CN107058562B - Snp位点的应用及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SNP位点的应用及其检测试剂盒。本发明提供了60个SNP位点在评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的60个特定SNP位点进行检测，结合特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，无需任何侵入式的检测，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SNP位点的应用及其检测试剂盒。
背景技术
目前实体器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行肝功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
因此，寻求一种可灵敏、特异、准确的评估肝移植物的损伤状况和排斥风险的无创伤检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供SNP位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用及其检测试剂盒，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确的评估肝移植物的损伤状况和排斥风险，无需进行任何创伤检测。
本发明提供了SNP位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点选自：
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本发明研究表明，将上述60个SNP位点作为检测靶点，计算得到的受体游离DNA中供体游离DNA的含量(GcfDNA供受比)能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本发明还提供了一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，包括序列如SEQ ID No.1～120所示的引物和序列如SEQ ID No.121～240所示的探针。
本发明提供的上述试剂盒，SEQ ID No.1～120所示的引物和SEQ ID No.121～240所示的探针用于扩增、检测60个SNP位点，序列如下：
优选的，SEQ ID No.121～240所示的探针中，用于检测SNP位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记NFQ和MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用的种类即可。在本发明提供的具体实施例中，检测SNP位点的两条探针的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
本发明提供的试剂盒还包括ddPCRTM ProbeSupermix和超纯水。
本发明还提供一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.1～120所示的引物和序列如SEQ ID No.121～240所示的探针，制备数字PCR反应微滴，将制备好的反应微滴转移至96孔板中，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果并独立分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNP No#1和SNP No#2为例，SNP No#1的碱基比约等于SNP No#2的两倍(2±0.4)，则判定SNP No#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
在本发明提供的具体实施例中，数字PCR的反应体系为：
所述SNP位点的引物和探针为权利要求3所述试剂盒中的引物和探针。
在本发明提供的具体实施例中，所述PCR反应程序如下：
95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
本发明提供了SNP位点在评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的60个特定SNP位点进行检测，结合数字PCR技术以及特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段，具有如下优势：
(1)无创，5～10ml静脉采血即可进行检测；
(2)灵敏，选择现有PCR技术中精准度最高的数字PCR设备作为检测平台；
(3)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
(4)特异，检测出的特定游离DNA直接来源于肝脏移植物，可特异性的反映出肝脏移植物的健康状况；
(5)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、DSA检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者血液样本即可完成。
具体实施方式
本发明公开了SNP位点的应用及其检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明提供的SNP位点的应用及其检测试剂盒中所用试剂均可由市场购得。引物序列和探针序列由公司合成。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1采用本发明提供的试剂盒评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险血浆中总游离DNA提取
1、使用Streck无创采血管静脉采集一名肝移植术后2周受者血液10ml；
2、将Streck无创采血管采集的血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min；取上层血浆约4～6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4～6ml于新的15ml离心管中；
3、取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10～40ng/ul。
制备数字PCR反应微滴
1、配置数字PCR反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行PCR反应；60个SNP位点的检测体系，共计60管，反应配制如下：
其中，用于检测SNP位点的引物包含上、下游引物，各0.125μL，共0.25μL；探针为两条，各0.125μL，共0.25ul。
2、将配置好的反应体系加入到微滴发生卡DG8TM Cartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油Droplet Generation Oil for Probes，最后用封膜DG8TMGaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备。
3、将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行PCR反应，反应程序设置如下：
结果分析
PCR反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果，见表1。
表1 60个SNP位点的原始数据
按照以下方法对表1的数据进行分析：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNP No#1和SNP No#2为例，SNP No#1的碱基比约等于SNP No#2的两倍(2±0.4)，则判定SNP No#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
评价标准：GcfDNA供受比≤10％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；GcfDNA供受比＞10％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
根据表1的数据计算得到GcfDNA供受比(供者游离DNA/受者游离DNA)为35.4±1.2％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
实施例2
使用EDTA采血管采集实施例1中肝移植术后2周受者的血液2ml，进行肝功常规检测，结果如表2所示。
表2受者肝功常规检测结果
| 检验项目 | 结果 | 参考范围 |
| 谷丙转氨酶(ALT) | 130.0↑ | 0～40U/L |
| 谷草转氨酶(AST) | 296.2↑ | 0～40U/L |
| 谷草/谷丙(AST/ALT) | 2.28↑ | 1～2 |
| 总蛋白(TP) | 72.5 | 60～87g/L |
| 白蛋白(ALB) | 41.0 | 35～55g/L |
| 球蛋白(GLB) | 25.5 | 20～30g/L |
| 白球比(A/G) | 1.61 | 1.5～2.5 |
| 总胆红素(TBILI) | 22.6↑ | 5.1～19umol/L |
| 直接胆红素(DBILI) | 7.6↑ | 1.7～6.8umol/L |
| 间接胆红素(IBILI) | 15.0↑ | 0～12umol/L |
| 碱性磷酸酶(ALP) | 96.0 | 20～110U/L |
| r-谷氨酰转肽酶(GGT) | 44.0 | 0～50U/L |
结果显示，该肝移植术后2周受者的肝脏移植物存在实质性损伤，和本发明检测结果吻合，此外，采用本发明提供的试剂盒对其他50名肝移植患者进行检测，检测结果均与肝功常规检测结果相吻合，表明本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反映肝脏移植物的健康状况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都仕康美生物技术有限公司
<120> SNP位点的应用及其检测试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
<400> 1
gtggttgggt cattctta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagtgtctgc tagctgta 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtggtgcag ctggctgg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgaatgggt agatttct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccagccaag gggagagc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcattgaaa atttcttc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ataagtttaa cagctgac 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaaaatacac accaagta 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acctaccata tgttcttt 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccctttaatt tacaagta 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctcccatttc atagttag 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tatgctccct agaataat 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgcacgtatt ggaagatg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aggggcgaga attgtcac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaacaggaac caatagca 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acataatggg tacatgcc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aagaaaagat cattagct 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgtaatccat agcatcac 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctgaaagtta tgtttttt 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggtctcttga atgatagt 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcagcgtgta ttacctga 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tggcctttta aaaggaac 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acttctgatt aattctat 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atatcttttt gttgctaa 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcccagcggc acttcatg 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggttcatttg ttaatgtg 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
taggctcagg atgacaga 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggtttgttgt tcaattct 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
attgcattgc aattgata 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acttagatgc catagaca 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caggaatgag ctaggatg 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
atctccacct cacaccac 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctttctgagg tcctgggc 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
acccagagct cctccaga 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gacagtggat ggaggggt 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ccagccgtgc tgaatgca 18
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cattctctgg ctaactcc 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ttgtatgtct atttctat 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgtaagaagc tgtgtttt 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aaggacagta agcagaca 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cattccccac gcctcccg 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
acattcctgc cacctgct 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ggaatggaga agaaggtg 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aaacactaaa aacagcca 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tctactaaat aagggtct 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
agtagagggc aggagtgt 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ccctcaccat ccaaggca 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gccgcagccc tggtagac 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atcctccctt ctcccacc 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ctcccgtggt attagcag 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ccgtgtgtgc tgcctagc 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
aatggaatca ggcagaaa 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
cagctcaatg cccagctg 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gcttggtggc cacgaccc 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ccacttcctc ctcaggga 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gggagacaca ggccagtc 18
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
aggacaaaac tgctatca 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ctataaacgc cagcagga 18
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
agtctctttc cagattcc 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tttcttggca ataatacc 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tttgcctacc agagtcac 18
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gcttcagagg atgtccca 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
aaaccttaga aaggaaga 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
tcttttttgc atatttca 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cggggtaatg ctactcca 18
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gtgttcttat aggcaaag 18
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ttatcaaatc actctgtt 18
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tttgtagttt gcatacac 18
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
acaaaccccc accaccgc 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
atctccttac caccaccc 18
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
cccgactgaa cacaccgg 18
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gctgtgggac tgggggca 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
aaaaataact tctaaaat 18
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
cacacagtca aggatggg 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tatatgagat attcagca 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
gggttaacaa gaaattct 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
ggccggctcc ctgctaat 18
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ggttttctgc tccatccc 18
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ctctgaagga gacctgtg 18
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
cacgtagaga aaattatg 18
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
caccacagat gtagtcag 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
aggccttgga tgaaaatt 18
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
ccttgctaag acgtttag 18
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
caggtgagcc agggtgta 18
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
aatgttaact tgctattt 18
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
agtcaaggat ggtggata 18
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
taagaaagct cgcgcata 18
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
agcagatggt catggtga 18
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ggtcaccagt caggagcc 18
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
atacagaaat cacaaaaa 18
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
ggggccatat ctccagca 18
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
cgagatgggt gcagaggc 18
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
aacctggcct ttcaacat 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
ccctctctag ctggctct 18
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
gcacggtgcc tgcacagc 18
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
tggcagctta accctgct 18
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
cctacaacag ggttgttg 18
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
tcctgcctcc aacctcag 18
<210> 99
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
agaggcccct ttcatctt 18
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
cctcttgcta tcccttcc 18
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
ccaggagaac cacttgag 18
<210> 102
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
tcaaagcaac gtgtcaat 18
<210> 103
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gcaggaggca agaacaag 18
<210> 104
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
ggtcactctg atctcagc 18
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
cactgagcat gacaacca 18
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
catttgggga cttccctt 18
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
atctgcgcac aagtcctc 18
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
aaagaaatgt ggaggatg 18
<210> 109
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
ccttgttctc accttttc 18
<210> 110
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
agagccaggt ggccgggg 18
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gaggatccac gtcgccca 18
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
tggctggatg tggaggag 18
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
ggaagcagga ggcaagaa 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
ggtcactctg atctcagc 18
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
tcaaagactg ccagacac 18
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gtgaaacagg caaccatt 18
<210> 117
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
aaatgataac tgtaggcc 18
<210> 118
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tagagccaat ggccaatc 18
<210> 119
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
tgttctatta ataggcag 18
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
tccctctcca tcactccc 18
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
tgcaccagaa ccatc 15
<210> 122
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
tgccccagaa ccatc 15
<210> 123
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
cacatcctcg ctcac 15
<210> 124
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
cacgtcctcg ctcac 15
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
ccaaattgct cctgg 15
<210> 126
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ccagattgct cctgg 15
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
tcacgctatg gtgga 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
tcatgctatg gtgga 15
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
agagctttgg tggga 15
<210> 130
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
agatctttgg tggga 15
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
agtaactaac tttta 15
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
agtagctaac tttta 15
<210> 133
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
agggacagag gcca 14
<210> 134
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
agggactgag gcca 14
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
tgtcctgacc tgggt 15
<210> 136
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
tgttctgacc tgggt 15
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
tgtaccccaa aatga 15
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
tgtgccccaa aatga 15
<210> 139
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
aggcatatga actca 15
<210> 140
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
aggtatatga actca 15
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
actcgcccga tcatt 15
<210> 142
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
acttgcccga tcatt 15
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
attaagttta tttgg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
attgagttta tttgg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
aggcaggcgt ggagg 15
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
aggcgggcgt ggagg 15
<210> 147
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
cagactagtg agagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
caggctagtg agagc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
atcctctttt ccaca 15
<210> 150
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
atcttctttt ccaca 15
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
tgacatctaa tctcc 15
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
tgacgtctaa tctcc 15
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
cgggatctgc gtgcg 15
<210> 154
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
cgggatttgc gtgcg 15
<210> 155
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
cagaaccccc tctgg 15
<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
caggaccccc tctgg 15
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
cataccaaca tgaaa 15
<210> 158
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
catgccaaca tgaaa 15
<210> 159
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
accagtttga gagca 15
<210> 160
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
accggtttga gagca 15
<210> 161
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
agcccgtgca gggct 15
<210> 162
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
agccggtgca gggct 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tttcagagca ttttt 15
<210> 164
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
ttttagagca ttttt 15
<210> 165
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
tggaagttgt tttta 15
<210> 166
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
tggacgttgt tttta 15
<210> 167
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
ctgccagcag aagtg 15
<210> 168
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
ctgtcagcag aagtg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
tgccagaggt gtggc 15
<210> 170
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
tgccggaggt gtggc 15
<210> 171
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
tcacgcccct cattc 15
<210> 172
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
tcaggcccct cattc 15
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
cgtcgagtgc cagga 15
<210> 174
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
cgttgagtgc cagga 15
<210> 175
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
tctagagccc accag 15
<210> 176
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
tctggagccc accag 15
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
ttacctgtgc tgtgt 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
ttatctgtgc tgtgt 15
<210> 179
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
atacacctct tgtttt 16
<210> 180
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
atacgcctct tgtttt 16
<210> 181
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
tgcaacgtgt cctta 15
<210> 182
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
tgcgacgtgt cctta 15
<210> 183
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
aggctgttac agctg 15
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
aggttgttac agctg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
tcgcagcatc tttga 15
<210> 186
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
tcgtagcatc tttga 15
<210> 187
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
ttcagccttt gcaaa 15
<210> 188
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
ttctgccttt gcaaa 15
<210> 189
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
tgggctttta tttta 15
<210> 190
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
tgggttttta tttta 15
<210> 191
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
cccaccagga gtggg 15
<210> 192
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
cccgccagga gtggg 15
<210> 193
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 193
cacagtaacc aaaaa 15
<210> 194
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
cacggtaacc aaaaa 15
<210> 195
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
agacagtggg aaggg 15
<210> 196
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 196
agacggtggg aaggg 15
<210> 197
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
tgagcggcga gggat 15
<210> 198
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
tgaggggcga gggat 15
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
ataataagca cgact 15
<210> 200
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
atactaagca cgact 15
<210> 201
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
aagcttcctg gggac 15
<210> 202
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
aagtttcctg gggac 15
<210> 203
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
agaccgttct gatg 14
<210> 204
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
agactgttct gatg 14
<210> 205
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
ccactgatcc taact 15
<210> 206
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
ccattgatcc taact 15
<210> 207
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 207
agaacaaaga ttttc 15
<210> 208
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 208
agagcaaaga ttttc 15
<210> 209
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 209
tgtcatcttt ttaac 15
<210> 210
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 210
tgtcgtcttt ttaac 15
<210> 211
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 211
ccaatcccgc ccgcc 15
<210> 212
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 212
ccagtcccgc ccgcc 15
<210> 213
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 213
agcagtttgt gggga 15
<210> 214
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 214
agctgtttgt gggga 15
<210> 215
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 215
tccatgtcta tgttc 15
<210> 216
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 216
tccttgtcta tgttc 15
<210> 217
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 217
gtgcgatgaa atgga 15
<210> 218
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 218
gtgtgatgaa atgga 15
<210> 219
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 219
taccggtaag aaaag 15
<210> 220
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 220
tactggtaag aaaag 15
<210> 221
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 221
agaccatacc acaaa 15
<210> 222
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 222
agactatacc acaaa 15
<210> 223
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 223
aggatagctg tagaa 15
<210> 224
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 224
aggatggctg tagaa 15
<210> 225
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 225
tggaactttc attcc 15
<210> 226
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 226
tgggactttc attcc 15
<210> 227
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 227
ccgagccaga tgcca 15
<210> 228
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 228
ccgtgccaga tgcca 15
<210> 229
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 229
tgcccgatca tgttc 15
<210> 230
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 230
tgcctgatca tgttc 15
<210> 231
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 231
cccattcttt cccag 15
<210> 232
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 232
cccgttcttt cccag 15
<210> 233
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 233
aggatagctg tagaa 15
<210> 234
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 234
aggatggctg tagaa 15
<210> 235
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 235
aaaaagagaa gggag 15
<210> 236
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 236
aaagagagaa gggag 15
<210> 237
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 237
tggccatttt atagg 15
<210> 238
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 238
tgggcatttt atagg 15
<210> 239
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 239
ctgcctctgc aaccc 15
<210> 240
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 240
ctgtctctgc aaccc 15
Claims (4)
1.检测SNP位点的引物在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：
rs2012852、rs2071985、rs867983、rs218503、rs407930、rs2070849、rs2067003、rs2269951、rs2269952、rs399714、rs469783、rs2074012、rs179785、rs84933、rs2076537、rs2071277、rs2075817、rs1007311、rs400218、rs1064416、rs2076416、rs2076435、rs2074428、rs2070776、rs2071427、rs2071502、rs2073900、rs2071484、rs518471、rs2279096、rs2278945、rs474949、rs1381532、rs2279984、rs2279985、rs1278278、rs2279547、rs2270181、rs2070669、rs2070759、rs1635537、rs2070876、rs624707、rs1289315、rs2070340、rs926027、rs2070777、rs2238354、rs2076237、rs2075852、rs2076393、rs2251252、rs362549、rs2268082、rs2070351、rs2070356、rs2251252、rs2070438、rs521861和rs2282614。
2.一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，其特征在于，包括序列如SEQ ID No.1～120所示的引物和序列如SEQ ID No.121～239所示的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，3’端标记NFQ和MGB。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddPCRTMProbeSupermix和超纯水。
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