CN107058595B

CN107058595B - 血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物

Info

Publication number: CN107058595B
Application number: CN201710463669.8A
Authority: CN
Inventors: 张洪英; 杨佩才; 谢国祥
Original assignee: NANJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: NANJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2037-06-19
Also published as: CN107058595A

Abstract

本发明涉及寄生虫病传播媒介检测领域，具体而言，涉及一种血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物。所述试剂盒包括LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶；所述反应混合液中含有羟基萘酚蓝作为指示剂。所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；还包括一条LF环引物。利用该检测方法的试剂盒可以有效、快速、高特异地对血吸虫虫卵进行检测。

Description

血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物

技术领域

本发明涉及寄生虫病传播媒介检测领域，具体而言，涉及一种血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物。

背景技术

血吸虫也称裂体吸虫(schistosoma)。血吸虫寄生于多数脊椎动物，卵穿过静脉壁进入膀胱，随尿排出。幼虫在中间宿主螺类体内发育。成熟幼虫通过皮肤或口进入终宿主体内。曼森氏裂体吸虫(S.mansoni,即曼氏血吸虫)在大、小肠静脉中，主要分布于非洲和南美洲北部。卵随粪便排出。幼虫进入螺体，再通过皮肤回到终宿主体内。日本裂体吸虫(S.japonicum,即日本血吸虫)主要见于中国大陆、日本、中国台湾、东印度群岛和菲律宾，除人外，还侵袭其他脊椎动物，如家畜和大鼠等。埃及裂体吸虫(S.Haematobium，即埃及血吸虫)主要分布于非洲、南欧和中东。埃及血吸虫生活在膀胱静脉内，卵穿过静脉壁进入膀胱，随尿排出。

血吸虫虫卵的检测方法有很多，现有方法最常见的有：(1)直接涂片法，该方法是在玻片上将病人粪便或急性血吸虫病人的粘液血便粪便直接涂片制备成粪膜，在显微镜下根据虫卵形态学进行鉴别的方法，方法简便，但虫卵检出率低。(2)沉淀法，或者称为集卵法，该方法是通过离心沉淀或静置沉淀或淘洗后，将浓缩的含有虫卵的粪渣涂片，镜检，比直接涂片法检出率有所提高。(3)定量透明法，即改良加藤厚涂片法(Kato-Katz法)，是对虫卵的定量方法，即在固定体积的粪渣中对虫卵进行显微镜下计数的方法。(4)毛蚴孵化法，是利用沉淀法收集到的沉淀虫卵，在无氯的温水(25-30℃) 中培养，虫卵可在数小时孵化出毛蚴。通过在解剖显微镜下对毛蚴的观察，间接对虫卵进行检测。(5)直肠粘膜活体组织检查，该法是用直肠镜或乙状结肠镜从直肠或乙状结肠病变部位钳取一小块肠黏膜作压片，然后在显微镜下观察鉴别虫卵。

然而，现有的检测方法还有很多不完善的地方，例如最常见的直接涂片法是通过形态学区别鉴定来检测，实际操作时粪便中成分各异，如果不是经验丰富的检测者，有时很难区别鉴定形态相似的真菌孢子、不同虫卵及其他微生物，也就是说该法结果是否准确，高度依赖于检测人员形态学区别鉴定的经验；镜检技术的优点是技术简单，容易操作，缺点是对稀便不适应，检出率降低，尤其是改良加藤厚涂片法，对稀便无法制作合乎要求的片子。另外，为了提高检出率，实际操作中往往需要对粪便进行淘洗、浓缩，毛蚴孵化等操作，时间长，而且这个操作的生物安全要求高，而基层单位往往在不具备生物安全要求的条件下操作，对操作人员的健康造成直接威胁。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

用于检测血吸虫虫卵的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括F3和 B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；

所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～4所示。

优选的，如上所述的用于检测血吸虫虫卵的LAMP引物组，所述引物组还包括一条LF环引物，所述LF环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种核酸扩增技术。通过设计识别目的片段6个序列的4 个特异引物，整个反应可以在恒温(60～65℃)条件下1h内完成，由于采用 4个引物，与传统的核酸扩增技术相比，它具有敏感、特异的特点。反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，对操作人员的熟练度和专业水平要求不高，因此该方法特别适合基层或者实验条件较差的试验室进行病原微生物的快速检测。

引物的特异性是LAMP检测方法成败的关键。引物的设计及筛选有其独特的设计原则及规律。LAMP反应中内引物FIP/BIP和外引物F3/B3的特异性决定了反应的特异性。

LAMP技术的引物设计，比PCR技术要复杂。它针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物。若再增加一对环引物(1oop primer)，便可使反应加速，提高扩增效率。引物Tm值是影响LAMP反应正常进行的关键因素，在AT/GC含量正常的引物组中，本申请F3/B3引物和FIP/BIP引物的Tm 值适中，在此温度内引物的扩增效率最佳。

LAMP中的环引物是在LAMP反应中形成环的部位进行加速的，可以提高扩增效率、缩短反应时间。

本发明所采用的各引物的Tm值均符合筛选原则，同时为保证引物末端的稳定性，F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’末端⊿G值要小于等于-4Kcal/mol， F1c和B1c的5’端的⊿G值要小于等于-4Kcal/mol。环引物LF位于F1c和 F2c之间，LF 3’末端⊿G值也要小于等于-4Kcal/mol。

引物之间的距离，从F2 5’端到B2 5’端在120-180bp之间，从F2的5’端到F1c的3’端也就是茎环这一段在40-60bp之间，从F2的5’端到F3的 3’端在0-20bp之间。引物自身不能形成二级结构。

一种用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的 LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶；

优选的，所述试剂盒中还含有指示剂；所述指示剂选自SYBR Green I、 EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的一种；

更优选的，所述指示剂为羟基萘酚蓝，且所述羟基萘酚蓝加入所述反应混合液中，浓度优选为100μM～140μM。

本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为检测血吸虫虫卵提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。

因为产物是双链DNA，也可以通过颜色变化直接观察，即在反应产物中加入SYBRGreen I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶(PI) 等双链DNA荧光显色试剂或者黄连素(berberine)，在荧光灯下观察颜色变化，如Sybr-Green、EvaGreen、PicoGreen、PekoGreen、阳性为绿色荧光，阴性无绿色荧光。而PI阳性为红色荧光，阴性无红色荧光。黄连素在荧光下阳性为黄色荧光，而阴性无黄色荧光；

或者在反应体系中加入20～30mM钙黄绿素(Calcein)和0.3～0.7mM MnCl₂，在反应过程中和反应后观察颜色或荧光变化，可见光下阴性为橙色，阳性为绿色，在荧光灯下阴性无绿色荧光，阳性为绿色荧光。钙黄绿素和 MnCl₂也可在反应结束后加入产物中观察颜色或荧光变化。

羟基萘酚蓝是一种金属离子指示剂，由于反应过程中随着Mg²⁺含量减少会逐渐从浅紫色变成天蓝色，且与本领域常用的SYBR Green I相比，只有有效扩增反应发生，才会出现颜色变化，故不会出现因引物二聚体导致的假阳性。

此外，羟基萘酚蓝的显色不需要额外添加任何成分，因此不会对反应体系的稳定性造成干扰。现有技术扩增结果的观察，需要反应结束后将显色试剂加入，才能观察结果，不能实时观察反应结果；此外，观察结果时需要将PCR管打开，添加显色试剂，由于经过扩增的DNA产物浓度很高，高达初始浓度的10⁹倍，极易造成实验环境污染。本发明优选使用的羟基萘酚蓝指示剂，对反应体系几乎没有抑制作用，可以直接加到反应体系中，在反应过程中随时可以看到颜色变化，不必等到反应完全结束才观察结果，也不需要打开PCR管。

优选的，如上所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，所述反应混合液包括如下成分：

pH为8.6～9.0的15mM～25mM Tris–HCl、1.2mM～1.6mM dNTPs、 8mM～12mM KCl、8mM～12mM(NH₄)₂SO₄、6mM～10mM MgSO₄、0.6M～1.0M 甜菜碱以及体积百分数为0.07％～0.13％的Tween 20。

优选的，如上所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为14～18U/μL。

Bst DNA聚合酶来源于Bacillus stearothermophilus。它有5'→3'的聚合酶活性和双链特异的5'→3'外切酶活性，但没有3'→5'外切酶活性。具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，在体外DNA等温扩增反应中起重要作用。

优选的，如上所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，所述试剂盒还包括去离子水。

优选的，如上所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，所述试剂盒还包括标准血吸虫DNA的阳性对照。

一种血吸虫虫卵的检测方法，包括：

提取待检测的血吸虫虫卵DNA，添加权利要求3～5任一项所述的试剂盒中的试剂组成反应体系进行恒温反应；反应过程中或反应后观察反应液中指示剂的颜色变化或荧光强度变化。

在LAMP循环中产生大量白色的焦磷酸盐镁，沉淀在管底，肉眼可见。所以也可以通过观察白色沉淀，判断结果；为了比较反应产物的多少，可以用分光光度计检测反应产物的混浊度(实际上是检测在LAMP循环中产生的焦磷酸盐)；

最终产物是由不同长度DNA分子组成的混合物，故用2％-3％琼脂糖凝胶电泳，可以看到类似梯状条带，也可以判断阳性扩增。

优选的，如上所述的血吸虫虫卵的检测方法，所述反应体系中，F3、 B3、FIP、BIP以及LF的摩尔比为1:1:(7～9):(7～9):(3～5)；

更优选的，F3、B3、FIP、BIP以及LF的摩尔比为0.2μM:0.2μM:1.6 μM:1.6μM:0.8μM。

优选的，如上所述的血吸虫虫卵的检测方法，所述恒温反应的条件为：

60℃～65℃恒温反应60min～80min；更优选的，65℃恒温反应 66min～70min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明检测对象是日本血吸虫基因组DNA，日本血吸虫基因组 DNA具有保守、稳定的特点，加上我们设计了针对该保守序列的6个位点的4条引物，扩增产物也是具有特异和稳定的特点；从而不依赖于对形态学经验的积累，只需要学会简单的DNA操作即可掌握。

2)、本发明用Bst DNA聚合酶代替常规PCR的DNA聚合酶，该酶耐高温，有链置换功能和DNA 5’→3’聚合活性，在60-65℃等温条件下对靶 DNA实现特异扩增；由于不需要高温变性、低温退火和延伸的循环，省去了常规PCR变温所需要的时间，从而实现快速高效的DNA扩增。

3)、本发明尽可能地减少样本暴露，最大程度地保护样本和操作人员，同时检测时间也不长，只需要1小时。

4)、本发明所使用的仪器都是常规仪器，离心机和恒温水浴锅或者其他恒温设备，不需要昂贵的PCR仪设备，成本大大降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的引物，加LF或不加LF的对比实验结果；

图2中显示的是本发明提供的引物组可以对血吸虫虫卵DNA进行有效扩增，加水阴性对照在延长反应时间后也出现阳性反应。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

血吸虫虫卵DNA的提取方法

1、粪便样本的准备：新鲜采集的粪便取少量，约0.5克，置于1.5毫升离心管中，加1毫升生理盐水，振荡器上充分振荡，14000g离心30秒，弃上清；保存在酒精或其他溶液中的粪便，重复洗3次，弃上清。

2、裂解：沉淀中依次加入200微升裂解液(4M尿素，200mM Tris,20 mM NaCl，200mMEDTA,pH7.4)和40微升蛋白酶K(1mg/mL)，迅速混匀，55度孵育0.5-1小时，直到液体澄清。用1毫升注射器(去针头) 来回吹吸3次。

3、核酸沉淀：加200微升结合液(6M盐酸胍，10M尿素，10mM Tris-HCL,20％TritonX-100(v/v),pH 4.4),立刻混匀，70度孵育10分钟。加入100微升异丙醇，充分混匀。

4、膜吸附核酸：将所有液体转移到吸附柱，8,000g离心1分钟，弃穿透液；

5、去抑制剂：吸附柱中加入500微升抑制剂去除液(5M盐酸胍，20mM Tris-HCL,40％无水乙醇(v/v)，pH 6.6)，8,000g离心1分钟，弃穿透液；

6、洗涤:吸附柱中加入500微升洗涤液(20mM NaCl，2mM Tris-HCL, 80％无水乙醇(v/v),pH 7.5)，8,000g离心1分钟，弃穿透液。重复一次；

7、洗脱DNA：吸附柱中加入100微升70度预热的洗脱液(10mM Tris-HCL,pH 8.5)，8,000g离心1分钟。

8、冻存洗脱下来的DNA液待测。

实施例2

环介导等温DNA扩增：取3个0.2mL PCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；

各管中依次加入如下成分：

反应混合液：15mM Tris–HCl(pH8.6)、1.6mM dNTPs、8mM KCl、25mM 钙黄绿素、0.5mM MnCl₂、12mM(NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、1.0M甜菜碱 (Sigma–Aldrich)以及体积百分数为0.13％的Tween 20；

16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；

混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.4μM FIP和1.4μM BIP以及1.0μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5 所示。

检测管中加入5μL实施例1制备得到的DNA；阴性对照管加入5μL去离子水阴性对照；阳性对照管加入标准血吸虫DNA的阳性对照。

短暂离心后放于63℃恒温水浴锅中反应60min；85℃，2分钟，灭活 Bst DNA聚合酶。反应过程中，如果有靶DNA扩增就会有显色反应，随时可以观察颜色变化，可见光下阴性为橙色，阳性为绿色，在荧光灯下阴性无绿色荧光，阳性为绿色荧光。

实施例3

各管中加入如下成分：

反应混合液：25mM Tris–HCl(pH9.0)、1.2mM dNTPs、8mM KCl、100μM 羟基萘酚蓝、8mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.6M甜菜碱(Sigma–Aldrich) 以及体积百分数为0.07％的Tween20；

16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；

混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.8μM FIP和1.8μM BIP以及0.6μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5 所示。

短暂离心后放于63℃恒温水浴锅中反应60min；85℃，2分钟，灭活 Bst DNA聚合酶。反应过程中，如果有靶DNA扩增就会有显色反应，随时可以观察颜色变化，浅紫色的为阴性反应，天蓝色为阳性反应。

实施例4

各管中加入如下成分：

反应混合液：20mM Tris–HCl(pH8.8)、1.4mM dNTPs、10mM KCl、 120μM羟基萘酚蓝、10mM(NH₄)₂SO₄、8mM MgSO₄、0.8M甜菜碱 (Sigma–Aldrich)以及体积百分数为0.10％的Tween 20；

16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；

混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.6μM FIP和1.6μM BIP以及0.8μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5 所示。

实验例1

由于日本血吸虫经过长期进化，与宿主高度适应，保留了很多与宿主相似的基因，找到一个特异的靶基因作为检测目标，实在不易。为了避开基因家族和表达基因的干扰，我们选择了一段非表达序列(GenBank: FN328142.1)作为靶标。

GenBank:FN328142.1

由此获得外部引物对，F3和B3，以及内部向前引物FIP(由F1c和F2 组成)、内部向后引物(由B1c和B2组成)，以及加速引物LF。所有引物的方向都是5’→3’。

大量研究和应用结果表明，没有环引物的LAMP法是不成功的，其反应速度较慢；相反地，加了环引物的反应大大提速(图1)。图1中显示的是中拷贝的样本中加入LF引物后反应效率大大提高。

(注：图1为本发明的引物，加LF或不加LF的对比实验结果。图1 目标DNA是血吸虫虫卵DNA阳性对照。横坐标：时间(min)；纵坐标：图1-1为软件计算相对值，图1-2为浑浊度。由仪器检测获得。)

(注：图2目标DNA是由不同数量血吸虫虫卵提取总DNA或水阴性对照。横坐标：时间(min)；纵坐标：浑浊度。由仪器检测获得。)

实验例2

灵敏性研究

1)、标准靶DNA分子模板的制备

取纯化的阳性对照样本DNA，用TE缓冲液进行稀释100pg，10pg，1pg， 100fg，10fg，1fg，0.1fg，0.01fg，0.001fg。

2)、环介导等温DNA扩增与结果判断

取0.2mL PCR用薄壁管30个，按实施例4所述的方法加样并操作，区别在于，依次所加DNA为上步制备的标准靶DNA分子模板(1～9号管)，多余的一个管加入5μL去离子水作为阴性对照(10号管)。每个样品做3 个重复

反应过程中，在自然光下观察1～7管之间无差异，都能显示天蓝色的阳性反应。第8、9、10管为浅紫色。说明该方法的敏感性为0.1fg/μL DNA。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京市疾病预防控制中心

<120> 血吸虫虫卵检测方法及该方法所用的试剂盒和引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgacgtcgct ttttgatcc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgcggttcc tctcgtact 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgggtgaac aatccaacgc tttcgatgtc ggctcttcct 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaccgtcgt gagacaggtt aggcaacggc cagattgtac t 41

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgaattct gcttcacaat ga 22

Claims

1.用于检测血吸虫虫卵的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对以及LF环引物；

所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO: 1~4所示；

所述LF环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

2.一种用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶和指示剂；

所述指示剂选自碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述指示剂为羟基萘酚蓝，且所述羟基萘酚蓝加入所述反应混合液中，浓度为100μM~140μM。

4.根据权利要求3所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述反应混合液包括如下成分：

pH为8.6~9.0的15mM~25mM Tris–HCl、1.2mM~1.6mM dNTPs、8mM~12mM KCl、8mM~12mM(NH₄)₂SO₄、6mM~10mM MgSO₄、0.6M~1.0M甜菜碱以及体积百分数为0.07%~0.13%的Tween 20。

5.根据权利要求3所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为14~18U/μL。

6.根据权利要求3所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括去离子水。

7.根据权利要求3所述的用于检测血吸虫虫卵的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准血吸虫DNA的阳性对照。

8.一种用于非疾病诊断目的的血吸虫虫卵的检测方法，其特征在于，包括：

提取待检测的血吸虫虫卵DNA，添加权利要求3~5任一项所述的试剂盒中的试剂组成反应体系进行恒温反应；反应过程中或反应后观察反应液中指示剂的颜色变化。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系中，F3、B3、FIP、BIP以及LF的摩尔比为1:1:（7~9）:（7~9）:（3~5）。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述恒温反应的条件为：

60℃~65℃恒温反应60min~80min。