CN107058352A - 具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用。该基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列，该基因编码蛋白为SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。本发明首次从绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）中分离到肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白（peptidyl‑prolylcis‑transisomerases,PPIase）基因DvPPIase，并通过转化酵母细胞证明该基因具有耐盐功能，可用于改良农作物性状。

Description

具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用。特别涉及一种绿色杜氏藻（Dunaliellaviridis）肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白（peptidyl-prolylcis-transisomerases,PPIase）基因DvPPIase的核苷酸序列、编码蛋白DvPPIase，及其在提高生物耐盐能力和在改良农作物性状中的应用。

背景技术

盐碱化是影响植物生长的最重要的环境压力之一，世界20%的可耕土地严重的盐渍化，它严重影响了农作物的产量和生产力。克隆植物的耐盐基因，分析探讨相关的耐盐机制，并应用于作物品种改良和盐碱地利用，是未来农业生产一个重要的研究方向。

杜氏藻属(Dunaliella)是自然界中广泛存在的一种无细胞壁的真核单细胞绿藻，广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中，尤其在高盐水域中是主要种群，很容易从自然环境中分离得到。其细胞外只有一层弹性糖蛋白外膜，隶属绿藻门、真绿藻纲、团藻目、盐藻科、盐藻属。自从1905被命名后，在这一个世纪以来，盐藻成为研究藻类对盐适应性的最为方便的模式生物。绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）是杜氏藻属中具有代表性的一个种。该种又称杜氏盐藻、盐生绿色杜氏藻等，它是已知最耐盐的真核生物。对环境具有极强的适应能力，可以适应0.05 M- 5.5 M NaCl、8-35℃、pH6-9的生长条件。盐藻还具有非常强的渗透调节能力，它一次最大可以耐受3~4倍的渗透压的变化；如果通过梯度改变渗透压，盐藻可以耐受7倍以上的渗透压的变化。此外，它对营养、光照、温度、pH值、重金属等环境因子造成的胁迫也有很好的耐受性。极强的耐盐能力、简单的细胞结构以及便利的培养条件，使绿色杜氏藻成为研究植物适应高盐胁迫的分子机制的重要的基因资源宝库。

肽基脯氨酰异构酶 (Peptidyl-prolylisomerases, PPIase)可以参与调节转录因子的活性，催化加速肽基脯氨酸的顺反异构化，在蛋白质的折叠/解折叠中起重要作用。它也可能参与蛋白质复合物的组装/解组装、蛋白质运输及调节蛋白质活性。PPIase具有三个家族：亲环蛋白(cyclophilin)家族、FK506结合蛋白(FKBP)家族、小菌素家族(parvulinfamily)。这三个家族在主要序列和三维结构上并不相似，却能完成同样的反应，都能使蛋白质脯氨酸残基N-末端一边的肽键进行顺反异构化。其中FKBP具有底物专一性，可以和免疫抑制剂FK506以及雷帕霉素特异性结合。除了具有PPIase 酶活性, FKBPs 还充当着分子伴侣的角色, 提供蛋白质之间相互作用的结合位点，与其他蛋白相互作用从而调控不同的生化过程。该家族基因在植物的响应胁迫和不同生长发育过程中都扮演着重要角色。在调控基因表达和光合适应性方面也具有广泛的生物学功能。目前还没有文献报到具有耐盐的功能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有耐盐功能的基因，该基因是从绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）中分离出来的肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白（peptidyl-prolyl cis-trans isomerases,PPIase）基因，称为DvPPIase。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明目的之三是提供利用基因提高生物耐盐性方面的应用，其特征在于含有DvPPIase基因的盐敏感酵母细胞可以获得一定的耐盐能力。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有耐盐功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

一种上述基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。

一种上述的具有耐盐功能的基因在提高生物体耐盐能力中的应用。

一种上述的具有耐盐功能的基因在改良农作物性状中的应用。

本发明通过逆境胁迫的方法，从绿色杜氏藻中克隆到了一个肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白基因，并通过实验证明了它具有耐盐的功能。克隆分析绿色杜氏藻中DvPPIase基因有助于深入理解绿色杜氏藻抗盐机制，同时也会为生物耐盐基因工程和分子育种提供了基因资源。本发明首次从绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）中分离到肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白基因DvPPIase，并通过转化酵母细胞证明该基因还具有耐盐功能和改良农作物性状的应用价值。

附图说明

图1为本发明的DvPPIase基因编码蛋白的物种间同源性分析图。红色方框标注为DvPPIase基因编码蛋白的的第118-218位氨基酸，即为属于FKBP_C超家族的肽基脯氨酸顺反异构酶PPIase的保守结构域。

图2为本发明的DvPPIase基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白PPIase家族。

图3为本发明的DvPPIase基因在酵母突变体G19中的功能分析。即含DvPPIase完整ORF的EST序列插入到酵母表达载体pAJ401中，转化酵母盐敏感突变体G19，在含不同浓度的NaCl的表型展示培养基上进行表型测定。

具体实施方法

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.）或酵母遗传学方法（Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998出版）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：DvPPIase全长编码区的克隆与分析

对绿色杜氏藻D. viridis 受不同浓度盐诱导的cDNA 文库EST序列（表达序列标签）进行分析，通过序列比对，分离到了一个绿色杜氏藻肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白基因，命名为DvPPIase。该EST序列全长816 bp，含有DvPPIase完整的开放阅读框（ORF）、Kozak序列（gccatgc）以及poly(A)结构，见序列表SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

实施例二DvPPIase编码的蛋白结构、同源分析及定位预测

Vector NTI软件的分析结果显示：该基因编码一个含225个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为24.7 kDa，等电点为8.64。该基因编码的蛋白C端第118-218位氨基酸具有保守的FKBP_C型的肽基脯氨酸顺反异构酶结构域，参见图2。图3为本发明的DvPPIase基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于肽基脯氨酸顺反异构酶蛋白家族。DvPPIase与其他物种的PPIase蛋白具有一定的同源性。它与藻类的同源蛋白相似度在60-69%，与高等植物的同源蛋白相似度低于60%。

通过信号肽预测软件（SignalP4.1）分析显示DvPPIase蛋白的第24-25位点存在一个存在一个剪切位点。TMHMM预测显示DvPPIase蛋白无跨膜结构。WoLFPSORT 软件预测表明DvPPIase蛋白定位在叶绿体中。

实施例三DvPPIase在酵母突变体中的功能分析

（一）酵母表达载体的构建：首先将含有DvPPIase完整ORF的EST序列（编号6376）构建到酵母表达载体中：我们将6376序列利用限制性内切酶位点EcoR I和Xho I构建到酵母表达载体pAJ401中。

（二）转化酵母：使用LiAc热激转化法将含有6376的重组克隆转化到酵母盐敏感突变体G19（Mat∂, ura3 his3 trp1 ade2 ena1△::ena4△）中。

（二）酵母转化子的表型鉴定

所用基本培养基为AP培养基，并加入所需氨基酸。筛选标记为尿嘧啶营养缺陷。转入载体为pAJ401的转化子表型展示培养基，添加2%的半乳糖作为碳源。所用表型展示培养基：以不含NaCl的AP培养基为对照生长条件，加入不同浓度的 NaCl的AP培养基为耐盐表型分析生长条件。

首先将酵母转化子在AP培养基中培养至OD₆₀₀=0.6，以5 μL为一个滴度，并以5倍稀释度为系列稀释滴度，在表型展示培养基上展示酵母转化子的耐盐表型。在pAJ401组成型强表达启动子启动下，6376成功互补了酵母盐敏感突变体G19的表型，参见图3；结果表明转化了含DvPPIase完整ORF的EST序列的酵母盐敏感突变体可以在220 mM NaCl下仍然有表型，说明了DvPPIase基因能够部分恢复酵母突变体的功能，证明了DvPPIase能够有效地提高生物体的耐盐能力。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

<110> 上海大学

<120> 具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> 绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）

<400> 1

cgcggggcgg cgctctaaac atggatcccc gggctgcaga attcggcacg aggcagcact 60

gcacgctgag gttcattgga actccacttc cactttaagg aggccatgct ctgcctctcc 120

agcagcaggc tccaatgcag caggagcgcg ccacagcgtg aaccgcggct gtgctccagc 180

actcctagcg tgtgcgcgca ggcacacaga ggctcaccag ccgcaccgca gcaagcgcat 240

cggagggagc tactgggtat gggtgtcacc ctcacttcac tcgccctcct cccacccacg 300

ccactcccac tgcaagctgc agagagtgtg cttgagccaa tggaagctct caaggacaaa 360

gactatggaa agcccaggcg caggtactcg gattatgtgc tgaccccgtc aggactgcag 420

taccaggaca tccgcgaggg aacaggggac ccaattgaag aaggggatac agctgttgtg 480

gactgggacg ggtacaccat cggatattat ggaagaccgt tcgaaggcag gaacaagcct 540

aaaggatctg catttacagg ggacaacaag gattacttga gatttaagct cggttcgcac 600

accatgattc cgggctttga agaagcagtg tacggcatga aggcaggcgg cttccggaga 660

atagtagtgc cgccggagct gggataccct cctgagaagg gctggaacgc tcagggtccg 720

aagcccacca ccttctcggg gcagcgtgcc ctgagctttg tgctgtcaac cagggatgat 780

tgacaaacct gctctttaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 816

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> 绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）

<400> 2

MLCLS SSRLQ CSRSA PQREP RLCSS TPSVC AQAHR GSPAA PQQAH RRELL GMGVT LTSLA 60

LLPPT PLPLQ AAESV LEPME ALKDK DYGKP RRRYS DYVLT PSGLQ YQDIR EGTGD PIEEG 120

DTAVV DWDGY TIGYY GRPFE GRNKP KGSAF TGDNK DYLRF KLGSH TMIPG FEEAV YGMKA 180

GGFRR IVVPP ELGYP PEKGW NAQGP KPTTF SGQRA LSFVL STRDD 225

Claims (4)

1.一种具有耐盐功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

2.一种根据权利要求1所述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。

3.一种根据权利要求1所述的具有耐盐功能的基因在提高生物体耐盐能力中的应用。

4.一种根据权利要求1所述的具有耐盐功能的基因在改良农作物性状中的应用。