，并优先在纳米颗粒表面组装成小分子凝胶，进而制备出纳米凝胶，该纳米凝胶具有生物活性和多功能性，可作为生长因子、药物及细胞的载体，应用于细胞培养、伤口修复的治疗等，为纳米凝胶的制备提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法。
背景技术
水凝胶是以水为分散介质的凝胶，在具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀。
随着水凝胶技术的不断发展，水凝胶的研究逐步从大块凝胶，到微凝胶，再到纳米凝胶。纳米凝胶是一类通过物理或者化学交联的具有三维网络结构的纳米尺度的水凝胶微粒，通常由高分子单体聚合而成，直径在200nm以下。纳米凝胶相对于其它凝胶来说，具有以下优势：一、尺寸小，容易被细胞吞噬；二、容易穿透人体中的各种保护膜，如脑膜，从而可以实现脑部给药；三、载药效率高。因此，近年来纳米凝胶受到了人们越来越多的关注。
目前，纳米凝胶的制备方法主要为共混法，即将无机纳米粒子与聚合物按照不同的工艺复合而成，是目前制备聚合物纳米复合水凝胶最简单的一种方法，该方法的优点是纳米粒子与聚合物的制备分开进行，可有效控制纳米粒子的形态和尺寸，但缺点是共混时纳米粒子易发生团聚，不易分散。
酶催化聚合反应是近年来研究的热点之一，在制备水凝胶方面，由于酶具有高效、专一、稳定的特点，使得它成为了当前制备水凝胶最有发展前景的方法之一。酶催化自由基聚合属于酶催化聚合的一种，近几年用这种方法制备水凝胶逐渐走进了大家的视野，这种方法制得的水凝胶在调节物理和化学性质方面非常灵活，并且具有很好的酶响应性。但目前尚未有简单易行的方法，利用酶催化聚合反应制备出性能优异的纳米凝胶。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种纳米凝胶分散性好且简单易行的酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶。新形成的凝胶因子优先在纳米颗粒表面组装，从而形成凝胶包裹在纳米颗粒表面。
该方法具体包括以下步骤：
(1)纳米颗粒的氨基化修饰：将纳米颗粒分散在溶剂中，之后加入氨基硅烷偶联剂，并在40-70℃下反应8-24h，洗涤后得到氨基化修饰的纳米颗粒；
(2)纳米颗粒的羧基化修饰：将氨基化修饰的纳米颗粒分散在有机溶剂中，之后加入丁二酸酐，并搅拌6-18h，洗涤后得到羧基化修饰的纳米颗粒；
(3)纳米颗粒的酶修饰：将羧基化修饰的纳米颗粒分散在生物缓冲液中，并调节pH值至5-6，活化羧基后，加入酶并进行酰胺反应，洗涤后得到酶修饰的纳米颗粒；
(4)纳米颗粒表面小分子自组装制备纳米凝胶：将酶修饰的纳米颗粒分散在溶剂中，并调节pH值至7-8，之后加入小分子肽，搅拌反应6-12h后，即得到所述的纳米凝胶。
所述的纳米颗粒包括二氧化硅纳米颗粒或四氧化三铁纳米颗粒中的一种或两种。其中，二氧化硅纳米颗粒采用水解法制备，调节不同成分的比例能够制备出不同直径的二氧化硅纳米颗粒。若选用四氧化三铁纳米颗粒，当酶修饰的四氧化三铁纳米颗粒接触到小分子肽时，酶催化反应发生在四氧化三铁纳米颗粒的表面，在这个表面产生凝胶因子，随着催化反应继续进行，四氧化三铁纳米颗粒表面的凝胶因子浓度增加，随即进行自组装形成一层水凝胶，凝胶层形成以后阻止了酶与小分子肽反应，所以只会形成纳米凝胶而非宏观水凝胶。
所述的纳米颗粒的粒径为180-220nm。优选为200nm，200nm的尺寸有利于后续的生物应用，例如比较容易穿透屏障到达肿瘤癌症等病变部位，用于药物载体，由于被动运输的作用，能够实现药物控释和靶向治疗。
步骤(1)及步骤(4)中，所述的溶剂包括水或乙醇中的一种或两种；步骤(2)中，所述的有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种；步骤(3)中，所述的生物缓冲液包括2-吗啉乙磺酸或柠檬酸中的一种或两种。
步骤(1)中，所述的氨基硅烷偶联剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或两种；步骤(3)中，所述的酶包括羧酸酯酶或酸性磷酸酶中的一种或两种。
步骤(4)中，所述的小分子肽包括NapFFES或Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH中的一种或两种，所述的NapFFES的化学结构式如下式所示：
所述的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的化学结构式如下式所示：
步骤(3)中，所述的活化羧基过程为：加入NHS及EDC，之后搅拌1.5-2.5h即可，每100mL生物缓冲液中分别加入100-120mg所述的NHS及220-240mg所述的EDC。NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
步骤(3)中所述的酰胺反应过程中，反应温度为15-35℃，反应时间为5-7h。
步骤(1)中，每100mL溶剂中，分别加入800-1200mg所述的纳米颗粒及0.8-0.9mL所述的氨基硅烷偶联剂；
步骤(2)中，每100mL有机溶剂中，分别加入800-1200mg所述的氨基化修饰的纳米颗粒及80-120mg所述的丁二酸酐；
步骤(3)中，每100mL生物缓冲液中，分别加入80-120mg所述的羧基化修饰的纳米颗粒及40-60mg所述的酶；
步骤(4)中，每100mL溶剂中，分别加入80-120mg所述的酶修饰的纳米颗粒及15-25mg所述的小分子肽。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)通过酶促进小分子肽转化为凝胶因子，并优先在纳米颗粒表面组装成小分子凝胶，进而制备出纳米凝胶，该纳米凝胶具有生物活性和多功能性，可作为生长因子、药物及细胞的载体，应用于细胞培养、伤口修复的治疗等，为纳米凝胶的制备提供了新的思路，丰富了纳米凝胶的制备方法，且本发明具有温和高效、生物相容性强等优势，大大减少了各类溶剂清洗的时间和成本，有利于后续的生物显影、HIFU超声等生物应用；
2)通过改变小分子肽的浓度，能够实现凝胶层的厚度可控，随着凝胶层厚度的增加，表面电势会发生相应改变，且该体系成胶安全高效，具有良好的强度和生物活性，能够在应用在细胞培养或组织工程等领域；
3)可通过改变各组分的浓度或用量，调控纳米凝胶的交联率与成胶速度，并可根据需要实现原位成胶，灵活性好。
附图说明
图1为实施例1中纳米凝胶的制备过程示意图；
图2为实施例1中制备得到的NapFFES的NMR图谱；
图3为实施例1中制备得到的SiO2纳米颗粒及纳米凝胶的SEM图谱；
图4为实施例2中纳米凝胶的制备过程示意图；
图5为实施例1中制备得到的Fe3O4纳米颗粒及纳米凝胶的SEM图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)SiO2纳米颗粒的合成：
将147mL无水乙醇、2.5mL去离子水、7.5mL氨水于40℃下搅拌均匀，再向其中加入2.8mL正硅酸乙酯水解3h，之后离心，并用无水乙醇洗涤三次，得到硅球，即SiO2纳米颗粒。
(2)固相合成法制备NapFF：
(2-1)称取0.3g(0.405mmol)2-氯三苯甲基氯树脂于固相合成器中，并加入2.5mLDMF，之后通入氮气5min，使2-氯三苯甲基氯树脂充分溶胀；
(2-2)用氮气把二氯甲烷从装有2-氯三苯甲基氯树脂的固相合成器中压除干净；
(2-3)将314mg(0.81mmol)Fmoc保护的氨基酸溶解在2mL的DMF里，加入145μL(0.83mmol)DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，然后转移到上述固相合成器中，通入氮气，在室温下反应2h；
(2-4)加入130μL甲醇于固相合成器中，反应5分钟，把该固相合成器中液体压净，用2.5mL DMF洗涤三次，每次30s，再用5mL含哌啶体积百分比20％的DMF洗涤，最后用2.5mLDMF清洗3次，每次30s；
(2-5)取第二个Fmoc保护的氨基酸256mg(0.673mmol)、120μL(0.573mmol)DIEA和2.5mL无水DMF制成溶液，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，通入氮气反应2h；
(2-6)重复(2-5)方法依次加入所有需要的氨基酸，然后用DMF洗涤3遍，再用环己烷和异丙醇各洗三遍，每次1mL；
(2-7)按三氟乙酸与无水二氯甲烷的体积比1:9，配制成体积百分比浓度为10％的三氟乙酸溶液，把产物从2-氯三苯甲基氯树脂上切下，浓缩，加入pH＝3稀盐酸以除去残留的三氟乙酸，用油泵抽干，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，即制得NapFF，其化学结构式如下式所示：
(3)NapFFES的合成：
(3-1)将480mg(1mmol)NapFF、115mg(1mmol)NHS溶解在20mL THF里，之后加入230mg(1.2mmol)EDC，活化2h，再加入过量的乙醇胺(2mL)反应6h，然后旋蒸浓缩，用pH＝3的稀盐酸洗涤三次，冻干，得到固体；
(3-2)将(3-1)反应得到的固体溶于20mL三氯甲烷中，加入3mmol(0.5ml)DIEA(N,N-二异丙基乙胺)和3mmol(300mg)丁二酸酐，反应一晚上，过滤，取其滤液旋蒸，用pH＝3稀盐酸洗涤三次，冻干得到粗品，用HPLC分离提纯，即得到NapFFES。
图2为制备得到的NapFFES的NMR图谱，由图2可以看出，通过上述步骤，合成出了小分子肽NapFFES。
(4)硅球表面氨基化修饰：将(1)中制备好的硅球，分散到120mL乙醇中，于40℃下搅拌，并向其中加入1mL的氨基硅烷偶联剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，反应一晚上，用乙醇洗涤数遍。
(5)硅球表面羧基化修饰：将(4)中制备好的氨基化的硅球用乙醇洗涤后分散到DMF中，向其中加入三倍的DIEA(1mL)和三倍的丁二酸酐(100mg)，搅拌6h，反应完全后用乙醇洗涤三遍，再用去离子水洗涤三遍，冻干以备用。
(6)硅球表面修饰酯酶：将(5)羧基化的硅球分散到去2-吗啉乙磺酸100mL中，调节pH，使pH约5.5左右，加入1mmol NHS(115mg)、1.2mmol EDC(230mg)活化羧基2h，然后加入50mg的羧酸酯酶室温搅拌6h，之后用去离子水洗涤三次，冻干后备用。
(7)硅球表面小分子自组装纳米凝胶制备：100mg修饰好酯酶的硅球分散到100mL去离子水中，调节pH使pH约等于7.5，向其中加入20mg的NapFFES反应一晚上，在酯酶作用下前驱体NapFFES变为凝胶因子NapFFE，在二氧化硅表面自组装形成纳米凝胶。然后洗涤超声，重新分散到水里得到纳米凝胶，或者冻干以备用。其中，NapFFES化学结构式如下式所示：
图3为制备得到的SiO2纳米颗粒及纳米凝胶的SEM图谱，由图4可以看出，制备得到的纳米凝胶中，SiO2纳米颗粒表面裹有一层水凝胶层。
实施例2：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法如图4所示，具体包括以下步骤：
(1)Fe3O4纳米颗粒的合成：
先将0.54g FeCl3溶解于20mL乙二醇和二乙二醇的混合溶液中(VEG/VDEG＝3/17)，搅拌30min后，加入2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)，然后加热至120℃，并在搅拌下通入N2，形成透明溶液，反应1h后，加入1.5g NaOAc，并停止加热，剧烈搅拌30min后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，再将反应釜置于200℃烘箱中保持12h。反应完成后冷却至室温，取出反应釜，得到的黑色产物即磁性纳米四氧化三铁粒子(MNPs)，先后用乙醇和去离子水清洗几次，之后分散在20mL去离子水中备用。
(2)四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒的表面修饰
取2mL上述制备的Fe3O4分散在80mL乙醇和80mL去离子水的混合液中，超声分散30min后，加入6mL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，并在70℃加热搅拌下反应24h，同时通入N2。反应完成后，分别用乙醇和去离子水清洗几次，得到的颗粒为表面氨基化的四氧化三铁，即Fe3O4-APTES。接着将Fe3O4-APTES分散在100mL DMF中，再加入10％的丁二酸酐，搅拌反应18h，之后用乙醇和水清洗，得到表面羧基化的四氧化三铁Fe3O4-COOH，将Fe3O4-COOH分散在20mL去离子水中备用。
(3)四氧化三铁(Fe3O4)纳米水凝胶的制备
将Fe3O4-COOH用酸性磷酸酶(AP)修饰后，分散于100mL浓度为0.5mg/mL的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH溶液中，超声分散后，搅拌一定时间，待自组装完成后磁分离除去未反应的物质，再用去离子水清洗三次得到纳米凝胶，将纳米凝胶分散在去离子水中备用。
四氧化三铁纳米水凝胶在制备过程中，通过酸性磷酸酶的酶切作用除去Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH中的磷酸根，使小分子Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH变为Fmoc-Tyr-OH，由亲水性变为疏水性，Fmoc-Tyr-OH由于疏水性在Fe3O4颗粒表面自组装，形成一层小分子凝胶。
图5为制备得到的Fe3O4纳米颗粒及纳米凝胶的SEM图谱，由图5可以看出，制备得到的纳米凝胶中，Fe3O4纳米颗粒表面裹有一层水凝胶层。
实施例3：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶。
该方法具体包括以下步骤：
(1)纳米颗粒的氨基化修饰：将纳米颗粒分散在溶剂中，之后加入氨基硅烷偶联剂，并在40℃下反应24h，洗涤后得到氨基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL溶剂中，分别加入800mg纳米颗粒及0.9mL氨基硅烷偶联剂；
(2)纳米颗粒的羧基化修饰：将氨基化修饰的纳米颗粒分散在有机溶剂中，之后加入丁二酸酐，并搅拌12h，洗涤后得到羧基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL有机溶剂中，分别加入1000mg氨基化修饰的纳米颗粒及100mg丁二酸酐；
(3)纳米颗粒的酶修饰：将羧基化修饰的纳米颗粒分散在生物缓冲液中，并调节pH值至6，之后加入NHS及EDC，并搅拌1.5h活化羧基，再加入酶，并在35℃进行酰胺反应5h，洗涤后得到酶修饰的纳米颗粒，其中，每100mL生物缓冲液中，分别加入120mg NHS、220mgEDC、120mg羧基化修饰的纳米颗粒及40mg酶；
(4)纳米颗粒表面小分子自组装制备纳米凝胶：将酶修饰的纳米颗粒分散在溶剂中，并调节pH值至7.5，之后加入小分子肽，搅拌反应9h后，即得到纳米凝胶，其中，每100mL溶剂中，分别加入100mg酶修饰的纳米颗粒及20mg小分子肽。
其中，纳米颗粒为二氧化硅纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为200nm。步骤(1)及步骤(4)中，溶剂为水；步骤(2)中，有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮；步骤(3)中，生物缓冲液为2-吗啉乙磺酸。步骤(1)中，氨基硅烷偶联剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷；步骤(3)中，酶为羧酸酯酶。步骤(4)中，小分子肽为NapFFES，NapFFES的化学结构式如下式所示：
实施例4：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶。
该方法具体包括以下步骤：
(1)纳米颗粒的氨基化修饰：将纳米颗粒分散在溶剂中，之后加入氨基硅烷偶联剂，并在70℃下反应8h，洗涤后得到氨基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL溶剂中，分别加入1200mg纳米颗粒及0.8mL氨基硅烷偶联剂；
(2)纳米颗粒的羧基化修饰：将氨基化修饰的纳米颗粒分散在有机溶剂中，之后加入丁二酸酐，并搅拌18h，洗涤后得到羧基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL有机溶剂中，分别加入800mg氨基化修饰的纳米颗粒及120mg丁二酸酐；
(3)纳米颗粒的酶修饰：将羧基化修饰的纳米颗粒分散在生物缓冲液中，并调节pH值至5，之后加入NHS及EDC，并搅拌2.5h活化羧基，再加入酶，并在15℃进行酰胺反应7h，洗涤后得到酶修饰的纳米颗粒，其中，每100mL生物缓冲液中，分别加入100mg NHS、240mgEDC、80mg羧基化修饰的纳米颗粒及60mg酶；
(4)纳米颗粒表面小分子自组装制备纳米凝胶：将酶修饰的纳米颗粒分散在溶剂中，并调节pH值至7，之后加入小分子肽，搅拌反应12h后，即得到纳米凝胶，其中，每100mL溶剂中，分别加入80mg酶修饰的纳米颗粒及25mg小分子肽。
其中，纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为220nm。步骤(1)及步骤(4)中，溶剂为乙醇；步骤(2)中，有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮；步骤(3)中，生物缓冲液包括2-吗啉乙磺酸和柠檬酸。步骤(1)中，氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷；步骤(3)中，酶为酸性磷酸酶。步骤(4)中，小分子肽为Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH。
实施例5：
一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶。
该方法具体包括以下步骤：
(1)纳米颗粒的氨基化修饰：将纳米颗粒分散在溶剂中，之后加入氨基硅烷偶联剂，并在55℃下反应16h，洗涤后得到氨基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL溶剂中，分别加入1000mg纳米颗粒及0.85mL氨基硅烷偶联剂；
(2)纳米颗粒的羧基化修饰：将氨基化修饰的纳米颗粒分散在有机溶剂中，之后加入丁二酸酐，并搅拌6h，洗涤后得到羧基化修饰的纳米颗粒，其中，每100mL有机溶剂中，分别加入1200mg氨基化修饰的纳米颗粒及80mg丁二酸酐；
(3)纳米颗粒的酶修饰：将羧基化修饰的纳米颗粒分散在生物缓冲液中，并调节pH值至5.5，之后加入NHS及EDC，并搅拌2h活化羧基，再加入酶，并在20℃进行酰胺反应6h，洗涤后得到酶修饰的纳米颗粒，其中，每100mL生物缓冲液中，分别加入110mg NHS、230mgEDC、100mg羧基化修饰的纳米颗粒及50mg酶；
(4)纳米颗粒表面小分子自组装制备纳米凝胶：将酶修饰的纳米颗粒分散在溶剂中，并调节pH值至8，之后加入小分子肽，搅拌反应6h后，即得到纳米凝胶，其中，每100mL溶剂中，分别加入120mg酶修饰的纳米颗粒及15mg小分子肽。
其中，纳米颗粒包括二氧化硅纳米颗粒和四氧化三铁纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为180nm。步骤(1)及步骤(4)中，溶剂包括水和乙醇；步骤(2)中，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤(3)中，生物缓冲液为柠檬酸。步骤(1)中，氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；步骤(3)中，酶包括羧酸酯酶和酸性磷酸酶。步骤(4)中，小分子肽包括NapFFES和Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH，NapFFES的化学结构式如下式所示：
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，该方法是先依次对纳米颗粒的表面进行氨基化修饰、羧基化修饰，之后通过酰胺反应将酶修饰在纳米颗粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽转化为凝胶因子，并在纳米颗粒表面自组装形成纳米凝胶；
所述的纳米颗粒为二氧化硅纳米颗粒或四氧化三铁纳米颗粒；
所述的酶为羧酸酯酶或酸性磷酸酶；
所述的小分子肽为NapFFES或Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH，所述的NapFFES的化学结构式如下式所示：
所述的Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的化学结构式如下式所示：
2.根据权利要求1所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)纳米颗粒的氨基化修饰：将纳米颗粒分散在溶剂中，之后加入氨基硅烷偶联剂，并在40-70℃下反应8-24h，洗涤后得到氨基化修饰的纳米颗粒；
(2)纳米颗粒的羧基化修饰：将氨基化修饰的纳米颗粒分散在有机溶剂中，之后加入丁二酸酐，并搅拌6-18h，洗涤后得到羧基化修饰的纳米颗粒；
(3)纳米颗粒的酶修饰：将羧基化修饰的纳米颗粒分散在生物缓冲液中，并调节pH值至5-6，活化羧基后，加入酶并进行酰胺反应，洗涤后得到酶修饰的纳米颗粒；
(4)纳米颗粒表面小分子自组装制备纳米凝胶：将酶修饰的纳米颗粒分散在溶剂中，并调节pH值至7-8，之后加入小分子肽，搅拌反应6-12h后，即得到所述的纳米凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，所述的纳米颗粒的粒径为180-220nm。
4.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(1)及步骤(4)中，所述的溶剂包括水或乙醇中的一种或两种；步骤(2)中，所述的有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种；步骤(3)中，所述的生物缓冲液包括2-吗啉乙磺酸或柠檬酸中的一种或两种。
5.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氨基硅烷偶联剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或两种。
6.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的活化羧基过程为：加入NHS及EDC，之后搅拌1.5-2.5h即可，每100mL生物缓冲液中分别加入100-120mg所述的NHS及220-240mg所述的EDC。
7.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酰胺反应过程中，反应温度为15-35℃，反应时间为5-7h。
8.根据权利要求2所述的一种酶促小分子自组装制备纳米凝胶的方法，其特征在于，
步骤(1)中，每100mL溶剂中，分别加入800-1200mg所述的纳米颗粒及0.8-0.9mL所述的氨基硅烷偶联剂；
步骤(2)中，每100mL有机溶剂中，分别加入800-1200mg所述的氨基化修饰的纳米颗粒及80-120mg所述的丁二酸酐；
步骤(3)中，每100mL生物缓冲液中，分别加入80-120mg所述的羧基化修饰的纳米颗粒及40-60mg所述的酶；
步骤(4)中，每100mL溶剂中，分别加入80-120mg所述的酶修饰的纳米颗粒及15-25mg所述的小分子肽。
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Also Published As
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