CN106999572A - 用于诱导对单纯疱疹病毒2型(hsv‑2)的免疫应答的治疗组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于诱导对单纯疱疹病毒2型(HSV‑2)的免疫应答的治疗组合物和方法。更具体地，本发明涉及通过引入和表达编码HSV gD2的DNA疫苗来诱导受试者中的免疫应答的方法。

Description

用于诱导对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的免疫应答的治疗组合 物和方法

发明领域

本发明大体上涉及用于诱导对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的免疫应答的治疗组合物和方法的领域。更具体地，本发明涉及通过引入和表达编码HSV gD2的DNA疫苗来诱导受试者中的免疫应答的方法。

发明背景

单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是疱疹病毒科(Herpesviridae)的成员，并且是生殖器溃疡病的主要原因。该病毒感染了全世界5亿多人(Looker等人，2008)。HSV-2在感觉神经根神经节中达到潜伏状态，并且当身体的免疫功能下降时再激活，引起反复发作(Gupta等人，2007)。然而，控制病毒潜伏期的机制仍然难以捉摸。虽然生殖器疱疹是世界范围高度流行的疾病，但目前没有可用的针对HSV-2感染的疗法。

1.1 HSV-2发病机理

HSV-2进入需要病毒糖蛋白D(gD2)与其受体的复合(complexation)。gD2受体包括疱疹病毒进入介质(HVEM)、连接蛋白-1(nectin-1)和-2以及硫酸肝素中的特异性位点(Spear等人，2000)。在急性HSV感染期间，gD2与HVEM相互作用，导致生殖器粘膜处随后的CD8⁺回忆应答降低(Kopp等人，2012)。

HSV-2还通过降低I型干扰素(即，IFN-α和IFN-β)的水平和增加II型干扰素(即，IFN-γ)的水平改变先天免疫应答(Peng等人，2009)。提出，HSV-2还阻断树突状细胞(DC)成熟和诱导树突状细胞(DC)细胞凋亡并触发促炎细胞因子的释放(Stefanidou等人，2013；和Peretti等人，2005)。HSV-2重新激活导致反复发作，范围从轻度到重度病例。

HSV感染的症状包括生殖器皮肤或粘膜中的水样水疱。病变愈合伴随着疱疹疾病典型的结痂。

1.2对HSV-2的先天性和适应性免疫应答

对HSV-2的强大和稳健的免疫应答需要先天性和适应性免疫应答两者。适应性免疫应答的主要功能在于病毒清除和长期记忆的产生，这是重要研究关注的中心。病毒与先天性免疫细胞(例如，单核吞噬细胞、树突状细胞(DC)和NKT细胞)之间的相互作用通过模式识别受体(PRR)引发免疫应答。PRR识别病原体相关分子模式(PAMP)，例如病毒DNA和RNA。Toll样受体(TLR)是PRR的主要类别并由先天性免疫细胞表达，起到引发免疫应答的作用。

适应性免疫应答由细胞和体液免疫两者组成。适应性免疫应答的主要功能是消除病原体(例如病毒)并诱导针对病原性抗原的长期记忆。通常，适应性免疫应答是由先天性免疫应答触发的。需要CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞二者以引发有效的HSV-2特异性免疫应答(参见Tilton等人，2008)。

细胞毒性免疫通过消除感染病原体(例如，HSV-2病毒)的细胞和除去细胞内病原体例如病毒来补偿体液系统。已经证明呈现足够浓度的外源性施用的抗原联合I类主要组织相容性复合物(MHC)分子以引发足够的免疫应答是有挑战性的。这严重阻碍了针对弱免疫原性病毒蛋白(例如，HSV-2)的疫苗的开发。

在针对已经显示抗体增强感染性的剂(例如病毒)的免疫中，期望提供单独的细胞免疫应答。具体地，公认，对HSV-2的细胞免疫应答对于预防疾病和控制复发性疾病将都是重要的(美国专利号8,828,408)。提供针对慢性和潜伏性病毒感染的这类应答也将是有用的。

1.3当前的针对HSV-2的疫苗制剂

已经考虑了用于针对HSV感染的免疫的几种不同的疫苗制剂策略，包括灭活疫苗、减活疫苗、复制缺陷型疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗。然而，没有单一的策略已经证明是成功的。

合成肽疫苗的使用具有严重的失败，至少因为通常肽不容易与MHC分子相关联、具有短的血清半衰期、快速地被蛋白水解并且不特异地定位于呈递抗原的单核细胞和巨噬细胞。

灭活病毒疫苗通常免疫原性差并且具有低功效。此外，据报道，这类疫苗展示出增加癌症易感性的潜力，并且因此目前没有被继续进行。

尽管减活病毒具有针对HSV-2发挥有效保护的能力，临床试验揭示，病毒的复发在除了37.5％以外的所有患者中发生。据报道，HSV-2ICPO^-突变型病毒诱导出比gD2亚单位疫苗大10至100倍的针对生殖器疱疹的保护(Halford等人，2011)，并且因此针对该疾病表现出很大的希望。另一种有希望的减活HSV-2疫苗是HSV-2gD27，在氨基酸215、222和223处具有点突变。变体多核苷酸以其与连接蛋白-1受体相互作用的能力的功能丧失为特征。然而，减活病毒的一个显著缺点是病毒恢复到野生型表型的能力。

因此，对引发对HSV-2病毒抗原的安全和有效的免疫应答的方法存在需要。此外，对将使这些抗原与APC的细胞表面上的1类MHC分子相关联以引发细胞毒性T细胞应答、避免血清中材料的过敏反应和蛋白水解并促进材料定位至单核细胞和巨噬细胞的方法存在明显需要(如美国专利号8,828,408中所讨论的)。

1.4基于免疫应答偏好的密码子优化

本发明人先前在WO 2004/042059中公开了用于增强或降低由感兴趣的生物体显示或建议显示的选定表型的质量的策略。该策略包括编码表型相关多肽的多核苷酸的密码子修饰，该多核苷酸本身或与感兴趣的生物体中的其他分子相关联而给予或赋予生物体选定表型。然而，与以前的方法不同，该策略不依赖于根据其在生物体或一类生物中的使用偏好提供同义密码子的排名的数据。其也不依赖于根据其在生物体或一类生物体的一种或更多种细胞中的翻译效率提供同义密码子的排名的数据。相反，其依赖于用于产生选定表型的根据生物体或一类生物体或其中部分对其的使用偏好在表型相关的多肽中编码氨基酸的个体同义密码子的排名。

本发明人然后能够确定哺乳动物中单个同义密码子的免疫应答偏好排名，如WO2009/049350中详细描述的。WO 2009/049350中描述的免疫应答偏好与如由Seed(参见美国专利序列号5,786,464和5,795,737)确定的来源于通常哺乳动物细胞的密码子使用频率值的翻译效率的比较揭示了密码子的排名的几个差异。

发明概述

本发明部分地基于以下惊人的发现，即具有HSV gD2的定性不同形式(qualitatively different forms)的增强生产的二元核酸构建体系统的皮肤施用以剂量依赖性方式引发显著的迟发型超敏反应(DTH)应答。基于由该构建体系统引发的出乎意料地强的细胞免疫应答，提出其特别适用于对抗HSV-2感染的治疗应用，如下所述。

因此，在一个方面，本发明提供用于在受试者中治疗单纯疱疹病毒-2(HSV-2)感染的方法。这些方法通常包括同时向受试者施用有效量的包含第一构建体和第二构建体的构建体系统，其中第一构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答偏好的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列中的选定密码子而区别于野生型HSV gD2编码序列的第一合成编码序列，其中密码子替换选自表1，并且其中第一合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中第一合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列，并且其中第二构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答偏好的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列中的选定密码子而区别于野生型HSV gD2编码序列的第二合成编码序列，并且其中密码子替换选自表1，并且其中第二合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中第二合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列和编码通过I类主要组织相容性(MHC)途径增加多肽的加工和呈递的蛋白质去稳定元件的核酸序列，其中表1如下：

表1

在一些实施方案中，该方法还包括在同时施用第一和第二构建体之前鉴定受试者具有HSV-2感染。

在一些实施方案中，蛋白质去稳定元件选自由在多肽的氨基末端的去稳定氨基酸、PEST序列和泛素分子组成的组。适当地，蛋白质去稳定元件是泛素分子。

因此，通过用表1中鉴定的那些密码子替换野生型HSV gD2编码序列的密码子，在相同条件下产生比野生型编码序列产生的免疫应答更强或增强至少约110％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％和其间所有整数百分比的免疫应答(适当地细胞免疫应答，其包括DTH应答)是可实现的。优选但不是必须，用选自表1的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列的所有密码子。在一些实施方案中，第一合成编码序列和第二合成编码序列各自通过用具有比选定密码子更高的免疫应答偏好的同义密码子替换许多选定密码子而区别于野生型HSV gD2编码序列，使得第一合成编码序列和第二合成编码序列中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其间所有整数百分比的密码子是选自表1的同义密码子。在一些实施方案中，第一和第二合成编码序列包含相同核苷酸序列或由相同核酸序列组成。在其他实施方案中，第一和第二合成编码序列包含不同核苷酸序列或由不同核酸序列组成。在这种类型的说明性实例中，第一合成编码序列包含相对于第二合成编码序列不同的密码子替换。在说明性实例中，第一合成编码序列包含相对于第二合成编码序列不同数量的密码子替换。

在一些实施方案中，第一和第二合成编码序列相应于全长HSV gD2编码序列。在其他实施方案中，第一合成编码序列相应于全长HSV gD2编码序列，并且第二合成编码序列相应于HSV gD2编码序列的一部分。在还其他实施方案中，第一合成编码序列相应于HSV gD2编码序列的一部分，并且第二合成编码序列相应于全长HSV gD2编码序列。又在其他实施方案中，第一和第二合成编码序列各自相应于HSV gD2编码序列的至少一部分。适当地，HSVgD2编码序列的部分编码全长HSV gD2多肽的氨基酸残基25-331。在具体实施方案中，第一合成编码序列相应于全长HSV gD2编码序列，并且第二合成编码序列相应于编码全长HSVgD2多肽的氨基酸残基25-331的HSV gD2编码序列部分。

在具体实例中，第一合成编码序列包含SEQ ID NO：3列出的序列，并且第二合成编码序列包含SEQ ID NO：4列出的序列。

第一构建体和第二构建体可被包含在相同的载体中或单独的载体中。在一些实施方案中，载体不含任何非必需序列(例如，信号或靶向序列)。

在一些实施方案中，第一构建体和第二构建体被包含在任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物中。因此，在另一个方面，本发明提供对治疗HSV-2感染有用的免疫原性药物组合物。在这个方面的一些实施方案中，组合物被配制成用于皮肤或皮肤下施用(例如，皮内施用、透皮施用或皮下施用)。在具体实施方案中，组合物被配制成用于皮内施用。在一些实施方案中，施用于受试者的构建体系统的剂量为每次注射至少约30μg。在具体实施方案中，每次注射30μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、500μg、750μg、1000μg或更多的剂量是适合的。适当地，受试者经受多轮治疗。以举例的方式，受试者可以每两周的间隔接受3次单独的剂量。然而，其他治疗方案是合适的，并且可由受试者的需要而定制。

在一些实施方案中，组合物与佐剂一起被配制。在其他实施方案中，组合物不添加任何佐剂而被配制。

在优选的实施方案中，受试者是人。

在另一个方面，本发明提供如上文和本文别处广泛定义的构建体系统用于治疗HSV-2感染的用途。在一些实施方案中，构建体系统被制备或制造为用于该目的的药物。

附图简述

图1显示NTC8485-O2-gD2和NTC8485-O2-Ubi-gD2tr的示意图谱。NTC8485载体图谱显示第一合成编码序列(A)O2-gD2和(B)O2-Ubi-gD2tr的位置。

图2显示在施用500μg剂量的COR-1疫苗后受试者的注射部位的照片。(A)立即；(B)注射后45分钟；(C)注射后24小时；和(D)注射后48小时拍摄右臂注射部位的照片。

图3显示在施用500μg剂量的COR-1疫苗后受试者的注射部位的照片。(A)立即；(B)注射后45分钟；(C)注射后24小时；和(D)注射后48小时拍摄左臂注射部位的照片。

图4显示在施用30μg剂量的COR-1疫苗后受试者的注射部位的照片。(A)立即；(B)注射后45分钟；(C)注射后24小时；和(D)注射后48小时拍摄照片。

图5显示在施用100μg剂量的COR-1疫苗后受试者的注射部位的照片。(A)立即；(B)注射后45分钟；(C)注射后24小时；和(D)注射后48小时拍摄照片。

图6显示在施用300μg剂量的COR-1疫苗后受试者的注射部位的照片。(A)立即；(B)注射后45分钟；(C)注射后24小时；和(D)注射后48小时拍摄照片。

表A

序列简述

发明详述

1.定义

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下文中定义了以下术语。

本文使用的冠词“一(a)”和“一(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法客体。以举例的方式，“元素(an element)”意味着一个元素或多于一个元素。

“约(about)”意指对于参照数目、水平、值、频率、百分比、维度、大小或量，变化不超过15％，并且优选不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的数目、水平、值、频率、百分比、维度、大小或量。

术语“同时施用(administration concurrently)”或“同时施用(administeringconcurrently)”或“共同施用(co-administering)”等是指含有两种或更多种活性物质的单一组合物的施用，或各活性物质同期地(contemporaneously)或同时地(simultaneously)或在足够短的时间段内顺序地作为单独组合物和/或通过各自的途径递送而施用，有效结果等同于当所有这些活性物质作为单一组合物施用时获得的结果。“同时地(simultaneously)”意指，活性剂基本上同时被施用，并且合意地在同一制剂中一起被施用。“同期地(contemporaneously)”意指，活性剂在时间上紧密地被施用，例如，一种剂在另一种之前或之后约1分钟内至约1天内被施用。任何同时期的时间都是有用的。然而，通常情况是，当不同时被施用时，剂将在约1分钟内至约8小时内，并且优选在小于约1至约4小时内被施用。当被同期(comtemporaneously)施用时，剂适当地被施用在受试者的相同部位。术语“相同部位(same site)”包括精确的位置，但可在约0.5至约15厘米内，优选在约0.5至约5厘米内。本文使用的术语“分别地(separately)”意味着，剂以间隔被施用，例如以约一天至几周或数月的间隔被施用。活性剂可以任一顺序被施用。本文使用的术语“顺序地(sequentially)”意味着，剂按顺序被施用，例如以数分钟、数小时、数天或数周的一个或更多个间隔被施用。如果合适，活性剂可以有规律的重复周期被施用。

如本文使用的，“和/或(and/or)”是指和涵盖一个或更多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当在替换(或)中解释时缺少组合。

术语“抗原(antigen)”和“表位(epitope)”在本领域中是熟知的，并且是指被免疫系统的组分(例如，抗体或T细胞抗原受体)特异性识别的大分子的部分。表位被溶液中的抗体识别以例如摆脱其他分子(free from other molecules)。当表位与I类或II类主要组织相容性复合物分子相关联时，表位被T细胞抗原受体识别。“CTL表位(CTL epitope)”是当表位被呈递在与MHC I类分子相关联的细胞表面时被细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte)(通常为CD8⁺细胞)识别的表位。

应当理解，当关于数值的范围使用时，术语“其间(between)”涵盖该范围的每个端点处的数值。例如，包含30μg和约1000μg之间的合成构建体的组合物包括包含30μg的合成构建体的组合物和包含1000μg的合成构建体的组合物。

如本文使用的，术语“顺式作用序列(cis-acting sequence)”或“顺式调控区(cis-regulatory region)”或类似术语应被理解为意指源自可表达遗传序列的任何核苷酸序列，其中遗传序列的表达(至少部分地)被该核苷酸序列调控。本领域技术人员将意识到，顺式调控区可能能够激活、沉默、增强、抑制或以其他方式改变任何结构基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。

遍及本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包含陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。

“编码序列(coding sequence)”意指有助于基因多肽产物的编码的任何核酸序列。相比之下，术语“非编码序列(non-coding sequence)”意指对基因多肽产物的编码无贡献的任何核酸序列。

本文使用的术语“迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity)”(也称为IV型超敏反应)是指包含CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的细胞介导的免疫应答。CD4⁺辅助T细胞识别被抗原呈递细胞(APC)上II类MHC分子呈递的抗原。在这种情况下，APC通常是分泌IL-12的巨噬细胞，其刺激进一步的CD4⁺Th1细胞的增殖。这些CD4⁺T细胞反过来分泌IL-2和IFN-γ，进一步诱导其他Th1细胞因子的释放，并且从而介导实质性细胞免疫应答。CD8⁺T细胞起在接触后破坏靶细胞的作用，而激活的巨噬细胞在暴露于细胞内病原体时产生水解酶。皮肤中的DTH应答通常用于评估体内的细胞免疫(参见Pichler等人，2011)。具体地说，在皮肤或皮肤下(适当地皮内)施用抗原后，在注射后约48小时硬结和红斑的出现强烈指示阳性的DTH反应和实质性细胞免疫应答。

在调控免疫应答或治疗或预防疾病或状况的上下文中，“有效量(effectiveamount)”意指将该量的组合物以单剂量或作为系列的一部分施用于需要其的个体，对于达到该调控、治疗或预防是有效的。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群体、组合物的制剂、医疗情况的评估和其他相关因素而变化。据预计，该量将落入可通过常规试验确定的相对较宽的范围内。

应当理解，本文预期的“引发(eliciting)”或“诱导(inducing)”免疫应答包括刺激新的免疫应答和/或增强先前存在的免疫应答。

如本文使用的，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可被转录和/或翻译以产生多肽，或者如果其可被加工成可被转录和/或翻译以产生多肽的形式，那么该核酸序列被称为“编码”多肽。这类核酸序列可包括编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包括因DNA分子的转录而产生的RNA产物、因RNA分子的翻译而产生的蛋白质、因DNA分子的转录以形成RNA产物和随后RNA产物的翻译而产生的蛋白质、或因DNA分子的转录以提供RNA产物、RNA产物的加工以提供加工的RNA产物(例如，mRNA)和随后加工的RNA产物的翻译而产生的蛋白质。

术语“增强免疫应答(enhancing an immune response)”、“产生更强的免疫应答(producing a stronger immune response)”等是指增加动物对HSV gD2多肽的应答能力，其可例如通过检测被引发以攻击这类抗原的动物细胞的数目、活性和能力的增加和/或动物中与HSV gD2多肽免疫相互作用的抗体的滴度或活性的增加来确定。免疫应答的强度可通过标准免疫测定来测量，标准免疫测定包括：抗体滴度或外周血淋巴细胞的直接测量；溶细胞的T淋巴细胞测定；自然杀伤细胞的细胞毒性测定；包括淋巴细胞增殖(淋巴细胞激活)测定的细胞增殖测定；免疫细胞亚群的免疫测定；敏化受试者中抗原特异性T淋巴细胞的测定；细胞介导免疫的皮肤测试；等等。这些测定是本领域公知的。参见例如Erickson等人,1993,J.Immunol.151:4189-4199；Doe等人,1994,Eur.J.Immunol.24:2369-2376。最近测量细胞介导的免疫应答的方法包括测量细胞内细胞因子或T细胞群体的细胞因子分泌，或通过测量表位特异性T细胞(例如，通过四聚体技术)(由McMichael，A.J.和O'Callaghan，C.A.，1998，J.Exp.Med.187(9)1367-1371；Mcheyzer-Williams,M.G.等人,1996,Immunol.Rev.150:5-21；Lalvani,A.等人,1997,J.Exp.Med.186:859-865综述)。例如通过免疫测定测量的免疫应答的强度的任何统计学上显著的增加都被认为是本文使用的“增强的免疫应答(enhanced immune response)”或“免疫增强(immunoenhancement)”。增强的免疫应答也由物理表现例如炎症，以及全身和局部感染的愈合和疾病中症状即疱疹和疣的减少来表示。这类物理表现也涵盖本文使用的“增强的免疫应答”或“免疫增强”。

关于基因序列的术语“表达(expression)”是指基因的转录，并且适当地，所得mRNA转录物向蛋白质的翻译。因此，如从上下文将清楚的，编码序列的表达起因于编码序列的转录和翻译。反之，非编码序列的表达起因于非编码序列的转录。

“表达载体(expression vector)”意指能够指导由载体编码的蛋白质的合成的任何自主遗传元件。这类表达载体是本领域技术人员已知的。

本文使用的术语“基因(gene)”是指基因组的任何和所有离散编码区以及相关的非编码和调控区。基因还意图意指编码一种或更多种特定多肽的开放阅读框，并且任选地包含一个或更多个内含子和参与表达调控的相邻的5'和3'非编码核苷酸序列。在这方面，基因可还包含调控性核酸例如与给定基因自然相关的启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源控制信号。基因可能或可能不能用于产生功能性蛋白质。基因可包括编码区和非编码区两者。

如本文使用的，在核酸或氨基酸序列的上下文中的术语“HSV gD2”(或“单纯疱疹病毒2型糖蛋白D(herpes simplex virus type-2glycoprotein D)”)是指全长或部分长度的HSV gD2编码序列或全长或部分长度的HSV gD2氨基酸序列(例如，全长或部分长度的HSV株HG52(基因组菌株NC_001798)的gD2基因、其蛋白质表达产物)。在一些实施方案中，合成编码序列编码至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、250、300或350个连续氨基酸残基，或几乎高达存在于全长HSV gD2氨基酸序列的氨基酸总数(393个氨基酸残基)。在一些实施方案中，合成编码序列编码HSV gD2多肽的多个部分，其中各部分相同或不同。在这种类型的说明性实例中，合成编码序列编码多表位融合蛋白。许多因素能够影响部分大小的选择。例如，可选择由合成编码序列编码的单个部分的大小，使得其包括T细胞表位和/或B细胞表位(或对应于其大小)和其加工要求。本领域技术人员将认识到，I类限制性T细胞表位的长度通常在8和10个氨基酸残基之间，并且如果被放置在非自然侧翼残基旁边，这类表位可通常需要2至3个自然侧翼氨基酸残基，以确保其被有效地加工和呈递。II类限制性T细胞表位的长度范围通常在12至25个氨基酸残基之间，并且可不需要自然侧翼残基用于高效的蛋白水解加工，尽管认为自然侧翼残基可能发挥作用。II类限制性表位的另一个重要特征是，它们通常在中间含有9-10个氨基酸残基的核心，其与II类MHC分子特异性结合，伴随着该核心任意一侧的侧翼序列通过以序列独立的方式与II类MHC抗原任意一侧的保守结构相关联而使结合稳定。因此II类限制性表位的功能区通常小于约15个氨基酸残基长。线性B细胞表位的大小和影响其加工的因素，如II类限制性表位是高度可变的，尽管这类表位的大小经常小于15个氨基酸残基。从上述，HSV gD2多肽的单个部分的大小为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30个氨基酸残基是有利的但不是必要的。适当地，单个部分的大小不超过约500、200、100、80、60、50、40个氨基酸残基。在某些有利的实施方案中，单个部分的大小足以由抗原呈递细胞呈递被包含在肽内的T细胞和/或B细胞表位。

“免疫应答(Immune response)”或“免疫应答(immunological response)”是指导致对于侵入病原体的机体、感染有病原体的细胞或组织的选择性损伤、破坏或消除的淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)中的任一种或更多种的协同作用。在一些实施方案中，“免疫应答”涵盖个体中对由本发明的引入的合成编码序列编码的多肽的体液和/或细胞免疫应答的发展。如本领域已知的，术语“体液免疫应答(humoral immune response)”包括并涵盖由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答(cellular immune response)”包括并涵盖由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。因此，免疫应答可包括一种或更多种以下作用：由B细胞产生抗体；和/或特异性地针对存在于感兴趣的组合物或疫苗中的一种或更多种抗原的抑制T细胞和/或记忆/效应T细胞的激活。在一些实施方案中，这些应答可用于中和感染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellcytotoxicity)(ADCC)以向免疫的宿主提供保护。这类应答可使用本领域公知的标准免疫测定和中和测定来确定。(参见例如，Montefiori等人，1988，J Clin Microbiol.26:231-235；Dreyer等人,1999,AIDS Res Hum Retroviruses 15(17):1563-1571)。哺乳动物的先天免疫系统还通过激活Toll样受体和免疫细胞上的类似受体分子来识别和响应致病生物体和癌细胞的分子特征。在激活先天免疫系统后，各种非适应性免疫应答细胞被激活以例如产生各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。由先天免疫应答激活的细胞包括例如单核细胞和浆细胞样谱系(MDC、PDC)以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等的未成熟和成熟的树突状细胞。因此，本发明还预期免疫应答，其中免疫应答包括先天和适应性应答两者。

如果组合物能够：a)在个体中产生针对HSV gD2多肽的免疫应答，或b)在个体中重组、加强或维持超过如果未施用剂或组合物会发生的免疫应答，则该组合物是“免疫原性的(immunogenic)”。如果以单或多剂量施用时能够达到这些标准中的任一个，则剂或组合物是免疫原性的。免疫应答可包括受试者中的细胞免疫应答和/或体液免疫应答。

遍及本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”将被理解为暗示包含陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。

如本文使用的，术语“哺乳动物(mammal)”是指任何哺乳动物，包括但不限于人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物例如黑猩猩和其他猿和猴类；农场动物例如牛、绵羊、猪、山羊、马；家养哺乳动物例如狗和猫；和实验动物，包括啮齿动物例如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语不表示特定年龄。因此，成年和新生个体都意图被覆盖。

本文使用的术语“可操作地连接(operably connected)”、“可操作地连接(operably linked)”等是指元件的布置，其中如此描述的组分被配置以进行其通常的功能。因此，当存在适当的酶时，给定的调控核酸例如可操作地连接到编码序列的启动子能够实现编码序列的表达。启动子不必与编码序列连续，只要其起到指导编码序列表达的功能即可。因此，例如，启动子序列和编码序列之间可存在其间的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍然可被认为与编码序列“可操作地连接”。因此，术语例如“可操作地连接”包括将结构基因置于启动子的调控控制下，然后启动子控制基因的转录和任选地基因的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选的是，将遗传序列或启动子放置在离基因转录起始位点的一定距离处，该距离与该遗传序列或启动子和在其自然环境中其控制的基因(即遗传序列或启动子源自的基因)之间的距离大致相同。如本领域所知，该距离中的一些变化可被调整而不损失功能。类似地，启动子相对于将被置于其控制下的异源基因的优选放置由启动子在其自然环境(即其所源自的基因)中的定位来定义。可选地，将gD2编码序列“可操作地连接”到编码蛋白质去稳定化元件(PDE)的核酸序列涵盖gD2编码序列相对于PDE编码核酸序列的定位和/或取向，使得(1)该编码序列和PDE编码核酸序列一起转录以形成单个嵌合转录物和(2)gD2编码序列与PDE编码核酸序列是“符合读框的(in-frame)”以产生包含gD2编码序列和PDE编码核酸序列的嵌合开放阅读框。

术语“开放阅读框(open reading frame)”和“ORF”是指在编码序列的翻译起始和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子(initiation codon)”和“终止密码子(termination codon)”是指编码序列中分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止的三个相邻核苷酸的单元(“密码子”)。

“药学上可接受的载体(pharmaceutically-acceptable carrier)”意指可安全地用于局部或全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。

本文使用的术语“多核苷酸(polynucleotide)”或“核酸(nucleic acid)”代表mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。

“多肽(Polypeptide)”、“肽(peptide)”和“蛋白质(protein)”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物和其变体和合成类似物。如本文使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”不限于最小长度的产物。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在该定义内。全长蛋白质和其片段都涵盖在该定义中。该术语还包括多肽的后表达修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。在一些实施方案中，“多肽”是指一种蛋白质，其包括对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(本质上通常保守的)，只要蛋白质保持所需的活性即可。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。

术语“多肽变体(polypeptide variant)”和“变体(variant)”是指通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代(本质上通常保守的)不同于参考多肽的多肽。通常，变体保留参考多肽的所需活性，例如在诱导针对HSV gD2多肽的免疫应答中的抗原活性。通常，当两个序列比对时，变体多肽与参考多肽“基本相似(substantially similar)”或“基本相同(substantially identical)”，例如氨基酸序列同一性或相似性多于50％，通常多于60％-70％，甚至更具体地80％-85％或更多，例如至少90％-95％或更多。通常，变体将包括相同数量的氨基酸，但将包括如本文解释的取代。

本文对“启动子”的提及将以其最广泛的范围被采用，并且包括经典基因组基因的转录调控序列，包括准确转录起始所需的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列和另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其响应于发育和/或环境刺激或以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达。启动子通常但不必然位于其调控表达的结构基因的上游或5'端。此外，包含启动子的调控元件通常位于基因的转录起始位点的2kb内。根据本发明的优选启动子可含有一个或更多个特定调控元件的另外拷贝，以进一步增强细胞中的表达，和/或改变其可操作地连接的结构基因的表达时机。

本文使用的术语“序列同一性”是指在比较窗内基于一个核苷酸接着一个核苷酸或基于一个氨基酸接着一个氨基酸的序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比(percentage of sequence identity)”如下计算：通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。为了本发明的目的，“序列同一性”将被理解为意指使用软件附带的参考手册中使用的标准默认值，由DNASIS计算机程序(Windows版本2.5；可从Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South SanFrancisco,California,USA获得)计算的“匹配百分比”。

“相似性(Similarity)”是指如表10中定义的相同或构成保守取代的氨基酸的百分数。可使用序列比较程序例如GAP(Deveraux等人1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)来确定相似性。以这种方式，可通过将缺口插入到比对中来比较与本文提及的那些序列长度相似或基本不同的序列，这类间隙例如通过GAP使用的比较算法确定。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列(reference sequence)”、“比较窗口(comparison window)”、“序列同一性(sequenceidentity)”、“序列同一性百分比(percentage of sequence identity)”和“实质同一性(substantial identity)”。“参考序列”的长度为至少12个但经常为15至18个并且通常至少25个单体单元，所述单体单元包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列来进行，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指至少6个连续位置，通常约50至约100个，更通常约100至约150个的概念区段，其中在两个序列被最佳比对后，序列被与具有相同数量的连续位置的参考序列比较。为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的计算机化工具(Wisconsin Genetics Software Package发布7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查来进行并选择各种方法的任一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口的最高同源性百分比)。还可参考如例如由Altschul等，1997,Nucl.Acids Res.25:3389公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可在Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley&Sons Inc,1994-1998,Chapter 15的Unit 19.3中找到。

本文使用的术语“合成编码序列(synthetic coding sequence)”是指由重组或合成技术形成的多核苷酸，并且通常包括在自然界中通常未发现的多核苷酸。

本文使用的术语“同义密码子(synonymous codon)”是指具有与另一个密码子不同的核苷酸序列但编码与其他密码子相同的氨基酸的密码子。

“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等意在包括治疗的和预防性的治疗两者。

“载体(vector)”意指源自例如核酸序列可被插入或克隆进的质粒、噬菌体或植物病毒的核酸分子，优选地DNA分子。载体优选地含有一个或更多个独特的限制性位点，并且可能够在包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织的定义的宿主细胞中自主复制，或是与定义的宿主的基因组可整合的，使得克隆的序列可繁殖。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，线性质粒或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于确保自我复制的任何工具(means)。可选地，载体可以是当被引入进宿主细胞时其被整合进基因组中并连同它已被整合进的染色体一起复制的载体。载体系统可包含单个载体或质粒、共同包含待引入进宿主细胞的基因组的总DNA或转座子的两个或更多个载体或质粒。载体的选择通常将取决于载体与该载体待引入进的宿主细胞的相容性。载体还可包括选择标记物，例如可用于选择合适的转化体的抗生素抗性基因。这类抗性基因的实例是本领域技术人员公知的。

关于生物体、多肽或核酸序列的术语“野生型(wild-type)”、“自然的(natural)”、“天然的(native)”等是指自然存在或在至少一个不被人改变、突变或以其他方式操纵的自然存在的生物体中可得的生物体、多肽或核酸序列。

2.缩写

在整个申请中使用以下缩写：

nt＝ 核苷酸

nts＝核苷酸

bp＝ 碱基对

aa＝ 氨基酸

3.HSV gD2编码序列

预期用于本发明的第一和第二合成编码序列编码蛋白质性分子，其代表性实例包括多肽和肽。野生型HSV gD2多肽适用于本发明，尽管也预期了变体HSV gD2多肽。根据本发明，由本发明的核酸构建体产生的HSV gD2多肽由密码子优化的HSV gD2编码序列编码。

在一些实施方案中，基于对野生型HSV gD2编码序列的至少一部分的密码子优化产生合成编码序列，所述野生型HSV gD2编码序列的说明性实例包括菌株HG52(基因组菌株NC_001798)的HSV gD2编码序列，其具有以下核苷酸序列：

ATGGGGCGTTTGACCTCCGGCGTCGGGACGGCGGCCCTGCTAGTTGTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTCTGCGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCGCGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACATTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGCTGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGGCCCCCCAGATCGTGCGCGGGGCTTCGGACGAGGCCCGAAAGCACACGTACAACCTGACCATCGCCTGGTATCGCATGGGAGACAATTGCGCTATCCCCATCACGGTTATGGAATACACCGAGTGCCCCTACAACAAGTCGTTGGGGGTCTGCCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGAGCTACTATGACAGCTTTAGCGCCGTCAGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCGGCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAATTTATCCTGGAGCACCGGGCCCGCGCCTCCTGCAAGTACGCTCTCCCCCTGCGCATCCCCCCGGCAGCGTGCCTCACCTCGAAGGCCTACCAACAGGGCGTGACGGTCGACAGCATCGGGATGCTACCCCGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCGTCGCCCTATACAGCTTAAAAATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTGCTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCGAGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCACATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACCACGCCCCCGCCGCCCCCAGCAACCCGGGCCTGATCATCGGCGCGCTGGCCGGCAGTACCCTGGCGGTGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGCGCTCAGATGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCCCCTCGCACCAGCCATTGTTTTACTAG[SEQ ID NO：1].

SEQ ID NO：1列出的该多核苷酸序列编码以下氨基酸序列(UniProt登录号NP044536)：

MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRARASCKYALPLRIPPAACLTSKAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHHAPAAPSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDAPPSHQPLFY[SEQ ID NO：2].

3.1密码子优化

在一些实施方案中，使用WO 2009/049350中描述的方法突变亲本(例如，野生型)HSV gD2编码序列内的多个密码子。简而言之，野生型编码序列的密码子被相应的同义密码子替换，已知其具有比其替换的密码子更高的免疫应答偏好，如下表1列出的：

在具体实例中，本发明预期了密码子优化的编码对应于野生型HSV gD2多肽的至少一部分的氨基酸序列的编码序列，其包括将所有Ala变为GCT；Arg的CGG和AGG分别变为CGA和AGA；Glu变为GAA；Gly变为GGA；Ile变为ATC；所有Leu变为CTG；Phe变为TTT，Pro变为CCT或CCC，Ser变为TCG，Thr变为ACG；和所有除了GTG以外的Val变为GTC。除了Leu和Ile之外，这些修饰避免将密码子变为哺乳动物的共有优选密码子。由于编码Leu和Ile氨基酸的具有最高免疫应答偏好的密码子显著高于替代的同义密码子，并且鉴于HSV gD2多肽序列中Leu和Ile残基的频率(39个亮氨酸氨基酸和23个异亮氨酸氨基酸)，哺乳动物的共有优选密码子未被避免，以确保构建体的实质表达。符合这类实施方案的多核苷酸的说明性实例如下：

AAGCTTGCCGCCACCATGGGACGTCTGACGTCGGGAGTCGGAACGGCTGCTCTGCTGGTCGTCGCTGTGGGACTGCGCGTCGTCTGCGCTAAATACGCTCTGGCTGACCCCTCGCTGAAGATGGCTGATCCCAATCGATTTCGCGGAAAGAACCTGCCCGTCCTGGACCAGCTGACGGACCCCCCCGGAGTGAAGCGTGTCTACCACATCCAGCCCTCGCTGGAAGACCCCTTTCAGCCCCCCTCGATCCCCATCACGGTGTACTACGCTGTGCTGGAACGTGCTTGCCGCTCGGTGCTGCTGCATGCTCCCTCGGAAGCTCCCCAGATCGTGCGCGGAGCTTCGGACGAAGCTCGAAAGCACACGTACAACCTGACGATCGCTTGGTATCGCATGGGAGACAATTGCGCTATCCCCATCACGGTCATGGAATACACGGAATGCCCCTACAACAAGTCGCTGGGAGTCTGCCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGTCGTACTATGACTCGTTTTCGGCTGTCTCGGAAGATAACCTGGGATTTCTGATGCACGCTCCCGCTTTTGAAACGGCTGGAACGTACCTGCGACTGGTGAAGATCAACGACTGGACGGAAATCACGCAATTTATCCTGGAACACCGAGCTCGCGCTTCGTGCAAGTACGCTCTGCCCCTGCGCATCCCCCCCGCTGCTTGCCTGACGTCGAAGGCTTACCAACAGGGAGTGACGGTCGACTCGATCGGAATGCTGCCCCGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACGGTCGCTCTGTACTCGCTGAAAATCGCTGGATGGCACGGACCCAAGCCCCCCTACACGTCGACGCTGCTGCCCCCCGAACTGTCGGACACGACGAACGCTACGCAACCCGAACTGGTCCCCGAAGACCCCGAAGACTCGGCTCTGCTGGAAGATCCCGCTGGAACGGTGTCGTCGCAGATCCCCCCCAACTGGCACATCCCCTCGATCCAGGACGTCGCTCCCCACCACGCTCCCGCTGCTCCCTCGAACCCCGGACTGATCATCGGAGCTCTGGCTGGATCGACGCTGGCTGTGCTGGTCATCGGAGGAATCGCTTTTTGGGTCCGCCGCCGCGCTCAGATGGCTCCCAAGCGCCTGCGTCTGCCCCACATCCGAGATGACGACGCTCCCCCCTCGCACCAGCCCCTGTTTTACTAGCTCGAG[SEQ ID NO：3].

在一些实施方案中，第二合成编码序列编码对应于野生型HSV gD2多肽的至少一部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二合成编码序列编码对应于缺少gD2信号肽和跨膜结构域区域的野生型HSV gD2多肽的一部分的氨基酸序列。虽然不是必需的，但是去除这些区域确保，HSV gD2多肽不从细胞分泌，因此改善多肽被降解并引起细胞免疫应答的可能性。例如，合成编码序列可编码野生型HSV gD2氨基酸序列的氨基酸25-331。在这种类型的说明性实例中，第二合成编码序列包括以下序列：

AAGCTTGCCGCCACCATGCAGATCTTTGTGAAGACGCTGACGGGAAAGACGATCACGCTGGAAGTGGAACCCTCGGACACGATCGAAAACGTGAAGGCTAAGATCCAGGACAAGGAAGGAATCCCCCCCGACCAGCAGAGACTGATCTTTGCTGGAAAGCAGCTGGAAGACGGACGCACGCTGTCGGACTACAACATCCAGAAGGAATCGACGCTGCACCTGGTGCTGAGACTGCGCGGAGCTGCTAAATACGCTCTGGCTGACCCCTCGCTTAAGATGGCTGATCCCAATCGATTTCGCGGAAAGAACCTGCCCGTCCTGGACCAGCTGACGGACCCCCCCGGAGTGAAGCGTGTCTACCACATCCAGCCCTCGCTGGAAGACCCCTTTCAGCCCCCCTCGATCCCCATCACGGTGTACTACGCTGTGCTGGAACGTGCTTGCCGCTCGGTGCTGCTGCATGCTCCCTCGGAAGCTCCCCAGATCGTGCGCGGAGCTTCGGACGAAGCTCGAAAGCACACGTACAACCTGACGATCGCTTGGTATCGCATGGGAGACAATTGCGCTATCCCCATCACGGTCATGGAATACACGGAATGCCCCTACAACAAGTCGCTGGGAGTCTGCCCCATCCGAACGCAGCCCCGCTGGTCGTACTATGACTCGTTTTCGGCTGTCTCGGAAGATAACCTGGGATTTCTGATGCACGCTCCCGCTTTTGAAACGGCTGGAACGTACCTGCGACTGGTGAAGATCAACGACTGGACGGAAATCACGCAATTTATCCTGGAACACCGAGCTCGCGCTTCGTGCAAGTACGCTCTGCCCCTGCGCATCCCCCCCGCTGCTTGCCTGACGTCGAAGGCTTACCAACAGGGAGTGACGGTCGACTCGATCGGAATGCTGCCCCGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACGGTCGCTCTGTACTCGCTGAAAATCGCTGGATGGCACGGACCCAAGCCCCCCTACACGTCGACGCTGCTGCCCCCCGAACTGTCGGACACGACGAACGCTACGCAACCCGAACTGGTCCCCGAAGACCCCGAAGACTCGGCTCTGCTGGAAGATCCCGCTGGAACGGTGTCGTCGCAGATCCCCCCCAACTGGCACATCCCCTCGATCCAGGACGTCGCTCCCCACCACTAGCTCGAG[SEQ ID NO：4].

被密码子优化以制备合成编码序列的亲本HSV gD2编码序列适合地是野生型或自然基因。然而，可能亲本HSV gD2编码序列不是自然存在的，而是使用重组技术被工程化。野生型多核苷酸可从任何合适的来源获得，例如来自真核生物或原核生物，包括但不限于哺乳动物或其他动物，和致病生物体例如酵母、细菌、原生动物和病毒。

如本领域技术人员将理解的，通常不需要用编码与HSV gD2多肽共有完全相同氨基酸序列的多肽的合成编码序列进行免疫以产生对该抗原的免疫应答。因此，在一些实施方案中，由合成编码序列编码的多肽是HSV gD2多肽的至少一部分的变体。“变体”多肽包括通过以下而从HSV gD2多肽衍生的蛋白质：缺失(所谓的截短)或向HSV gD2多肽的N端和/或C端加入一个或更多个氨基酸；在HSV gD2多肽的一个或更多个位点缺失或添加一个或更多个氨基酸；或在HSV gD2多肽的一个或更多个位点取代一个或更多个氨基酸。本发明涵盖的变体多肽将具有与野生型HSV gD2多肽或其部分的氨基酸序列至少40％、50％、60％、70％，通常至少75％、80％、85％，通常至少约90％至95％或更高，和更通常地至少约96％、97％、98％、99％或更高的序列相似性或同一性，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数确定的。HSV gD2多肽的变体可不同于野生型序列，通常多达200、100、50或20个氨基酸残基，或适当地少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，例如6-10个，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

与HSV gD2多肽序列相比，对应于HSV gD2多肽的至少一部分的变体多肽可在其序列的不同位置含有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代(conservative amino acidsubstitution)”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义，其通常可亚分类如下：

酸性的：残基由于在生理pH下H离子的损失而具有负电荷，并且残基被水性溶液吸引，以便当含有其的肽在生理pH下处于水性介质中时寻求该肽的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性的：残基由于在生理pH或其一或两个pH单位内与H离子缔合而具有正电荷(例如，组氨酸)，并且残基被水性溶液吸引，以便当包含其的肽在生理pH下处于水性介质中时寻求该肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电的：残基在生理pH下带电，并且因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水的：残基在生理pH下不带电，并且残基被水性溶液排斥，以便当含有其的肽处于水性介质中时寻求该肽的构象中的内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性的/极性的：残基在生理pH下不带电，但是残基不被水性溶液充分排斥，使得当含有其的肽处于水性介质中时其会寻求该肽的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

此描述也将某些氨基酸表征为“小的(small)”，因为即使缺少极性基团，其侧链也不够大到赋予疏水性。除脯氨酸外，“小的”氨基酸是当至少一个极性基团在侧链上时具有四个或更少的碳，以及当侧链上没有极性基团时具有三个或更少的碳的那些氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于其已知的对肽链二级构象的影响，基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一个特殊情况。脯氨酸的结构与所有其他自然存在的氨基酸的不同之处在于其侧链键合至α-氨基基团的氮以及α-碳。但是，多个氨基酸相似性矩阵(例如，由Dayhoff等人(1978)A model of evolutionary change inproteins.Matrices for determining distance relationships In M.O.Dayhoff,(ed.),Atlas of protein sequence and structure,Vol.5,pp.345-358,NationalBiomedical Research Foundation,Washington DC；和由Gonnet等人，1992,Science 256(5062):144301445公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸包括在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸同组中。因此，为了本发明的目的，将脯氨酸分类为“小的”氨基酸。

分类为极性或非极性所需的吸引或排斥的程度是任意的，并且因此，本发明具体预期的氨基酸已被分类为一种或另一种。大多数不被具体命名的氨基酸可根据已知行为进行分类。

氨基酸残基可进一步被亚分类为环状或非环状和芳香或非芳香，关于残基的侧链取代基的不言自明的分类，和小的或大的。倘若存在另外的极性取代基，如果其含有总共四个碳原子或更少(包括羧基碳)，则残基被认为是小的；如果没有，则三个或更少。当然，小残基总是非芳香的。取决于其结构性质，氨基酸残基可能落入两个或更多个类别中。对于自然存在的蛋白质氨基酸，根据此方案的亚分类被呈现于表3。

表3

保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸，将不会对所得变体多肽的性质具有大的影响。保守取代在下表4中在示例性取代的标题下显示。更优选的取代在优选的取代的标题下显示。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过选择在其维持(a)在取代区域中的肽骨架的结构，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中没有显著差异的取代来实现。引入取代后，针对生物活性筛选变体。

表4

示例性和优选氨基酸取代

可选地，用于进行保守取代的相似氨基酸可基于侧链的身份被分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；和第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸，如Zubay,G.,Biochemistry,第三版,Wm.C.Brown Publishers(1993)中描述的。

3.2取代密码子的方法

可使用本领域已知的标准方法来实现将一个密码子替换为另一个。例如，亲本多核苷酸的密码子修饰可使用包括例如寡核苷酸定向诱变、用简并寡核苷酸的诱变和区域特异性诱变的多种已知的诱变技术来实现。示例性的体外诱变技术描述于例如美国专利号4,184,917、4,321,365和4,351,901中或在Ausubel等人(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,John Wiley&Sons,Inc.1997)和在Sambrook等人,(MOLECULAR CLONING.ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Press,1989)的相关章节中。代替体外诱变，合成编码序列可使用例如美国专利号4,293,652中描述的容易获得的机器来从头合成。然而，应当注意，本发明不依赖于和不指向用于构建合成编码序列的任何一种特定技术。

4.合成构建体

4.1调控核酸

本发明进一步预期了第一和第二构建体，其各自包含可操作地连接到调控核酸的合成编码序列。调控核酸适当地包含转录和/或翻译控制序列，其将对感兴趣的生物体或该生物体的细胞中的表达相容。通常，转录和翻译调控控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调控区例如转录调控蛋白或翻译调控蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区。本发明预期了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是自然存在的启动子或者组合多于一个启动子的元件的杂合启动子。本发明预期的启动子序列可对感兴趣的生物体是天然的或者可衍生自替代的来源，其中该区域在选定的生物体中有功能。启动子的选择将根据预期的宿主或细胞或组织类型而不同。例如，可用于哺乳动物中表达的启动子包括可响应于重金属例如镉而被诱发的金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子以及病毒启动子例如SV40大T抗原启动子、人类巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳斯肉瘤病毒LTR启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒启动子和HPV启动子特别是HPV上游调控区域(URR)、及其他。所有这些启动子都在本领域中被充分地描述并且容易获得。

本文还可使用增强子元件以增加哺乳动物构建体的表达水平。示例包括如例如在Dijkema等人(1985,EMBO J.4:761)中描述的SV40早期基因增强子、如例如在Gorman等人(1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)中描述的衍生自劳斯肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子和例如在Boshart等人(1985,Cell 41:521)中描述的衍生自人CMV的元件，例如包括在CMV内含子A序列中的元件。

第一和第二构建体还可包含3'非翻译序列。3'非翻译序列是指基因包含含有聚腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号的DNA区段的部分。聚腺苷酸化信号被表征为实现添加聚腺苷酸域(polyadenylic acid tracts)至mRNA前体的3'末端。聚腺苷酸化信号通常依据与典型形式的5'AATAAA-3’存在同源性来被识别，尽管变化并不罕见。3'非翻译调控DNA序列优选地包括从约50至1,000nt，并且除了聚腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号之外，还可含有转录和翻译终止序列。

在一些实施方案中，第一和第二构建体还含有选择性标记基因，以允许选择含有该构建体的细胞。选择基因是本领域公知的，并且将与在感兴趣的细胞中的表达相容。

然而，应当理解，异源系统中蛋白质编码多核苷酸的表达现在是众所周知的，并且本发明不一定指向或依赖于用于表达多核苷酸的任何特定载体、转录控制序列或技术。而是，根据本文列出的方法制备的合成编码序列可以任何合适的构建体或载体的形式以任何合适的方式引入哺乳动物，并且合成编码序列可以任何常规方式用已知的转录调控元件表达。

此外，第一和第二构建体可被构建为包括编码例如衍生自单个或自多于一个HSVgD2多肽的例如感兴趣的多个抗原/表位的嵌合抗原编码基因序列。在某些实施方案中，可构建多顺反子盒(例如，双顺反子盒)，其允许使用例如EMCV IRES等从单个mRNA表达多种佐剂和/或抗原性多肽。在其他实施方案中，佐剂和/或抗原性多肽可在与独立转录调控元件可操作地连接的分开的编码序列上编码。

4.2蛋白质佐剂和蛋白质去稳定元件

此外，可构建第一和第二构建体以包括编码蛋白质佐剂的序列。特别合适的是例如以下的细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变体(detoxified mutant)：白喉毒素、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热毒素(LT1和LT2)、假单胞菌(Pseudomonas)内毒素A、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)C2和C3毒素以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(C.spiriforma)和艰难梭菌(C.difficile)的毒素。在一些实施方案中，第一和第二构建体包括大肠杆菌不耐热毒素的脱毒突变体的编码序列，所述脱毒突变体例如在美国专利号6,818,222中描述的LT-K63和LT-R72脱毒突变体。

在一些实施方案中，佐剂是蛋白质去稳定化元件，其通过I类MHC途径增加对应于HSV gD2多肽的至少一部分的多肽的加工和呈递，从而导致增强的针对多肽的细胞介导的免疫。示例性蛋白质去稳定元件包括可选自但不限于以下的细胞内蛋白质降解信号或降解决定子：在感兴趣的多肽的氨基末端的去稳定氨基酸、PSET区域或泛素。例如，可修饰多肽的编码序列以在其氨基末端包括去稳定氨基酸，使得如例如在美国专利序列号5,093,242中由Bachmair等人和在美国专利序列号5,122,463中由Varshavsky等人公开的，如此修饰的蛋白质经受N末端规则途径。在一些实施方案中，去稳定氨基酸选自异亮氨酸和谷氨酸，特别是选自组氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，更特别是选自天冬氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和赖氨酸。在某些实施方案中，去稳定氨基酸是精氨酸。在一些蛋白质中，由于蛋白质的构象(即，其三级或四级结构)，氨基末端被遮蔽。在这些情况下，氨基末端的更广泛的改变可能是使蛋白质经受N端规则途径所必需的。例如，在由于不可接近的氨基末端而使单个氨基末端残基的简单添加或替换不足的情况，可将多个氨基酸(包括赖氨酸，泛素结合于底物蛋白质的位点)加入到原始氨基末端以增加工程化氨基末端的可接近性和/或分段移动性(segmental mobility)。在一些实施方案中，可修饰编码多肽的氨基末端区域的核酸序列，以在合适的背景中引入赖氨酸残基。这可通过采用编码“通用去稳定区段”的DNA构建体来最方便地实现。通用去稳定区段包含编码含有一个或更多个赖氨酸残基的优选可分段移动的多肽结构的核酸构建体，赖氨酸残基的密码子位于构建体内，使得当构建体被插入编码蛋白质的合成编码序列的编码序列时，赖氨酸残基空间上足够靠近编码的蛋白质的氨基末端以作为完整氨基末端降解信号的第二决定因素。将这类构建体插入编码多肽的合成编码序列的5'部分将在合适的背景中为编码的多肽提供一个或更多个赖氨酸残基用于去稳定化。在其他实施方案中，将多肽修饰成含有富含选自脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸的PEST区，该区域任选地两侧是包含正电侧链的氨基酸。在这方面，已知细胞内半衰期小于约2小时的蛋白质的氨基酸序列含有富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的一个或更多个区域，如例如由Rogers等人(1986,Science 234(4774):364-368)显示的。在还其他实施方案中，多肽与泛素或其生物活性片段缀合，以产生相对于未修饰的多肽其细胞内蛋白水解降解速率增加、增强或以其他方式升高的修饰多肽。

一种或更多种佐剂多肽可与对应于HSV gD2多肽的至少一部分的“抗原性”多肽共表达。在某些实施方案中，佐剂和抗原性多肽可以包含一种或更多种佐剂多肽和一种或更多种抗原性多肽的融合蛋白的形式共表达。可选择地，佐剂和抗原性多肽可共表达为分开的蛋白质。

4.3载体

以上描述的第一和第二构建体适合地是适合于在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质的载体的形式，并且特别是通过遗传免疫鉴定为用于诱导中和免疫应答的那些。专门用于在DNA疫苗中使用而制备的载体通常将指导靶生物体中转基因表达的真核区域与在大肠杆菌(E.coli)宿主中提供选择和繁殖的细菌区域组合。真核区域在感兴趣的基因的上游含有启动子和下游含有聚腺苷酸化信号(polyA)。转染入细胞核后，启动子指导包括转基因的mRNA的转录。聚腺苷酸化信号介导mRNA裂解和聚腺苷酸化，这导致向细胞质的高效的mRNA输出。经常包括Kozak序列(gccgccRccATGG共有序列，Kozak序列内的转基因ATG起始密码子被加下划线，帽中的关键残基R＝A或G)。Kozak序列在细胞质中被核糖体识别并指导高效的转基因翻译。组成型人巨细胞病毒(CMV)启动子是DNA疫苗中最常用的启动子，因为它在大多数哺乳动物细胞中高度活跃，比替代病毒或细胞启动子转录更高水平的mRNA。PolyA信号通常用于增加聚腺苷酸化效率，导致增加的mRNA水平和改善的转基因表达。

在一些实施方案中，载体包含第一或第二合成编码序列，而没有任何另外的和/或非功能性序列(例如，可能在受试者中表达的隐蔽ORF)。这在转录的UTR中是特别有益的，以预防在受试者中产生可能诱发不期望的适应性免疫应答的载体编码的隐蔽肽。适用于本发明的载体的说明性实例包括NTC8485和NCT8685(Nature Technology Corporation,Nebraska,USA)。可选择地，可使用亲本载体NTC7485。NTC7485被设计为符合美国食品和药物管理局(FDA)关于DNA疫苗载体组合物的管理指南(FDA 1996,FDA 2007，并在Williams等人,2009中综述)。具体地，消除了对靶基因的大肠杆菌质粒复制或哺乳动物细胞表达不是必需的所有序列。在载体设计中利用合成的真核mRNA前导序列和终止子序列来限制与人类基因组的DNA序列同源性，以减少染色体整合的可能性。

在其他实施方案中，载体可包含编码辅助功能序列的核酸序列(例如，实现HSVgD2多肽的转运或翻译后序列修饰的序列，其非限制性示例包括信号或靶向序列)。例如，NTC8482使用优化的组织纤溶酶原激活物(TPA)信号肽将编码的蛋白质靶向至分泌途径。

在一些实施方案中，HSV gD2抗原的表达由优化的嵌合启动子-内含子(例如，SV40-CMV-HTLV-1R合成内含子)驱动。在这些实施方案的一个方面，载体编码共有的Kozak翻译起始序列和ATG起始密码子。值得注意的是，嵌合巨细胞病毒(CMV)启动子达到比传统的基于人CMV启动子的载体显著更高的表达水平(Luke等人，2009)。

在一个实施方案中，将DNA质粒克隆到NTC8485、NTC8685或NTC9385R载体家族中，其组合最小原核序列并包括无抗生素的蔗糖选择标记物。这些家族还含有指导优良的哺乳动物细胞表达的新型嵌合启动子(参见Luke等人，2009；Luke等人，2011；和Williams，2013)。

4.4使用RNA选择标记物的无抗生素选择

如上面描述的，在一些实施方案中，载体不含用于表达本发明的合成构建体的任何非必需序列，例如抗生素抗性标记物。卡那霉素抗性(KanR)是载体中最常用的抗性基因以允许在细菌发酵过程中选择性保留质粒DNA。然而，为确保安全，管理机构通常推荐从治疗和疫苗质粒DNA载体中消除抗生素抗性标记物。由于抗生素抗性向内源性微生物菌群的潜在转移和基因被细胞掺入基因组后由哺乳动物启动子的潜在的激活和转录，疫苗载体中抗生素抗性基因的存在因此被管理机构认为是不期望的。改进以用短RNA无抗生素标记物替换KanR标记物的载体通常具有改善表达的意想不到的好处。NTC7485载体包含卡那霉素抗性抗生素选择标记物。

在一些实施方案中，使用抗生素抗性以外的选择技术。以说明性实例的方式，NTC8485、NTC8684和NTC9385R载体衍生自NTC7485载体，其中KanR抗生素选择标记物被蔗糖可选择的RNA-OUT标记物替换。因此，在一些实施方案中，疫苗载体包含无抗生素的选择系统。虽然已经开发了许多无抗生素的质粒保留系统，其中载体编码的选择标记物不是基于蛋白质的，但是已经观察到具有掺入基于RNA的无抗生素选择标记物的SNA疫苗载体的优良的表达和制备。

合适的基于RNA的无抗生素选择系统的说明性实例是蔗糖选择载体RNA-OUT，一种小的70bp反义RNA系统(Nature Technology Corporation,Nebraska,USA)；pFAR4和pCOR载体编码无义抑制子tRNA标记物；并且pMINI载体利用ColE1起点编码的RNAI反义RNA。这些质粒携带的RNA中的每一个调控宿主染色体编码的选择标记物的翻译，允许质粒选择。例如，RNA-OUT抑制反选择标记物(SacB)从宿主染色体(选择宿主DH5αatt_λ::P_{5/6 6/6}-RNA-IN-SacB,catR)的表达。SacB编码一种果聚糖蔗糖酶，其在蔗糖存在下是有毒的。在蔗糖存在下达到质粒选择。此外，对于RNA-OUT载体和pMINI两者，已经开发了高产的发酵方法。在所有这些载体中，以前已经证明了KanR抗生素选择标记物替换的结果可改善靶生物体中的转基因表达，表明消除抗生素选择以达到管理标准可能意外地还改善了载体表现。

4.5病毒载体

在一些实施方案中，本发明的第一和第二构建体是表达载体的形式，其适当地选自自体复制的染色体外的载体(例如，质粒)和整合到宿主基因组中的载体。在这种类型的说明性实例中，表达载体是病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒(BPV)，其具有作为染色体外元件复制的能力(Eukaryotic Viral Vectors,Cold Spring HarborLaboratory,Gluzman ed.,1982；Sarver等人，1981,Mol.Cell.Biol.1:486)。病毒载体包括逆转录病毒(慢病毒)、腺相关病毒(参见例如Okada,1996,Gene Ther.3:957-964；Muzyczka,1994,J.Clin.Invst.94:1351；美国专利号6,156,303；描述AAV载体的6,143,5485,952,221；还参见美国专利号6,004,799；5,833,993)、腺病毒(参见例如美国专利号6,140,087；6,136,594；6,133,028；6,120,764)、呼肠孤病毒、疱疹病毒、轮状病毒基因组等，其被修饰用于引入和指导细胞中多核苷酸或转基因的表达。逆转录病毒载体可包括基于鼠白血病病毒的那些(参见例如美国专利号6,132,731)、长臂猿白血病病毒(参见例如美国专利号6,033,905)、猿免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒(参见例如美国专利号5,985,641)及其组合。

载体还包括在体内高效地将基因递送到动物细胞(例如，干细胞)的那些(参见例如美国专利号5,821,235和5,786,340；Croyle等人，1998,Gene Ther.5:645；Croyle等人，1998,Pharm.Res.15:1348；Croyle等人，1998,Hum.Gene Ther.9:561；Foreman等人，1998,Hum.Gene Ther.9:1313；Wirtz等人，1999,Gut 44:800)。适用于体内递送的腺病毒和腺相关病毒载体描述于例如美国专利号5,700,470、5,731,172和5,604,090。适用于体内递送的另外的载体包括单纯疱疹病毒载体(参见例如美国专利号5,501,979)、逆转录病毒载体(参见例如美国专利号5,624,820、5,693,508和5,674,703；和WO92/05266和WO92/14829)、牛乳头瘤病毒(BPV)载体(参见例如美国专利号5,719,054)、基于CMV的载体(参见例如美国专利号5,561,063)和细小病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒载体。慢病毒载体对于感染分裂以及非分裂细胞是有用的(参见例如美国专利号6,013,516)。

将可用于递送编码感兴趣抗原的核酸分子的另外的病毒载体包括源自痘病毒家族(包括牛痘病毒和禽痘病毒)的那些。以举例的方式，可如下构建表达第一和第二构建体的牛痘病毒重组体。首先将抗原编码序列插入到适当的载体中，使得其与牛痘启动子相邻并且侧接牛痘DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后将该载体用于转染同时感染牛痘的细胞。同源重组用于将牛痘启动子加上编码感兴趣的编码序列的基因插入到病毒基因组中。可通过在存在5-溴代脱氧尿苷的情况下培养细胞并挑选对其耐药的病毒噬菌斑来选择所得的TK-重组体。

可选择地，禽痘病毒，例如禽痘和金丝雀痘病毒也可用于递送基因。已知当向非禽类物种施用时，表达来自哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒赋予保护性免疫。在人类哺乳动物和其他哺乳动物物种中尤其期望使用禽痘载体，因为禽痘属的成员只能在易感的禽类物种中有效地复制，并因此在哺乳动物细胞中不感染。用于产生重组禽痘病毒的方法是本领域已知的，并且如上关于生产牛痘病毒的描述采用遗传重组。参见例如WO 91/12882；WO 89/03429；和WO 92/03545。

分子结合载体，例如在Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)268:6866-6869和Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103中描述的腺病毒嵌合载体也可用于基因递送。

甲病毒属(Alphavirus)的成员，例如但不限于衍生自辛德比斯病毒(SIN)、塞米利奇森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的载体也将可用作病毒载体用于递送本发明的第一和第二构建体。对于对本方法的实践有用的辛德比斯病毒衍生的载体的描述，参见Dubensky等人(1996,J.Virol.70:508-519；和国际公布号WO 95/07995、WO 96/17072)；以及Dubensky,Jr.,T.W.等人，美国专利号5,843,723和Dubensky,Jr.,T.W.,美国专利号5,789,245。这种类型的示例性载体是包括衍生自辛德比斯病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的序列的嵌合甲病毒载体。参见例如Perri等人(2003,J.Virol.77:10394-10403)和国际公布号WO 02/099035、WO 02/080982、WO 01/81609和WO 00/61772。

在其他说明性实施方案中，采用慢病毒载体以将本发明的第一和第二构建体递送到选定的细胞或组织中。通常，这些载体包含5'慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接到一个或更多个感兴趣基因的启动子、第二链DNA合成起点和3'慢病毒LTR，其中慢病毒载体含有核运输元件。核运输元件可位于感兴趣的编码序列的上游(5')或下游(3')(例如，本发明的合成的Gag或Env表达盒)。可在本发明的上下文中利用各种慢病毒，包括例如选自HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MVV、CAEV和SIV组成的组的慢病毒。PCT公布号WO00/66759、WO 00/00600、WO 99/24465、WO 98/51810、WO 99/51754、WO 99/31251、WO 99/30742和WO 99/15641中描述了慢病毒载体的说明性实例。合意地，使用第三代SIN慢病毒。第三代SIN(自灭活)慢病毒的商业供应商包括Invitrogen(ViraPower LentiviralExpression System)。例如在Invitrogen技术手册“ViraPower Lentiviral ExpressionSystem版本B 050102 25-0501”中(可从http://www.invitrogen.com/Content/Tech-Online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdf获得)给出了慢病毒载体的构建、转染、收获和使用的详细方法，慢病毒载体已经涌现为基因转移的有效方法。生物安全特性的改善已经使得这些载体适合在生物安全等级2(BL2)下使用。第三代SIN(自动灭活)载体中并入了许多安全特征。病毒3'LTR U3区域的缺失导致不能转录全长病毒RNA的原病毒(provirus)。此外，许多必需基因以反式提供，产生能够仅单轮感染和整合的病毒贮存。慢病毒载体有几个优点，包括：1)使用兼性包膜蛋白对载体的假型包装允许其感染几乎任何细胞类型；2)到静止、有丝分裂后、分化细胞(包括神经元)的基因递送已经被证明；3)其低细胞毒性在转基因递送系统中是独特的；4)病毒整合入基因组允许长期转基因表达；5)其包装容量(6-14kb)比其他逆转录病毒或腺相关病毒载体大得多。在该系统能力最近的证明中，表达GFP的慢病毒载体被用于感染鼠干细胞，导致活后代、种系传播和报告基因的启动子特异性和组织特异性表达(Ailles,L.E.和Naldini,L.,HIV-1-Derived Lentiviral Vectors.In:Trono,D.(Ed.),Lentiviral Vectors,Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,New York,2002,pp.31-52)。在Lois等人(2002,Science,295868-872)的综述的图2中概述了当代载体的实例。

第一和第二构建体也可无载体地被递送。例如，构建体可在递送到受试者或从其衍生的细胞之前作为DNA或RNA被包装在脂质体中。脂质包封通常使用能够稳定结合或捕获和保留核酸的脂质体来完成。凝聚的DNA与脂质制剂的比例可变化，但通常为约1:1(mgDNA：微摩尔脂质)或更多的脂质。关于脂质体作为递送核酸的载体的使用的综述，参见Hug和Sleight(1991，Biochim.Biophys.Acta.1097:1-17)；和Straubinger等人，在Methods ofEnzymology(1983),Vol.101,pp.512-527中。

在其他实施方案中，第一和第二构建体包含包含HSV gD2编码序列的mRNA编码序列、由包含HSV gD2编码序列的mRNA编码序列组成或基本上由包含HSV gD2编码序列的mRNA编码序列组成。如上面描述的，HSV gD2编码序列可任选地包含Kozak序列和/或聚腺苷酸化序列。适当地，第一和第二构建体还任选地包括本领域已知的RNA结构的化学修饰，例如骨架的硫代磷酸化或核糖基团的2'-甲氧基甲基化(2'MOE)，以增强mRNA编码序列的摄取、稳定性和最终有效性(参见Agrawal 1999；Gearry等人，2001)。

4.6微环载体(Minicircle Vectors)

在一些实施方案中，第一和/或第二构建体是微环载体的形式。微环载体是小的、双链的环状DNA分子，其提供存在于载体上的HSV gD2编码序列的持续的、高水平的表达，该感兴趣的序列可编码多肽(例如，HSV gD2多肽)。HSV gD2编码序列可操作地连接到存在于微环载体上的调控序列，该调控序列控制其表达。用于本发明的合适的微环载体被描述于，例如在公布的美国专利申请号2004/0214329中，并且可通过Darquet等人，Gene Ther.(1997)4:1341-1349中描述的方法制备。简而言之，HSV gD2编码序列侧翼为重组酶的附着位点，重组酶在编码序列之外的部分载体序列中以可诱导的方式表达。

简而言之，可用类似于pBAD..phi.C31.hFIX和pBAD..phi.C31.RHB的质粒制备微环载体，并用于转化大肠杆菌。本领域已知的重组体酶，例如λ和cre，适用于并入微环载体。存在于微环载体中的表达盒可含有用于转录起始和终止的位点，以及转录区域中的用于翻译的核糖体结合位点。微环载体可包括至少一种选择标记物，例如二氢叶酸还原酶、G418或用于真核细胞培养的新霉素抗性的标记物；和用于在大肠杆菌和其他原核细胞培养物中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。产生质粒的微环可包括至少一个复制起点以允许载体在合适的真核或原核宿主细胞中的繁殖。复制起点是本领域已知的，例如在Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley&Sons,New York(1985)中描述的。

5.组合物

本发明还提供包含本文描述的第一和第二构建体的组合物(特别是免疫原性组合物)，其可例如使用相同或不同的载体或媒介物递送。第一和第二构建体可分别、同时或顺序被施用。免疫原性组合物可被给予不止一次(例如，“初免”施用，随后是一次或多次“加强”)以达到所需的效果。相同的组合物可被以一个或更多个初免和一个或更多个加强步骤施用。可选地，不同的组合物可用于初免和加强。

5.1药学上可接受的组分

本发明的组合物适合地是药物组合物。药物组合物通常包含一种或更多种“药学上可接受的载体”。这些包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这类载体是本领域普通技术人员所熟知的。组合物还可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药学上可接受的组分的详细讨论可在Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.20th ed.,ISBN:0683306472中获得。

药物组合物可包括例如2002年2月14日公布的美国专利申请公布号2002/0019358中公开的各种盐、赋形剂、递送媒介物和/或辅助剂(auxiliary agents)。

可选地或另外，本发明的药物组合物可包括一种或更多种促进将多核苷酸递送至细胞内部和/或至细胞内的期望位置的转染促进化合物。如本文使用的，术语“转染促进化合物”、“转染促进剂”和“转染促进材料”是同义的，并且可互换使用。应当注意，某些转染促进化合物也可以是如下文所述的“佐剂”，即，除促进将多核苷酸递送至细胞内部外，该化合物也用于改变或增加针对多核苷酸编码的抗原的免疫应答。转染促进化合物的实例包括但不限于无机材料例如磷酸钙、明矾(磷酸铝)和金颗粒(例如，“粉末”型递送媒介物)；肽，例如，典型的、细胞间靶向的(用于选择性递送至某些细胞类型)、细胞内靶向的(用于核定位或内体逃逸)和两亲的(螺旋形成的或孔形成的)；蛋白质，例如，碱性的(例如，带正电荷的)例如组蛋白、靶向的(例如，脱唾液酸蛋白)、病毒的(例如，仙台病毒外壳蛋白)和孔形成的；脂质，例如，阳离子的(例如，DMRIE、DOSPA、DC-Chol)、碱性的(例如，甾胺)、中性的(例如，胆固醇)、阴离子的(例如，磷脂酰丝氨酸)和两性离子的(例如，DOPE、DOPC)；和聚合物例如树枝状聚合物、星形聚合物、“均质的”聚氨基酸(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸)、“异质的”聚氨基酸(例如，赖氨酸&甘氨酸的混合物)、共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、泊洛沙姆(例如CRL1005)和聚乙二醇(PEG)。转染促进材料可单独使用或与一种或更多种其他转染促进材料组合使用。两种或更多种转染促进材料可通过以下反式组合：化学键合(例如，共价的和离子的，例如在脂质化聚赖氨酸、聚乙二醇化聚赖氨酸中)(Toncheva等人，Biochim.Biophys.Acta 1380(3):354-368(1988))、机械混合(例如，在液相或固相中的自由移动材料例如“聚赖氨酸+阳离子脂质”)(Gao和Huang,Biochemistry 35:1027-1036(1996)；Trubetskoy等人，Biochem.Biophys.Acta 1131:311-313(1992))和聚集(例如，共沉淀、凝胶形成例如在阳离子脂质+聚丙交酯和聚赖氨酸+明胶中)。

转染促进材料的一类是阳离子脂质。阳离子脂质的实例是5-羧基鲸蜡基甘氨酸二辛基酰胺(5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide，DOGS)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-5-羧基鲸蜡酰胺(dipalmitoyl-phophatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide，DPPES)。阳离子胆固醇衍生物也是有用的，包括{3β-[N-N',N'-二甲基氨基)乙烷]-氨基甲酰基}-胆固醇(DC-Chol)。二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、N-(3-氨基丙基)-N,N-(双-(2-十四烷氧基乙基))-N-甲基溴化铵(PA-DEMO)、N-(3-氨基丙基)N,N-(双-(2-十二烷基氧基乙基))-N-甲基溴化铵(PA-DELO)、N,N,N-三-(2-十二烷基氧基)乙基-N-(3-氨基)溴化铵(PA-TELO)和N1-(3-氨基丙基)((2-十二烷基氧基)乙基)-N2-(2-十二烷基氧基)乙基-1-哌嗪胺溴化物(GA-LOE-BP)也可用于本发明。

非二醚阳离子脂质，例如DL-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵(DORI二酯)、1-O-油基-2-油酰基-3-二甲基氨基丙基对羟乙基铵(DORI酯/醚)和其盐促进体内基因递送。在一些实施方案中，阳离子脂质包含通过附接于头基中季铵部分的杂原子附接的基团。甘氨酰基间隔子可将接头连接到羟基上。

用于本发明的某些实施方案中的具体但非限制性的阳离子脂质包括DMRIE((±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺溴化物)、GAP-DMORIE((±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四碳烯基氧基)-1-丙胺溴化物)和GAP-DMRIE((±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-(双十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物)。

用于本发明的某些实施方案的其他具体但非限制性的阳离子表面活性剂包括Bn-DHRIE、DhxRIE、DhxRIE-OAc、DhxRIE-OBz和Pr-DOctRIE-OAc。这些脂质在共同未决的美国专利申请序列号10/725,015中公开。在本发明的另一个方面，阳离子表面活性剂是Pr-DOctRIE-OAc。

其他阳离子脂质包括(±)-N,N-二甲基-N-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-2,3-双(二油烯基氧基)-1-丙酰胺五盐酸盐(DOSPA)、(±)-N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(β-氨基乙基-DMRIE或βAE-DMRIE)(Wheeler等人，Biochim.Biophys.Acta 1280：1-11(1996)和(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(GAP-DLRIE)(Wheeler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11454-11459(1996))，其从DMRIE开发。

对本发明有用的DMRIE衍生的阳离子脂质的其他实例是(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-(二-癸氧基)-1-丙酰胺溴化物(GAP-DDRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-(双-十四烷基氧基)-1-丙胺溴化物(GAP-DMRIE)、(±)-N-((N”-甲基)-N'-次脲)丙基-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(GMU-DMRIE)、(±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)-1-丙酰胺溴化物(DLRIE)和(±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双-([Z]-9-十八烯基氧基)丙基-1-丙酰胺溴化物(HP-DORIE)。

在免疫原性组合物包含阳离子脂质的实施方案中，阳离子脂质可与一种或更多种共脂质混合。为了定义的目的，术语“共脂质(co-lipid)”是指可与阳离子脂质组分组合的任何疏水材料并且包括两亲性脂质例如磷脂和中性脂质例如胆固醇。阳离子脂质和共脂质可以多种方式混合或组合以产生各种非共价键合的宏观结构，包括例如脂质体、多层囊泡、单层囊泡、胶束和简单膜。一种非限制类的共脂质是两性离子磷脂，其包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。磷脂酰乙醇胺的实例包括DOPE、DMPE和DPyPE。在某些实施方案中，共脂质是DPyPE，其包含并入二酰基磷脂酰乙醇胺骨架中的两个植酰基取代基，并且阳离子脂质是GAP-DMORIE(导致VAXFECTIN佐剂)。在其他实施方案中，共脂质是DOPE，CAS名称是1,2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。

当本发明的组合物包含阳离子脂质和共脂质时，阳离子脂质:共脂质的摩尔比可为约9:1至约1:9、约4:1至约1:4、约2:1至约1:2或约1:1。

为了使均一性最大化，阳离子脂质和共脂质组分可溶解在溶剂例如氯仿中，随后在真空下蒸发阳离子脂质/共脂质溶液至干燥，作为玻璃容器(例如，Rotovap圆底烧瓶)的内表面上的膜。在水性溶剂中悬浮后，两亲性脂质组分分子自组装成均匀的脂质囊泡。根据本领域技术人员已知的方法，可在与例如本发明的密码子优化的多核苷酸络合之前，将这些脂质囊泡继而加工成具有均匀大小的选定的平均直径。例如，脂质溶液的超声处理在Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Natl.Acad.Sci.USA 8:,7413-7417(1987)和在美国专利号5,264,618中被描述。

在组合物包含阳离子脂质的那些实施方案中，通过混合将本发明的多核苷酸与脂质络合，例如水性溶液中的质粒和本文制备的阳离子脂质:共脂质的溶液被混合。可在混合之前调整各组成溶液的浓度，使得在混合两种溶液后获得所需的最终质粒/阳离子脂质:共脂质比例和所需的质粒终浓度。通过在适当体积的水性溶剂中通过在室温下涡旋混合约1分钟将混合脂质材料的薄膜水合而适当地制备阳离子脂质:共脂质混合物。通过混合各组分的氯仿溶液来制备薄膜，以提供所需的摩尔溶质比，然后将所需体积的溶液等分到合适的容器中。通过蒸发除去溶剂，首先用干燥、惰性的气体(例如氩气)流，随后用高真空处理。

其他疏水性和两亲性的添加剂，例如甾醇、脂肪酸、神经节苷脂、糖脂、脂肽、脂糖、neobees、类脂质体(niosomes)、前列腺素和鞘脂也可被包括在本发明的组合物中。在这样的组合物中，这些添加剂可以约0.1mol％至约99.9mol％(相对于总脂质)、约1-50mol％或约2-25mol％的量被包括。

第一和第二构建体也可被包封、吸附于颗粒载体或与之关联。这类载体将选定的构建体的多个拷贝呈递给免疫系统。颗粒可被专业的抗原呈递细胞例如巨噬细胞和树突状细胞吸收，和/或可通过其他机制例如细胞因子释放的刺激增强抗原呈递。颗粒载体的实例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(被称为PLG)的微粒。参见例如Jeffery等人，1993,Pharm.Res.10:362-368；McGee J.P.等人，1997,J Microencapsul.14(2):197-210；O'Hagan D.T.,等人,1993,Vaccine 11(2):149-54。

此外，其他颗粒系统和聚合物可用于本文描述的组合物的体内递送。例如，聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的缀合物，对转移感兴趣的核酸是有用的。类似地，DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀或使用其他不溶性无机盐(例如磷酸锶、包括膨润土和高岭土的硅酸铝、氧化铬、硅酸镁、滑石等)的沉淀将可与本方法一起使用。关于对基因转移有用的递送系统的综述，参见例如Felgner,P.L.,Advanced DrugDelivery Reviews(1990)5:163-187。类肽(Zuckerman,R.N.等人，美国专利号5,831,005，发布于1998年11月3日)也可用于递送本发明的构建体。

本发明的另外的实施方案延伸到包含在合成构建体施用之前、之后或同时施用的辅助剂的组合物。如本文使用的，“辅助剂(auxiliary agent)”是由于其增强(相对于除了包含该辅助剂外相同的组合物)多核苷酸在体内进入脊椎动物细胞的能力和/或由这类多核苷酸编码的多肽的体内表达的能力而被包含在组合物中的物质。除了增强多核苷酸进入细胞之外，某些辅助剂可增强针对由多核苷酸编码的免疫原的免疫应答。本发明的辅助剂包括非离子的、阴离子的、典型的或两性离子的表面活性剂或洗涤剂(优选非离子表面活性剂或洗涤剂)、螯合剂、DNA酶抑制剂、泊洛沙姆、聚集或凝聚核酸的剂、乳化剂或增溶剂、润湿剂、凝胶形成剂和缓冲剂。

用于本发明的组合物的辅助剂包括但不限于非离子洗涤剂和表面活性剂IGEPALCA 6300辛基苯基-聚乙二醇、NONIDET NP-40壬基苯氧基聚乙氧基乙醇、NONIDET P-40辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、TWEEN-20聚山梨醇酯20、TWEEN-80聚山梨醇酯80、PLURONIC F68泊洛沙姆(平均MW：8400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F77泊洛沙姆(平均MW：6600；疏水物的大约MW，2100；亲水物的大约wt.％，70％)、PLURONIC P65泊洛沙姆(平均MW：3400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，50％)、TRITON X-100 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇和TRITON X-114(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇；阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)；糖水苏糖；凝聚剂DMSO；和螯合剂/DNA酶抑制剂EDTA、CRL 1005(12kpa，5％POE)和BAK(苯扎氯铵50％溶液，得自Ruger ChemicalCo.Inc.)。在某些具体实施方案中，辅助剂为DMSO、NONIDET P-40辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、PLURONIC F68泊洛沙姆(平均MW：8400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F77泊洛沙姆(平均MW：6600；疏水物的大约MW，2100；亲水物的大约wt.％，70％)、PLURONIC P65(平均MW：3400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，50％)、Pluronic PLURONIC L64泊洛沙姆(平均MW：2900；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，40％)、和PLURONIC F108泊洛沙姆(平均MW：14600；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，80％)。参见例如公布于2002年2月14日的美国专利申请公布号2002/0019358。

本发明的某些组合物还可包括在多核苷酸之前、之后或与多核苷酸同时的一种或更多种佐剂。术语“佐剂(adjuvant)”是指具有(1)改变或增加针对特定抗原的免疫应答或(2)增加或辅助药理学剂的作用的能力的任何材料。应当注意，关于多核苷酸疫苗，“佐剂”可以是转染促进材料。类似地，上文描述的某些“转染促进材料”也可以是“佐剂”。佐剂可与包含本发明的多核苷酸的组合物一起使用。如本文描述的，在初免-加强方案中，佐剂可与初免、加强免疫二者之一或两者一起使用。合适的佐剂包括但不限于细胞因子和生长因子；细菌组分(例如，内毒素(特别是超抗原)、外毒素和细胞壁组分)；铝基盐；钙基盐；二氧化硅；多核苷酸；类毒素；血清蛋白、病毒和病毒衍生材料、毒素、毒液、咪唑并喹啉化合物、泊洛沙姆和阳离子脂质。

已经显示各种各样的材料通过各种机制具有佐剂活性。任何可能增加多肽的表达、抗原性或免疫原性的化合物都是潜在的佐剂。本发明提供筛选针对潜在佐剂的改善的免疫应答的测定。可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的潜在佐剂，其包括但不限于：惰性载体，例如明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸颗粒；PLONONIC嵌段聚合物，例如TITERMAX(嵌段共聚物CRL-8941、角鲨烯(代谢油)和微粒二氧化硅稳定剂)；储库形成物，例如弗氏佐剂、表面活性材料，例如皂角苷、溶血卵磷脂、视黄醛、Quil A、脂质体和PLURONIC聚合物制剂；巨噬细胞刺激剂，例如细菌脂多糖；替代途径补体激活剂，例如胰岛素、酵母聚糖、内毒素和左旋咪唑；和非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆、聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)三嵌段共聚物。还作为佐剂被包括的是转染促进材料，例如上面描述的那些。

可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的泊洛沙姆包括但不限于可商购的泊洛沙姆例如PLURONIC表面活性剂，其是环氧丙烷和环氧乙烷的嵌段共聚物，其中环氧丙烷嵌段夹在两个环氧乙烷嵌段之间。PLURONIC表面活性剂的实例包括PLURONIC L121泊洛沙姆(平均MW：4400；疏水物的大约MW，3600；亲水物的大约wt％，10％)、PLURONIC L101泊洛沙姆(平均MW：3800；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC L81泊洛沙姆(平均MW：2750；疏水物的大约MW，2400；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC L61泊洛沙姆(平均MW：2000；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC L31泊洛沙姆(平均MW：1100；疏水物的大约MW，900；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC L122泊洛沙姆(平均MW：5000；疏水物的大约MW，3600；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC L92泊洛沙姆(平均MW：3650；疏水物的大约MW，2700；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC L72泊洛沙姆(平均MW：2750；疏水物的大约MW，2100；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC L62泊洛沙姆(平均MW：2500；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC L42泊洛沙姆(平均MW：1630；疏水物的大约MW，1200；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC L63泊洛沙姆(平均MW：2650；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，30％)、PLURONIC L43泊洛沙姆(平均MW：1850；疏水物的大约MW，1200；亲水物的大约wt.％，30％)、PLURONIC L64泊洛沙姆(平均MW：2900；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC L44泊洛沙姆(平均MW：2200；疏水物的大约MW，1200；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC L35泊洛沙姆(平均MW：1900；疏水物的大约MW，900；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC P123泊洛沙姆(平均MW：5750；疏水物的大约MW，3600；亲水物的大约wt.％，30％)、PLURONIC P103泊洛沙姆(平均MW：4950；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，30％)、PLURONIC P104泊洛沙姆(平均MW：5900；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC P84泊洛沙姆(平均MW：4200；疏水物的大约MW，2400；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC P105泊洛沙姆(平均MW：6500；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC P85泊洛沙姆(平均MW：4600；疏水物的大约MW，2400；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC P75泊洛沙姆(平均MW：4150；疏水物的大约MW，2100；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC P65泊洛沙姆(平均MW：3400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONICF127泊洛沙姆(平均MW：12600；疏水物的大约MW，3600；亲水物的大约wt.％，70％)、PLURONIC F98泊洛沙姆(平均MW：13000；疏水物的大约MW，2700；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F87泊洛沙姆(平均MW：7700；疏水物的大约MW，2400；亲水物的大约wt.％，70％)、PLURONIC F77泊洛沙姆(平均MW：6600；疏水物的大约MW，2100；亲水物的大约wt.％，70％)、PLURONIC F108泊洛沙姆(平均MW：14600；疏水物的大约MW，3000；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F98泊洛沙姆(平均MW：13000；疏水物的大约MW，2700；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F88泊洛沙姆(平均MW：11400；疏水物的大约MW，2400；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F68泊洛沙姆(平均MW：8400；疏水物的大约MW，1800；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC F38泊洛沙姆(平均MW：4700；疏水物的大约MW，900；亲水物的大约wt.％，80％)。

可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的反向泊洛沙姆(Reverse poloxamer)包括但不限于PLURONIC R 31R1反向泊洛沙姆(平均MW：3250；疏水物的大约MW，3100；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC R25R1反向泊洛沙姆(平均MW：2700；疏水物的大约MW，2500；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC R 17R1反向泊洛沙姆(平均MW：1900；疏水物的大约MW，1700；亲水物的大约wt.％，10％)、PLURONIC R 31R2反向泊洛沙姆(平均MW：3300；疏水物的大约MW，3100；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC R25R2反向泊洛沙姆(平均MW：3100；疏水物的大约MW，2500；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC R 17R2反向泊洛沙姆(平均MW：2150；疏水物的大约MW，1700；亲水物的大约wt.％，20％)、PLURONIC R12R3反向泊洛沙姆(平均MW：1800；疏水物的大约MW，1200；亲水物的大约wt.％，30％)、PLURONIC R31R4反向泊洛沙姆(平均MW：4150；疏水物的大约MW，3100；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC R 25R4反向泊洛沙姆(平均MW：3600；疏水物的大约MW，2500；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC R 22R4反向泊洛沙姆(平均MW：3350；疏水物的大约MW，2200；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC R17R4反向泊洛沙姆(平均MW：3650；疏水物的大约MW，1700；亲水物的大约wt.％，40％)、PLURONIC R 25R5反向泊洛沙姆(平均MW：4320；疏水物的大约MW，2500；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC R10R5反向泊洛沙姆(平均MW：1950；疏水物的大约MW，1000；亲水物的大约wt.％，50％)、PLURONIC R 25R8反向泊洛沙姆(平均MW：8550；疏水物的大约MW，2500；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC R17R8反向泊洛沙姆(平均MW：7000；疏水物的大约MW，1700；亲水物的大约wt.％，80％)、PLURONIC R 10R8反向泊洛沙姆(平均MW：4550；疏水物的大约MW，1000；亲水物的大约wt.％，80％)。

可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的其他可商购的泊洛沙姆包括是聚乙烯和聚丙二醇的嵌段共聚物的化合物，例如SYNPERONIC L121(平均MW：4400)、SYNPERONICL122(平均MW：5000)、SYNPERONIC P104(平均MW：5850)、SYNPERONIC P105(平均MW：6500)、SYNPERONIC P123(平均MW：5750)、SYNPERONIC P85(平均MW：4600)和SYNPERONIC P94(平均MW：4600)，其中L指示表面活性剂是液体，P指示其是糊状物，第一个数字是表面活性剂的聚丙烯部分的分子量的量度，且数字的最后一位数乘以10，给出表面活性剂的环氧乙烷含量百分比；和是壬基苯基聚乙二醇的化合物，例如SYNPERONIC NP10(壬基酚乙氧基化表面活性剂-10％溶液)、SYNPERONIC NP30(1摩尔壬基酚与30摩尔环氧乙烷的缩合物)和SYNPERONIC NP5(1摩尔壬基酚与5.5摩尔氧化萘的缩合物)。

可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的其他泊洛沙姆包括：(a)包含A型段和B型段的聚醚嵌段共聚物，其中A型段包含相对亲水性的线性聚合物段，其重复单元贡献约-0.4或更少的平均Hansch-Leo片段常数，并且具有在约30至约500之间的分子量贡献，其中B型段包含相对疏水性的线性聚合物段，其重复单元贡献约-0.4或更多的平均Hansch-Leo片段常数，并且具有在约30至约500之间的分子量贡献，其中连接每个聚合物段的重复单元的键的至少约80％包含醚键；(b)具有聚醚段和聚阳离子段的嵌段共聚物，其中聚醚段包含至少A型嵌段，并且聚阳离子段包含多个阳离子重复单元；和(c)聚醚-聚阳离子共聚物，其包含聚合物、聚醚段和聚阳离子段，聚阳离子段包含多个式-NH-R0的阳离子重复单元，其中R0是2至6个碳原子的直链脂族基团，其可被取代，其中所述聚醚段包含A型或B型段中的至少一种。参见美国专利号5,656,611。其他感兴趣的泊洛沙姆包括CRL1005(12kDa，5％POE)、CRL8300(11kDa，5％POE)、CRL2690(12kDa，10％POE)、CRL4505(15kDa，5％POE)和CRL1415(9kDa，10％POE)。

可筛选其增强根据本发明的免疫应答能力的其他辅助剂包括但不限于阿拉伯胶(阿拉伯树胶)；聚氧乙烯醚R—O—(C2H4O)x—H(BRIJ)，例如，聚乙二醇十二烷基醚(BRIJ35，x＝23)、聚乙二醇十二烷基醚(BRIJ 30，x＝4)、聚乙二醇十六烷基醚(BRIJ 52，x＝2)、聚乙二醇十六烷基醚(BRIJ 56，x＝10)、聚乙二醇十六烷基醚(BRIJ 58P，x＝20)、聚乙二醇十八烷基醚(BRIJ 72，x＝2)、聚乙二醇十八烷基醚(BRIJ 76，x＝10)、聚乙二醇十八烷基醚(78P，x＝20)、聚乙二醇油基醚(BRIJ 92V，x＝2)和聚氧基10油基醚(BRIJ 97，x＝10)；聚-D-葡糖胺(壳聚糖)；氯丁醇；胆固醇；二乙醇胺；毛地黄皂苷(digitonin)；二甲基亚砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)；甘油单硬脂酸酯；羊毛脂醇；甘油单酯和甘油二酯；单乙醇胺；壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)；辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(来自Amresco的NONIDET NP-40)；乙基苯酚聚(乙二醇醚)n，n＝11(来自Roche的NONIDET P40)；具有约9个环氧乙烷单元的辛基苯酚环氧乙烷缩合物(NONIDET P40)；IGEPAL CA 630((辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇；结构上与NONIDET NP-40相同)；油酸；油醇；聚乙二醇8000；聚氧乙烯20十六烷基-十八烷基醚；聚氧乙烯35蓖麻油；聚氧乙烯40氢化蓖麻油；聚氧乙烯40硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(聚山梨醇酯20或TWEEN-20)；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(聚山梨醇酯80或TWEEN-80)；丙二醇二乙酸酯；丙二醇单硬脂酸酯；鱼精蛋白硫酸盐；蛋白水解酶；十二烷基硫酸钠(SDS)；单月桂酸钠；硬脂酸钠；山梨醇酐衍生物(SPAN)，例如山梨醇酐单棕榈酸酯(SPAN 40)、山梨醇酐单硬脂酸酯(SPAN 60)、山梨醇酐三硬脂酸酯(SPAN 65)、山梨醇酐单油酸酯(SPAN 80)和山梨醇酐三油酸酯；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯(角鲨烯)；水苏糖；硬脂酸；蔗糖；表面活性素(来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的脂肽抗生素)；十二烷基聚(乙二醇醚)9(THESIT)MW 582.9；具有约9-10个环氧乙烷单元的辛基苯酚环氧乙烷缩合物(TRITON X-100)；具有约7-8个环氧乙烷单元的辛基酚环氧乙烷缩合物(TRITON X-114)；三(2-羟乙基)胺(三乙醇胺)；和乳化蜡。

在某些佐剂组合物中，佐剂是细胞因子。本发明的组合物可包含一种或更多种细胞因子、趋化因子或诱导细胞因子和趋化因子的生成的化合物，或编码一种或更多种细胞因子、趋化因子或诱导细胞因子和趋化因子的生成的化合物的多核苷酸。实例包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素(EPO)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素Ω(IFNΩ)、干扰素τ(IFNτ)、干扰素γ诱导因子I(IGIF)、转化生长因子β(TGF-β)、RANTES(regulated upon activation,normal T-cellexpressed and presumably secreted(调节激活正常T细胞表达和推测分泌因子))、巨噬细胞炎性蛋白(例如，MIP-1α和M3P-1β)、利什曼虫延长起始因子(LEIF)和Flt-3配体。

在本发明的某些组合物中，多核苷酸构建体可与包含(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯酰氧基)-1-丙酰胺溴化物(GAP-DMORIE)的佐剂组合物络合。组合物还可包含一种或更多种共脂质，例如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPyPE)和/或1,2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)。以1:1摩尔比包含GAP-DMORIE和DPyPE的佐剂组合物在本文中被称为VAXFECTIN佐剂。参见例如PCT公布号WO 00/57917。

在其他实施方案中，多核苷酸本身可作为佐剂起作用，如当本发明的多核苷酸全部或部分地衍生自细菌DNA的情况。含有未甲基化的CpG-二核苷酸(CpG-DNA)基序的细菌DNA通过模式识别受体(包括例如TLR 9的toll受体)触发脊椎动物中的先天免疫细胞，并且因此对巨噬细胞、树突状细胞和B淋巴细胞具有有效的免疫刺激作用。参见例如Wagner,H.,Curr.Opin.Microbiol.5:62-69(2002)；Jung,J.等人，J.Immunol.169:2368-73(2002)；还参见Klinman,D.M.等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.93:2879-83(1996)。使用未甲基化CpG-二核苷酸作为佐剂的方法被描述于例如美国专利号6,207,646、6,406,705和6,429,199。

佐剂增加针对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的保护的显著增加。例如，体液免疫的增加通常表现为对抗原产生的抗体滴度的显著增加，并且T细胞活性的增加通常表现为增加的细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌。佐剂也可例如通过将主要为体液或Th2应答改变成主要为细胞或Th1应答来改变免疫应答。

本发明的核酸分子和/或多核苷酸，例如质粒DNA、mRNA、线性DNA或寡核苷酸可溶解在各种缓冲液的任一种中。合适的缓冲液包括例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸钠(例如，150mM磷酸钠)。不溶性多核苷酸可溶解在弱酸或弱碱中，并且然后用缓冲液稀释至所需体积。可适当地调整缓冲液的pH。另外，可使用药学上可接受的添加剂来提供适当的渗透压。这类添加剂在本领域技术人员的范围之内。对于体内使用的水性组合物，可使用无菌无热原的水。这类制剂将含有有效量的多核苷酸连同适量的水性溶液，以便制备适于向人施用的药学上可接受的组合物。

本发明的组合物可根据已知的方法配制。适用的制备方法被描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,A.Osol,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1980)和Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1995)。尽管组合物可作为水性溶液施用，但也可配制成乳液、凝胶、溶液、悬浮液、冻干形式或本领域已知的任何其他形式。另外，组合物可含有药学上可接受的添加剂，包括例如稀释剂、粘合剂、稳定剂和防腐剂。

仅为了说明的目的包括以下示例，并不意图限制由所附权利要求限定的本发明的范围。

5.2剂量

本发明通常涉及治疗组合物，即，以在感染后治疗疾病。组合物将包含本文定义的组合物的“治疗有效量”，使得可在体内产生抗原的量，使得在其施用的个体中产生免疫应答。必需的确切的量将根据以下而变化：受治疗的受试者；待治疗的受试者的年龄和一般状况；受试者免疫系统合成抗体的能力；所需的保护程度；所治疗状况的严重程度；选定的具体抗原和其施用模式等因素。本领域技术人员可容易地确定适当的有效量。因此，“治疗有效量”将落在可通过常规试验确定的相对宽的范围内。

例如，在施用本文描述的药物组合物约24小时后，剂量依赖性DTH反应发生在接受至少约30μg、40μg、50μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、大于1mg或其间的任何整数的剂量的人类受试者中。合适的剂量可以多于一个单位被施用(例如，1mg可分为各包含500μg剂量的两个单位)。

剂量治疗可以是单剂量计划表或多剂量计划表。在一些实施方案中，在约30μg至约1mg或更高之间的剂量足以诱发对组合物的DTH反应。因此，为了治疗HSV-2感染，本发明的方法包括约30μg、100μg、300μg、1mg或更多的本文定义的组合物的剂量。

本发明的组合物可适当被配制成用于注射。组合物可以单位剂型制备于安瓿或多剂量容器中。多核苷酸可以在油性或优选水性的媒介物中的悬浮液、溶液或乳液这类形式存在。可选择地，多核苷酸盐可以是冻干形式，用于在递送时用合适的媒介物例如无菌无热原水进行重构。液体以及待重构的冻干形式都将包含适当调整注射溶液pH值所需量的剂，优选缓冲液。对于任何肠胃外的使用，特别是如果要静脉内施用制剂，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗、低渗或弱高渗。优选非离子性材料，例如糖用于调整张力，并且蔗糖是特别优选的。这些形式中的任一种还可包含合适的配制剂，例如淀粉或糖、甘油或盐水。每单位剂量的组合物，无论是液体还是固体，可含有0.1％至99％的多核苷酸材料。

多核苷酸在使用前被包装在其中的单位剂量安瓿或多剂量容器，可包含封闭适合其药学有效剂量或有效剂量的倍数的一定量的多核苷酸或含有多核苷酸的溶液的密封的容器。将多核苷酸作为无菌制剂包装，并将气密密封的容器设计成保持制剂的无菌性直到使用。

将其中包装有多核苷酸的容器标记，且标记物具有以政府机构(例如美国食品和药物管理局)规定的格式的告示，该告示反映了机构根据联邦法律批准了用于人类施用的其中多核苷酸材料的制造、使用或销售。

在大多数地区，联邦法律要求在人类的治疗中的药剂的使用被联邦政府机构批准。强制执行的责任是食品和药物管理局的责任，其发行合适的条例规定以确保这类批准，详述于21 U.S.C.§§301-392。包括由动物组织制成的产品的生物材料的条例提供于42U.S.C.§262。大多数外国都需要类似的批准。条例因国而异，但个体程序是本领域技术人员所熟知的。

待施用的剂量在很大程度上取决于被治疗的受试者的状况和大小以及治疗的频率和施用途径。继续治疗的方案包括剂量和频率可由初始响应和临床判断指导。注射到组织的间质空间中的肠胃外途径是优选的，尽管在特定施用中，可能需要其他肠胃外途径例如吸入气雾剂制剂，例如向鼻、喉、支气管组织或肺的粘膜的施用。

在优选的方案中，将包含在水性载体中的裸多核苷酸的制剂以每个部位10μl至每个部位约1ml的量注入组织中。制剂中多核苷酸的浓度为约0.1μg/ml至约20mg/ml。

5.3施用途径

一旦被配制，本发明的组合物可直接被施用于受试者(例如，如上面描述的)。通过使用常规注射器、无针装置(例如BIOJECT^TM)或基因枪，例如ACCELL^TM基因递送系统(PowderMed Ltd，Oxford，England)或微针装置进行注射，如上面描述的，通常使用或不使用载体达到含有第一和第二构建体的组合物的体内直接递送。可皮内递送(例如，注射)构建体。将核酸递送到表皮的细胞中是特别优选的，因为这种施用模式提供达到与皮肤相关的淋巴样细胞的途径并且为接受者中核酸(例如，DNA)的瞬时存在做准备。

合适地，本文描述的组合物被配制用于NANOPASS(Vaxxas，Brisbane，Australia)贴剂，用于微针施用。

在其他实施方案中，本发明的组合物通过电穿孔被施用。这类技术大大增加跨细胞质膜屏障的质粒转移，以将质粒直接或间接地转染到细胞质中。

此外，采用颗粒载体例如金和钨的基因枪递送系统对于递送本发明的组合物特别有用。颗粒涂覆有待递送的合成表达盒，并且，通常在还原的气氛下，使用从“基因枪”放出的枪粉将颗粒加速至高速度。关于这类技术和对此有用的装置的描述，参见例如美国专利号4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015；和5,478,744。在说明性实例中，气体驱动颗粒的加速可用例如由PowderMed Pharmaceuticals PLC(Oxford,UK)和PowderMed Vaccines Inc.(Madison,Wis.)制造的那些装置来实现，其一些示例被描述于美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和EP专利号0500799中。该方法提供了无针递送方法，其中微型颗粒(例如多核苷酸或多肽颗粒)的干粉制剂在由手持装置产生的氦气射流内被加速至高速，将颗粒推进到感兴趣的靶组织中。对于本发明的组合物的气驱无针注射可以有用的其他装置和方法包括由BIOJECT,Inc.(Portland,Oreg.)提供的那些，其一些示例被描述于美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中。

可选择地，可使用基于微插管和微针的装置(例如由Becton Dickinson开发的那些等)来施用本发明的组合物。这种类型的说明性装置被描述于EP 1 092 444 A1和提交于2000年6月29日的美国申请序列号606,909中。使用如1999年10月14日提交的美国序列号417,671中描述的装置和方法，标准钢插管也可用于皮内递送。这些方法和装置包括通过具有有限穿透深度的窄口径(约30G)“微插管”递送物质，所述有限穿透深度如由插管的总长度或在深度限制特征之外暴露的插管的总长度定义的。在本发明的范围内的是，包括本文描述的组合物的物质的靶向递送可通过单个微插管或微插管(或“微针”)阵列来实现，例如安装在注射装置上的3-6个微针，注射装置可包括或附接到其中容纳待施用物质的储存器。

为了本发明可容易地被理解并付诸实践，现在将以以下非限制性实施例的方式描述特定的优选实施方案。

实施例

实施例1

HSV-2 DNA疫苗组合物的构建

制备HSV gD2疫苗组合物(COR-1)，其包含等浓度的第一和第二构建体。将第一和第二合成编码序列克隆到NTC8485表达载体(Nature Technology Corporation(NTC)，Nebraska，U.S.A.)中(构建体在本文中被称为“NTC8485-O2-gD2”)。第一合成编码序列包括密码子优化的全长HSV-2gD2多核苷酸，如在SEQ ID NO：3中列出的(参见，图1A)。

第二构建体包含编码在其N-末端缀合至一个泛素重复段(Ubi-gD2tr)的HSV gD2的截短形式(残基25-331)的密码子优化的DNA序列(构建体在本文中被称为“NTC8485-O2-Ubi-gD2tr”)。第二合成编码序列O2-Ubi-gD2tr的核苷酸序列在SEQ ID NO：2中被列出。

COR-1是用TE缓冲液(10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8)配制的NMP8485-O2-gD2和NTC8485-O2-Ubi-gD2tr的GMP级的1:1汇集混合物。

材料和方法

5.4构建体的制备

制备以下HSV gD2构建体：gD2全长野生型序列(gD2)和泛素化和截短的gD2序列(O2-Ubi-gD2tr)，如在Nelson等人，Hum.Vaccin.Immunother,(2013),9:2211-5中描述的。

简而言之，根据制造商的方案，将O2-gD2和O2-Ubi-gD2tr序列克隆到NTC8485载体中。简而言之，将ATG起始密码子放置在载体中紧接着Sal之后。SalI位点被证明是用于翻译起始的高效的共有的Kozak序列。

通过使用具有SalI(5'末端)和BglI(3'末端)位点的引物进行PCR扩增来复制O2-gD2和O2-Ubi-gD2tr基因。用SalI/BglI切割载体产生与切割的PCR产物相容的粘性末端。因此插入物被定向地和精确地克隆到载体中。大多数恢复的菌落是重组的，因为在亲本载体中产生的粘性末端不相容。

5.5引物设计/合成和序列操作

根据相关的诱变试剂盒手册(Quikchange II Site-directed Mutagenesis kitor Quikchange Multi Site-directed Mutagenesis Kit；Stratagene,La Jolla CA)中包含的指南设计用于定点诱变的寡核苷酸。这些引物由Sigma Proligo合成和PAGE纯化。

用于全基因合成的寡核苷酸被手动设计，并由Sigma Proligo合成。引物以标准脱盐寡核苷酸被提供。不进行寡核苷酸的额外的纯化。

序列操作和分析使用以下进行：BioEdit版本7(Hall，1999)和各种基于网络的程序，包括Biomanager(澳大利亚国家基因组信息服务(Australian National GenomeInformation Service))、NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)、来自New England Biolabs的NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)、ExPASy上的翻译工具(http://au.expasy.org/tools/dna.html)和SignalP 3.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

5.6标准分子生物学技术

根据酶制造商的说明书(各种制造商，包括New England Biolabs、Roche和Fermentas)进行限制酶消化、碱性磷酸酶处理和连接。使用商品试剂盒(Qiagen、Bio-Rad和Macherey-Nagel)进行从琼脂糖凝胶的DNA纯化和少量制备(mini-prep)DNA的制备。

使用类似于在Current Protocols in Molecular Biology(可通过WileyInterScience获得的电子书；由Ausubel等人编辑)中描述的那些的标准方案进行琼脂糖凝胶电泳、DNA中污染蛋白质的苯酚/氯仿提取、DNA的乙醇沉淀和其他基础的分子生物学操作。

由澳大利亚基因组研究设备(Australian Genome Research Facility)(AGRF，Brisbane)进行了测序。

5.7全基因合成

使用重叠的～35-50mer的寡核苷酸(Sigma-Proligo)合成长DNA序列，并且掺入限制性酶切位点以促进克隆。用于合成片段的方法是基于Smith等人(2003)提供的那些。首先，将顶部或底部链的寡核苷酸混合，然后使用T4多核苷酸激酶(PNK；New EnglandBiolabs)磷酸化。通过标准苯酚/氯仿提取和乙酸钠/乙醇(NaAc/EtOH)沉淀从PNK纯化寡核苷酸混合物。然后将等体积的顶部和底部链的寡核苷酸混合物混合，并且寡核苷酸通过在95℃下加热2分钟变性。通过将样品缓慢冷却至55℃而将寡核苷酸退火，并使用Taq连接酶(New England Biolabs)连接退火的寡核苷酸。所得片段通过苯酚/氯仿提取和乙酸钠/乙醇沉淀纯化。

根据制造商的说明书，使用Clontech Advantage HF 2 PCR试剂盒(Clontech)填充片段末端并且然后使用最外侧的正向和反向引物扩增片段。为了填补末端，使用以下PCR：35个循环的94℃的变性步骤15秒，将温度在7分钟内缓降至55℃的缓慢退火步骤并且然后在55℃下保持2分钟和72℃的延伸步骤6分钟。然后进行在72℃下的最终延伸步骤7分钟。用于扩增片段的第二次PCR包括：在94℃下的初始变性步骤30秒，接着是在94℃15秒、在55℃30秒、在68℃1分钟的25个循环和在68℃3分钟的最终延伸步骤。

然后片段通过凝胶电泳被纯化、消化并连接到相关载体中。用连接混合物转化大肠杆菌之后，对多个菌落进行少量制备并对插入片段测序。有时不可能分离具有完全正确的序列的克隆。在这些情况下，通过单次或多次定点诱变来修复错误。

5.8定点诱变

根据制造商的说明书，使用Quikchange II定点诱变试剂盒或Quikchange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla CA)，用合适的PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯化的引物进行诱变。

用于接种疫苗的所有质粒在大肠杆菌菌株DH5α中生长，并使用Nucleobond MaxiKit(Machery-Nagal)纯化。通过分光光度法在260nm处定量DNA浓度。

实施例3

HSV gD2 DNA疫苗的毒性

进行了一项临床研究，以检查向健康HSV血清阴性受试者皮内注射递增剂量的HSVDNA疫苗(COR-1)的安全性和耐受性。此外，为了确定COR-1是否会诱导抗gD2特异性抗体，并提供可能引起COR-1诱导有效的免疫应答以保护免受将来的HSV感染的优化剂量的预测的信息。最后，下面描述的实验的目的是确定抗gD2抗体是否是中和性的以及COR-1是否会诱导细胞介导的免疫(CMI)反应。

材料和方法

5.9临床研究方法

受试者被分配到以下剂量组之一：

接受10μg COR-1的4名受试者-3x10μg注射，总暴露量为30μg；

接受30μg COR-1的4名受试者-3x30μg注射，总暴露量为90μg；

接受100μg COR-1的4名受试者-3x100μg，总暴露量为300μg；和

接受300μg COR-1的4名受试者-3x300μg注射，总暴露量为900μg；

接受1mg COR-1的4名受试者-6x500mg注射，总暴露量为3mg。

COR-1疫苗(批号：COR-1.12.NO13)在第0天、第21天和第42天通过皮内注射被施用于受试者的前臂。所有受试者均为年龄在18至45岁之间并且总体健康的HSV-1和-2血清阴性的男性或非怀孕非哺乳的女性。本研究登记了20名受试者，并且每个治疗组分配4名受试者。第一次注射后两名受试者退出研究，一名在10μgCOR-1组中(撤回同意)并且另一名在1mg组中(由于无法遵守方案而退出)。然后登记了两名替换受试者并分配到这些组(总共n＝22)。总共20名受试者按计划完成了研究，即，每个治疗组4名。没有受试者由于不良反应(adverse effects)(AE)从研究中退出。

所有AE和严重AE(serious AE)(SAE)均根据FDA Guidance for Industry(2007):Toxicity Grading Scale for Healthy Adults and Adolescent Volunteers Enrolledin Preventative Vaccine Clinical Trials被评估。

实施例3

分析在第0、21和42天的每次接种前的60分钟内和最后一次研究访视(第63天)时收集的血清样品中抗HSV gD2抗体和中和性抗HSV gD2抗体的存在。

硬结经常被报告，在接种阶段的某一时刻发生在每个治疗组的至少一名受试者中。

与较低剂量治疗组相比，1mg COR-1治疗组中硬结的发生率趋于较高。在该组中，在每次接种后45分钟至两天观察到硬结。其他治疗组中硬结的发生趋于更散发，并且没有在每次接种后的所有时间点被报告。在所有治疗组中，报告的任何硬结在三周后的下次访视时已经消退。

所有注射部位反应被分类为轻度强度。

实施例4

HSV细胞介导的免疫

使用酶联免疫斑点(Enzyme Linked ImmunoSPOT)(ELISPOT)测定，通过测量外周血单核细胞(PBMC)中的IFN-γ产生来评估针对11组重叠HSV特异性肽的T细胞应答。在ELISPOT结果中没有观察到剂量相关的趋势。

在按计划完成研究的20名受试者中的19名的PBMC中诱导了IFN-γ产生。因此，观察到针对COR-1疫苗的清晰和实质的细胞免疫应答。所有治疗组的应答率相似，10μg、30μg、300μg和1mg组中100％受试者对COR-1疫苗有反应和100μg组中75％有反应。

对于意向治疗(Intent To Treat)(ITT)人群，10μg组中的一名受试者和1mg组中的一名受试者对COR-1疫苗没有反应。这些受试者过早从研究中退出并且仅接受一次接种。

在测试非特异性DNA反应性的阴性对照(数据未提供)中没有观察到细胞反应，提供观察到的细胞反应是对HSV gD2特异性的支持证据。

材料和方法

HSV gD2IFN-γELISPOT

将ELISPOT平板用捕获抗体包被。这包括在新鲜制备和过滤的0.1M NaHCO₃(pH8.2-8.6)中稀释捕获mAb(1-DK)至5μg/mL，向每个孔中加入75μL稀释的捕获Ab并且然后4°下过夜孵育平板(用箔覆盖)。用每个孔200μL完全Roswell Park Memorial Institute培养基(cRPML)清洗板。然后加入200μL/孔的cRPML中的10％FCS(用0.2μm过滤器过滤)，并将板在室温下温育(箔覆盖)2小时。

当板在被封闭时，制备人PBMC。将PBMC在37°水浴中解冻并转移到50mL管中。将10mL具有10％FCS的预热的cRPMI加入到解冻的PBMC中，并以1200rpm离心5分钟。将PBMC在10mL预热的cRPMI中洗涤，然后以1200rpm旋转5分钟。弃去上清液，将沉淀重新悬浮于2mL10％FCS cRPML中。用台盼蓝染色细胞样品并在血细胞计数器上计数。将细胞悬浮液调整为1x10⁶细胞/毫升的浓度。

从板上除去封闭溶液并用cRPMI洗涤孔。每毫升PMBC加入20μL的IL-12(cRPMI中1μg/mL)。每毫升PBMC加入200μg肽。向各孔中加入100μL的PBMC(1x10⁵/100μL)和100μL的肽溶液。使用汇集的重叠gD2肽(由Mimotope合成)。用箔覆盖板，并在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育过夜。到目前为止，实验在无菌条件下进行，这之后无菌条件不再必需。

将平板用PBS-T(在PBS中0.02％Tween-20)洗涤6次。在含有0.5％FCS的PBS-T中，将生物素化检测mAb(7-B6-1)稀释至1μg/mL。将75μL加入到每个孔中，并将板(箔覆盖)在室温下孵育2-4小时。然后将板用PBS-T洗涤6次。在含有0.5％FCS的PBS-T中，将链霉亲和素-HRP(1mg/mL原液)以1:400稀释，并每孔加入75μL。将板在室温下孵育(箔覆盖)1小时。将板用PBS-T洗涤三次，然后用仅PBS洗涤三次。

根据制造商的说明书制备DAB底物溶液(Sigma)。向每个孔中加入75μL底物。将板在自来水中洗涤六次以停止显色。移除后盖以允许冲洗孔的底侧。将板过夜干燥并储存在黑暗中。

实施例5

迟发型超敏反应应答

对于每种疫苗剂量，在每次注射后立即、45分钟、24小时和48小时拍摄皮内注射部位(参见，图2-6)。这些照片用于评估注射部位反应。

对从每次接种后一天和两天拍摄的照片观察红斑的大小的分析。应该注意的是，虽然照片不是为了这个特定目的拍摄的，但是除了3张照片之外，所有照片中都包含纸尺。该分析的结果详述于表5。

事后分析揭示，在较高的疫苗剂量下，与在第一天观察到的红斑大小相比，第二天的红斑大小增加。与较低剂量治疗组相比，100μg、300μg和1mg COR-1治疗组的红斑发生率趋于较大。在这些组中，在每次接种后45分钟至两天观察到红斑。在10μg和30μg COR-1组中红斑的发生趋于更散发，并且没有在每次接种后的所有时间点被报告。在10μg剂量治疗组中无可测量的红斑。在所有治疗组中，报告的任何红斑在三周后的下次访视时已经消退。

该结果指示迟发型超敏反应(DTH)反应，其是细胞介导的免疫应答而不是抗体介导的应答。因此，这与缺乏抗体应答的观察结果并非不一致。

照片的分析也显示了剂量反应，观察到的红斑大小随着疫苗剂量的增加而增加。

本文引用的每个专利、专利申请和公布的公开内容特此通过引用整体并入本文。

本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认这类参考文献作为本申请的“现有技术”可用。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，可在所示例的具体实施方案中做出各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。所有这类修改和改变都旨在被包括在所附权利要求的范围内。

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序列表

<110> 阿德梅杜斯疫苗有限公司

<120> 治疗方法

<130> 35240711

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 单纯疱疹病毒2

<400> 1

atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc 60

cgcgtcgtct gcgccaaata cgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat 120

cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag 180

cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc 240

actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg 300

gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg 360

accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac 420

accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg 480

agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc 540

cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag 600

atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg 660

cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac 720

agcatcggga tgctaccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc 780

ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg 840

gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac 900

tcggccctct tagaggatcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac 960

atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc 1020

ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggtgc tggtcatcgg cggtattgcg 1080

ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg 1140

gatgacgacg cgcccccctc gcaccagcca ttgttttact ag 1182

<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒2

<400> 2

Met Gly Arg Leu Thr Ser Gly Val Gly Thr Ala Ala Leu Leu Val Val

1 5 10 15

Ala Val Gly Leu Arg Val Val Cys Ala Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro

20 25 30

Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro

35 40 45

Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Lys Arg Val Tyr His

50 55 60

Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu

85 90 95

His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu

100 105 110

Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly

115 120 125

Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro

130 135 140

Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe

165 170 175

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu

180 185 190

Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His

195 200 205

Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro

210 215 220

Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp

225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

245 250 255

Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Pro Pro

260 265 270

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala

275 280 285

Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

290 295 300

Glu Asp Pro Ala Gly Thr Val Ser Ser Gln Ile Pro Pro Asn Trp His

305 310 315 320

Ile Pro Ser Ile Gln Asp Val Ala Pro His His Ala Pro Ala Ala Pro

325 330 335

Ser Asn Pro Gly Leu Ile Ile Gly Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Ala

340 345 350

Val Leu Val Ile Gly Gly Ile Ala Phe Trp Val Arg Arg Arg Ala Gln

355 360 365

Met Ala Pro Lys Arg Leu Arg Leu Pro His Ile Arg Asp Asp Asp Ala

370 375 380

Pro Pro Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr

385 390

<210> 3

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组体

<400> 3

aagcttgccg ccaccatggg acgtctgacg tcgggagtcg gaacggctgc tctgctggtc 60

gtcgctgtgg gactgcgcgt cgtctgcgct aaatacgctc tggctgaccc ctcgctgaag 120

atggctgatc ccaatcgatt tcgcggaaag aacctgcccg tcctggacca gctgacggac 180

ccccccggag tgaagcgtgt ctaccacatc cagccctcgc tggaagaccc ctttcagccc 240

ccctcgatcc ccatcacggt gtactacgct gtgctggaac gtgcttgccg ctcggtgctg 300

ctgcatgctc cctcggaagc tccccagatc gtgcgcggag cttcggacga agctcgaaag 360

cacacgtaca acctgacgat cgcttggtat cgcatgggag acaattgcgc tatccccatc 420

acggtcatgg aatacacgga atgcccctac aacaagtcgc tgggagtctg ccccatccga 480

acgcagcccc gctggtcgta ctatgactcg ttttcggctg tctcggaaga taacctggga 540

tttctgatgc acgctcccgc ttttgaaacg gctggaacgt acctgcgact ggtgaagatc 600

aacgactgga cggaaatcac gcaatttatc ctggaacacc gagctcgcgc ttcgtgcaag 660

tacgctctgc ccctgcgcat cccccccgct gcttgcctga cgtcgaaggc ttaccaacag 720

ggagtgacgg tcgactcgat cggaatgctg ccccgcttta tccccgaaaa ccagcgcacg 780

gtcgctctgt actcgctgaa aatcgctgga tggcacggac ccaagccccc ctacacgtcg 840

acgctgctgc cccccgaact gtcggacacg acgaacgcta cgcaacccga actggtcccc 900

gaagaccccg aagactcggc tctgctggaa gatcccgctg gaacggtgtc gtcgcagatc 960

ccccccaact ggcacatccc ctcgatccag gacgtcgctc cccaccacgc tcccgctgct 1020

ccctcgaacc ccggactgat catcggagct ctggctggat cgacgctggc tgtgctggtc 1080

atcggaggaa tcgctttttg ggtccgccgc cgcgctcaga tggctcccaa gcgcctgcgt 1140

ctgccccaca tccgagatga cgacgctccc ccctcgcacc agcccctgtt ttactagctc 1200

gag 1203

<210> 4

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组体

<400> 4

aagcttgccg ccaccatgca gatctttgtg aagacgctga cgggaaagac gatcacgctg 60

gaagtggaac cctcggacac gatcgaaaac gtgaaggcta agatccagga caaggaagga 120

atcccccccg accagcagag actgatcttt gctggaaagc agctggaaga cggacgcacg 180

ctgtcggact acaacatcca gaaggaatcg acgctgcacc tggtgctgag actgcgcgga 240

gctgctaaat acgctctggc tgacccctcg cttaagatgg ctgatcccaa tcgatttcgc 300

ggaaagaacc tgcccgtcct ggaccagctg acggaccccc ccggagtgaa gcgtgtctac 360

cacatccagc cctcgctgga agaccccttt cagcccccct cgatccccat cacggtgtac 420

tacgctgtgc tggaacgtgc ttgccgctcg gtgctgctgc atgctccctc ggaagctccc 480

cagatcgtgc gcggagcttc ggacgaagct cgaaagcaca cgtacaacct gacgatcgct 540

tggtatcgca tgggagacaa ttgcgctatc cccatcacgg tcatggaata cacggaatgc 600

ccctacaaca agtcgctggg agtctgcccc atccgaacgc agccccgctg gtcgtactat 660

gactcgtttt cggctgtctc ggaagataac ctgggatttc tgatgcacgc tcccgctttt 720

gaaacggctg gaacgtacct gcgactggtg aagatcaacg actggacgga aatcacgcaa 780

tttatcctgg aacaccgagc tcgcgcttcg tgcaagtacg ctctgcccct gcgcatcccc 840

cccgctgctt gcctgacgtc gaaggcttac caacagggag tgacggtcga ctcgatcgga 900

atgctgcccc gctttatccc cgaaaaccag cgcacggtcg ctctgtactc gctgaaaatc 960

gctggatggc acggacccaa gcccccctac acgtcgacgc tgctgccccc cgaactgtcg 1020

gacacgacga acgctacgca acccgaactg gtccccgaag accccgaaga ctcggctctg 1080

ctggaagatc ccgctggaac ggtgtcgtcg cagatccccc ccaactggca catcccctcg 1140

atccaggacg tcgctcccca ccactagctc gag 1173

Claims (26)

1.一种治疗受试者中的单纯疱疹病毒(HSV)感染的方法，所述方法包括同时向所述受试者施用有效量的包含第一构建体和第二构建体的构建体系统，其中所述第一构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列中的所述选定密码子而区别于所述野生型HSV gD2编码序列的第一合成编码序列，其中所述密码子替换选自表1，其中所述第一合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中所述第一合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列，并且其中所述第二构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列中的所述选定密码子而区别于所述野生型HSV gD2编码序列的第二合成编码序列，其中所述密码子替换选自表1，其中所述第二合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中所述第二合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列和编码通过I类主要组织相容性(MHC)途径增加多肽的加工和呈递的蛋白质去稳定元件的核酸序列，其中表1如下：

表1

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在同时施用所述第一构建体和所述第二构建体之前鉴定所述受试者具有HSV-2感染。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质去稳定元件选自由在多肽的氨基末端的去稳定氨基酸、PEST序列和泛素分子组成的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质去稳定元件是泛素分子。

5.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列包含SEQ IDNO：3列出的多核苷酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第二合成编码序列包含SEQ IDNO：4列出的多核苷酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一构建体和所述第二构建体被包含在一种或更多种表达载体中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表达载体不含信号或靶向序列。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述表达载体不包括抗生素抗性标记物。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述表达载体是NTC8485或NTC8685。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的至少75％是选自表1的同义密码子。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的至少80％是选自表1的同义密码子。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的至少85％是选自表1的同义密码子。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的至少90％是选自表1的同义密码子。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的至少95％是选自表1的同义密码子。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述第一合成编码序列和所述第二合成编码序列中的密码子的约98％或更多是选自表1的同义密码子。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述组合物用药学上可接受的载体或赋形剂配制。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂一起被施用。

19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述组合物无佐剂地被施用。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制成用于皮内施用。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中每剂量施用约30μg和约1000μg之间的合成构建体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中多个剂量作为治疗方案的部分被施用。

24.根据权利要求23所述的方法，其中每天、每周、每两周、每月、每两个月或其间的任何时间施用剂量。

25.构建体系统用于治疗受试者中的HSV-2感染的用途，其中所述构建体系统包含第一构建体和第二构建体，其中所述第一构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答偏好的同义密码子替换野生型HSVgD2编码序列中的所述选定密码子而区别于所述野生型HSV gD2编码序列的第一合成编码序列，其中密码子替换选自表1，其中所述第一合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中所述第一合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列，并且其中所述第二构建体包含通过用具有比选定密码子更高的免疫应答偏好的同义密码子替换野生型HSV gD2编码序列中的所述选定密码子而区别于所述野生型HSV gD2编码序列的第二合成编码序列，其中密码子替换选自表1，其中所述第一合成编码序列的密码子的至少70％是根据表1的同义密码子，并且其中所述第二合成编码序列可操作地连接到调控核酸序列和编码通过I类主要组织相容性(MHC)途径增加多肽的加工和呈递的蛋白质去稳定元件的核酸序列。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述构建体系统被制备或制造为用于该目的的药物。