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CN106866902A - 一种可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的制备方法与应用 - Google Patents

一种可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的制备方法与应用 Download PDF

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CN106866902A
CN106866902A CN201710019366.7A CN201710019366A CN106866902A CN 106866902 A CN106866902 A CN 106866902A CN 201710019366 A CN201710019366 A CN 201710019366A CN 106866902 A CN106866902 A CN 106866902A
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章莉娟
熊迪
张晓芳
张冉
彭诗元
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South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
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Abstract

一种可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的制备方法与应用。本发明属于生物医用高分子聚合物有机/无机复合材料领域，公开了一种主链中含有二硫键节点的两亲性可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的制备方法与在CT成像和药物递释领域中的应用。本发明两亲性可降解双响应聚合物具体为聚己内酯‑SS‑聚甲基丙烯酸N,N‑二甲氨基乙酯，将其命名为PCL‑SS‑PDMAEMA，具体如下式(一)所示结构：其中，x＝40～60，y＝40～70。本发明还提供基于上述聚合物的胶束系统及负载金纳米颗粒的聚合物胶束体系，应用于CT成像、药物递释领域及负载水难溶性药物，实现不同的生理环境中药物的可控及快速释放，实现药物化疗过程可视化，显著的提高药物递释效率和靶向性。

Description

一种可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的 制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子聚合物有机/无机复合材料领域，特别涉及一种主链中含有二硫键节点的两亲性可降解双响应聚合物及其负载药物和金纳米粒子胶束的制备方法与在CT成像和药物递释领域中的应用。
背景技术
肿瘤的药物化疗一直以来都是人们研究的重点，其中基于纳米聚合物胶束为载体的诊疗一体化体系，即诊断-治疗一体化系统，为高效的肿瘤可视化靶向化疗提供了强有力的手段。
研究表明载药聚合物胶束在肿瘤细胞内部的药物释放非常缓慢，这导致了细胞内部药物浓度低下，不利于克服肿瘤细胞的多抗药性，从而导致了肿瘤治疗效率低下。当药物载体在肿瘤细胞内部较快的释放药物并能在短时间内积累较高浓度的药物分子则可以有效克服肿瘤细胞的多抗药性，进而杀死肿瘤细胞。基于这种目的，多刺激响应可降解聚合物胶束则能很好的实现聚合物在肿瘤细胞内部微环境中药物的快速释放并在短时间内积累高浓度的药物分子。刺激响应聚合物能对外部刺激如pH、还原电势、光、超声等进行智能响应，实现自组装胶束微观结构的失稳甚至解体(降解)等，明显提升胶束内核药物的释放速率。基于肿瘤组织和正常组织微环境中的谷胱甘肽(GSH)浓度的显著差异，这种特异性差异性可以很好的应用到智能刺激响应可降解胶束药物递释体系的研究中，将二硫键引入到聚合物胶束结构中，使其在正常生理环境中结构保持稳定，而在肿瘤细胞内部的强还原性(即高GSH浓度)条件下断裂，引起胶束结构失稳解体(降解)，进而有效的控制和促进药物在肿瘤细胞内药物的快速释放和高浓度积累，克服多抗药性，实现较高的肿瘤化疗效果。
另外，在较高的药物化疗效果的同时，若能将肿瘤部位进行可视化治疗，即实现肿瘤组织部位的成像，则化疗的准确性和靶向性将进一步提高。常用的肿瘤部位成像技术有MRI、超声、CT等。其中，金纳米颗粒在量子尺寸效应和表面效应方面较其他的金属粒子有独特的优势，而且可以在肿瘤部位富集，在CT成像用于肿瘤部位的可视化治疗和诊断领域有着重要的应用价值。然而，在一般的制备纳米金粒子的过程中，小分子硫化物作为稳定剂，硼氢化钠作为还原剂，这样会产生小分子副产物，而且得到的金纳米粒子不稳定，这样就限制了金纳米颗粒在CT成像技术中的应用。Armes等合成了PMPC-b-PDMAEMA两嵌段聚合物，在不添加任何其它还原剂时，PDMA可以原位还原AuCl4-生成金纳米粒子，并能很好的稳定纳米金颗粒(Langmuir,2006,22,11022-11027)。
同时负载抗癌疏水药物和金纳米粒子刺激响应型胶束系统，可以将胞内药物的快速释放和CT可视化成像两种手段结合起来。在正常生理环境中，胶束体系保持良好的稳定性，药物释放缓慢，而在肿瘤细胞内部的高GSH浓度条件下，药物得到快速释放。同时，胶束负载的金纳米粒子用于CT成像，从而极大的实现胶束药物载体在肿瘤化疗过程中的靶向性和高效性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，明显提高载药胶束用于肿瘤化疗的高效性和靶向性，本发明的首要目的在于提供一种主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物，具体为聚己内酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯。
本发明另一目的在于提供上述可降解双响应聚合物的制备方法。本发明方法先利用小分子引发剂2-羟乙基-2’-(异丁酰溴)乙基二硫醚(HO-SS-iBuBr)引发己内酯开环聚合物得到大分子引发剂PCL-SS-iBuBr，然后利用大分子引发剂PCL-SS-iBuBr引发甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)进行电子转移活化再生原子转移自由基聚合反应(ARGETATRP)，得到亲疏水嵌段之间含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物，聚己内酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，即PCL-SS-PDMAEMA。
本发明的另一目的在于提供一种基于上述可降解双响应聚合物的聚合物胶束系统。两亲性嵌段聚合物溶于有机溶剂中可制备得到内核嵌段疏水，外壳嵌段亲水，亲疏水嵌段之间含有二硫键节点的聚合物胶束系统。
本发明再一目的在于提供一种基于上述可降解双响应聚合物的负载金纳米粒子的胶束系统。
本发明再一目的在于提供上述负载金纳米粒子的胶束系统在CT成像和药物递释领域中的应用。氯金酸(HAuCl4)加入到聚合物胶束溶液中后，胶束中的亲水嵌段PDMAEMA可以原位还原AuCl4 -生成金纳米粒子，并能很好的稳定金纳米粒子颗粒。这种聚合物胶束载金系统可以用于CT成像，以实现化疗过程的可视化，极大的提高了聚合物胶束药物递释系统的靶向性。
本发明的再一目的在于提供上述负载金纳米粒子的胶束系统在负载水难溶性药物方面的应用，尤其是对水难溶性抗肿瘤药物，如阿霉素的负载。在正常生理环境中，胶束结构保持稳定，内核药物释放缓慢；在载药胶束系统到达肿瘤细胞内部后，胶束亲疏水嵌段间的二硫键节点在胞内较高浓度的GSH作用下断裂，胶束亲水外壳从疏水内核上脱落，进而导致了胶束结构失稳解体，药物释放明显加快。这种还原响应降解的聚合物胶束纳米药物载体可以显著的增强聚合物胶束系统在肿瘤细胞内的药物释放速率，进而实现高效的肿瘤药物化疗效率。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物，具体为聚己内酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，将其命名为PCL-SS-PDMAEMA，具体如下式(一)所示结构：
其中，x＝40～60，y＝40～70。
优选的，本发明中的两亲性嵌段聚合物的数均分子量为11082～22008g/mol。
本发明提供一种上述两亲性嵌段聚合物的制备方法，包括以下两个步骤：
(1)制备聚己内酯ATRP大分子引发剂PCL-SS-iBuBr：将小分子引发剂HO-SS-iBuBr、ε-己内酯(ε-CL)和催化剂混合，加热反应，得到大分子引发剂PCL-SS-iBuBr。
(2)制备两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA：将步骤(1)制备的大分子引发剂PCL-SS-iBuBr，甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)和催化剂加入到溶剂中，搅拌均匀，加入还原剂，加热反应，得到两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA。
所述步骤(1)中反应物摩尔份数的配方如下：
HO-SS-iBuBr 1份；ε-CL 40～60份；
所述步骤(2)中反应物摩尔份数的配方如下：
大分子引发剂PCL-SS-iBuBr 1份；DMAEMA 40～70份；HMTETA 1～2份。
步骤(1)中所述的加热反应优选指加热到110～135℃反应24～48h。
步骤(1)中所述的催化剂采用本领域常用的催化剂即可，如为Sn(Oct)2，其用量为催化量即可，优选为0.02～0.12摩尔份。
步骤(2)中所述的加热反应优选指加热到60～90℃反应8～16h。
步骤(2)中所述的溶剂为本领域常用的溶剂，如甲苯。
步骤(2)中所述的催化剂为本领域常用的催化剂，如CuBr2，用量为催化量即可，优选为0.1～0.2摩尔份。
所述的还原剂为本领域常用的还原剂，如Sn(Oct)2，用量优选为1～2摩尔份。
优选的，步骤(1)反应结束后，将反应体系稀释、沉淀并干燥，得到纯化后的产物。所述的稀释指将反应后的溶液旋蒸浓缩，再用四氢呋喃稀释；沉淀指的是将上述的四氢呋喃溶液加入到10倍的0℃混合溶剂甲醇/水(体积比1/1)沉淀；干燥指的是将沉淀出的产物至于40℃的真空干燥箱中真空干燥24h。
优选的，步骤(2)反应完成后，将反应溶液冷却、稀释、沉淀、干燥，最后得到纯化后的产物。所述的冷却和稀释指的是将反应后的溶液冷却后用四氢呋喃稀释，至于空气中过夜，然后将溶液通过氧化铝出去催化剂；沉淀指的是将将旋蒸后的浓缩液滴入到0℃的乙醚中；干燥指的是将沉淀出的产物至于40℃的真空干燥箱中真空干燥24h。
优选地，所述的步骤(1)和步骤(2)均在惰性气体氩气的保护和无水条件下进行。
本发明提供了一种基于上述两亲性嵌段聚合物的聚合物胶束系统。
上述基于本发明两亲性嵌段聚合物的聚合物胶束系统，通过包括以下步骤方法制备得到：将本发明的两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA溶于溶剂中，用去离子水透析，优选为24h，得到两亲性嵌段聚合物胶束体系。
优选的，上述溶剂指的是本领域最为常见的溶剂，如DMSO。
本发明还提供了一种基于上述可降解双响应聚合物的负载金纳米粒子的胶束系统，其通过包括以下步骤方法制备得到：将上述可降解双响应聚合物溶于溶剂中，透析，优选为24h，再加入氯金酸(HAuCl4)，室温下避光搅拌，优选48h，得到负载金纳米粒子的胶束体系。
本发明还提供上述负载金纳米粒子的胶束系统在CT成像和药物递释领域中的应用。氯金酸(HAuCl4)加入到聚合物胶束溶液中后，胶束中的亲水嵌段PDMAEMA可以原位还原AuCl4 -生成金纳米粒子，并能很好的稳定金纳米粒子颗粒。这种聚合物胶束载金系统可以用于CT成像，以实现化疗过程的可视化，极大的提高了聚合物胶束药物递释系统的靶向性。
本发明还提供上述负载金纳米粒子的胶束系统在负载水难溶性药物方面的应用，具体包括以下步骤：
将上述负载金纳米粒子的胶束系统冷冻干燥后，再和水难溶性药物溶解于溶剂中，室温搅拌，优选为12h，透析，优选用去离子水透析24h，得到包载水难溶性药物的聚合物胶束体系。
优选的，上述的冷冻干燥指的是-50℃，0.06mbar条件下将聚合物胶束系统的溶液冻干。
优选的，上述的水难溶性药物可为常见的抗癌药物阿霉素。
优选的，上述的溶剂指的是本领域常用的有机溶剂，如DMSO。
上述的包载水难溶性药物和金纳米粒子的聚合物胶束体系可以在正常生理环境中保持结构稳定，有效包载水难溶性药物，并且防止金纳米颗粒的团聚；而在肿瘤细胞内部的强还原性环境中(10mM GSH)，则能快速实现胶束的降解，实现包载水难溶性药物的快速可控释放。另外，负载的金纳米颗粒用于CT成像，使得肿瘤组织化疗过程的可视化。
本发明的机理为：
本发明首先利用双官能团小分子引发剂HO-SS-iBuBr引发己内酯单体(ε-CL)发生开环聚合，得到大分子引发剂PCL-SS-iBuBr，然后对亲水性单体甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)进行自由基聚合物，得到主链中含有二硫键节点的两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA。将此两亲性嵌段聚合物溶于溶剂中得到两亲性嵌段聚合物胶束系统。向上述两亲性嵌段聚合物胶束系统中加入氯金酸，利用亲水嵌段PDMAEMA的还原性原位还原氯金酸得到粒径分布均匀的金纳米颗粒，并且PDMAEMA可以稳定得到的金纳米颗粒使其具有良好的稳定性而不发生团聚；最终得到了负载金纳米颗粒的聚合物胶束体系。将此负载金纳米颗粒的胶束体系冻干后，和水难溶性抗癌药物阿霉素溶解于溶剂中，得到了内核组成为疏水嵌段PCL，外壳组成为亲水嵌段PDMAEMA的两亲性聚合物胶束，胶束内核PCL可以对水难溶性药物阿霉素进行有效的负载，外壳PDMAEMA稳定金纳米颗粒，最终得到内核负载阿霉素外壳负载金纳米颗粒的聚合物载药载金胶束体系。胶束主链结构上的二硫键节点则提供了可还原响应断裂的位点，以智能响应肿瘤细胞内部的刺激而降解。这种胶束体系在正常生理环境中保持良好的稳定性，而在进入肿瘤细胞内部后，则在前还原性(10mM GSH)环境中，胶束结构上的二硫键断裂，进而引起胶束结构的解体，抗癌药物阿霉素得到快速释放，同时负载的金纳米颗粒用于CT成像，将肿瘤化疗过程可视化，为抗肿瘤化疗过程中药物递释的高效性和化疗过程的可视化提供了有价值的制备方法和技术，最终提高了肿瘤药物化疗的效率和靶向性。
本发明相对于现有的技术，具有以下优点和有益的效果：
(1)本发明制备方法简单，技术操作可行，制备条件温和，而且嵌段聚合物各嵌段分子量便于调控，以利于制备负载水难溶性药物和金纳米粒子胶束体系，满足胶束药物递释系统的诊疗一体化要求。
(2)本发明制备的两亲性可降解聚合物胶束系统，具有较高的药物和金纳米粒子包载能力。
(3)本发明制备得到的两亲性可降解聚合物载药载金聚合物胶束系统，可以实现在不同的生理环境中药物的可控及快速释放，并且利用CT成像使得药物化疗过程可视化，可以显著的提高药物递释效率和靶向性，为诊疗一体化药物递释系统提供了有参考价值的方法。
附图说明
图1为实施例1中主链含有二硫键的大分子引发剂PCL-SS-iBuBr的核磁氢谱。
图2为实施例1中主链含有二硫键的大分子引发剂PCL-SS-iBuBr的GPC洗脱曲线。
图3为实施例4中两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA的核磁氢谱。
图4为实施例4中两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA的GPC洗脱曲线。
图5为实施例7中两亲性嵌段聚合物胶束的DLS图。
图6为实施例7中两亲性嵌段聚合物胶束的TEM图。
图7为实施例8中载金聚合物胶束的DLS图。
图8为实施例8中载金聚合物胶束的TEM图。
图9为实施例8中载金聚合物胶束的UV-vis谱图。
图10为实施例8中载金聚合物胶束的XRD谱图。
图11为实施例9中载药/载金聚合物胶束的DLS图。
图12为实施例9中载药/载金聚合物胶束的载药量和包封率图。
图13为实施例10中载药/载金聚合物胶束的在不同pH和GSH浓度条件下粒径分布图。
图14为实施例11中载药/载金聚合物胶束的在不同pH和GSH浓度条件下药物释放曲线。
图15为实施例12载金聚合物胶束的细胞毒性效果图。
图16为实施例12中载药/载金聚合物胶束的细胞毒性效果图。
图17为实施例13中载药/载金聚合物胶束X-射线衍射效果图。
图18为实施例14中载药/载金聚合物胶束体外细胞CT成像效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1：大分子引发剂PCL-SS-iBuBr制备(x＝40)
将含有搅拌子的100mL干燥反应瓶用酒精灯烘烤5min，再将引发剂HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反应瓶中，滴加入Sn(Oct)2(16.2mg，0.04mmol)。密封后抽真空-通氩气3次，在氩气保护下加入单体ε-CL(4.56g，40mmol)，用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下置于135℃油浴中加热反应48h后，用液氮冷却终止反应，并且用50mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加搅拌子搅拌)沉淀，抽滤得到固体，40℃真空干燥12h。合成反应式见公式(1)。利用核磁和GPC对分子结构和组成进行分析，结果见图1和图2，Mn＝4794g/mol，Mw/Mn＝1.47。
实施例2：大分子引发剂PCL-SS-iBuBr制备(x＝50)
将含有搅拌子的100mL干燥反应瓶用酒精灯烘烤5min，再将引发剂HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反应瓶中，滴加入Sn(Oct)2(48.6mg，0.12mmol)。密封后抽真空-通氩气3次，在氩气保护下加入单体ε-CL(5.7g，50mmol)，用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下置于110℃油浴中加热反应36h后，用液氮冷却终止反应，并且用40mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加搅拌子搅拌)沉淀，抽滤得到固体，40℃真空干燥24h。Mn＝5934g/mol，Mw/Mn＝1.40。
实施例3：大分子引发剂PCL-SS-iBuBr制备(x＝60)
将含有搅拌子的50mL干燥反应瓶用酒精灯烘烤5min，再将引发剂HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反应瓶中，滴加入Sn(Oct)2(8.1mg，0.02mmol)。密封后抽真空-通氩气3次，在氩气保护下加入单体ε-CL(6.84g，60mmol)，用液氮进行三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下置于120℃油浴中加热反应24h后，用液氮冷却终止反应，并且用60mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加搅拌子搅拌)沉淀，抽滤得到固体，40℃真空干燥24h。Mn＝7074g/mol，Mw/Mn＝1.37。
实施例4：两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制备(x:y＝40:40)
装有搅拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(4794g/mol，0.95g，0.2mmol)，CuBr2(9mg，0.04mmol)于茄形瓶中，密封反应瓶，抽真空-通氮气三次，然后依次将单体DMAEMA(1.26g，8mmol)、无水甲苯、配体HMTETA(110μL，0.4mmol)加入反应瓶中，搅拌10min使得催化剂配合物Cu/HMTETA形成。随后将还原剂Sn(Oct)2(130μL，0.4mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，10min后，转入90℃油浴反应，反应16h后冷却至室温，然后将反应溶液暴露于空气中，加入40mL THF并搅拌溶解，然后过中性氧化铝柱子出去氧化剂。得到的反应液浓缩，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥24h。合成反应式见公式(2)。利用核磁和GPC对分子结构和组成进行分析，结果见图3和图4，Mn＝11082g/mol，Mw/Mn＝1.45。
实施例5：两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制备(x:y＝50:60)
装有搅拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(5934g/mol，1.2g，0.2mmol)，CuBr2(4.5mg，0.02mmol)于茄形瓶中，密封反应瓶，抽真空-通氮气三次，然后依次将单体DMAEMA(1.89g，12mmol)、无水甲苯、配体HMTETA(55μL，0.2mmol)加入反应瓶中，搅拌10min使得催化剂配合物Cu/HMTETA形成。随后将还原剂Sn(Oct)2(65μL，0.2mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，10min后，转入60℃油浴反应，反应8h后冷却至室温，然后将反应溶液暴露于空气中，加入40mL THF并搅拌溶解，然后过中性氧化铝柱子出去氧化剂。得到的反应液浓缩，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥12h。Mn＝15366g/mol，Mw/Mn＝1.57。
实施例6：两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制备(x:y＝60:70)
装有搅拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(7074g/mol，1.4g，0.2mmol)，CuBr2(6.75mg，0.03mmol)于茄形瓶中，密封反应瓶，抽真空-通氮气三次，然后依次将单体DMAEMA(2.2g，14mmol)、无水甲苯、配体HMTETA(82.5μL，0.3mmol)加入反应瓶中，搅拌10min使得催化剂配合物Cu/HMTETA形成。随后将还原剂Sn(Oct)2(97.5μL，0.3mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，10min后，转入80℃油浴反应，反应12h后冷却至室温，然后将反应溶液暴露于空气中，加入50mL THF并搅拌溶解，然后过中性氧化铝柱子出去氧化剂。得到的反应液浓缩，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥12h。Mn＝22008g/mol，Mw/Mn＝1.33。
实施例7：两亲性嵌段聚合物胶束的制备
采用透析法制备PCL-SS-PDMAEMA嵌段聚合物胶束。将两亲性嵌段聚合物溶于DMSO中搅拌6h后，转入透析(Mw＝3500Da)中用去离子水透析24h，每2h换一次水，最后通过0.45μm滤膜过滤后冻干。
图5和图6分别为聚合物胶束的DLS和TEM图，聚合物胶束粒径分布在149nm左右，TEM图显示了粒径分布均匀，约为90nm左右。
实施例8：载金聚合物胶束的制备
室温下，将HAuCl4滴入到实施例7中得到的聚合物胶束溶液中，避光搅拌48h，待反应结束后通过0.45μm滤膜过滤后冻干。
图7为载金聚合物胶束的DLS图，聚合物胶束粒径分布在166nm左右，图8为载金聚合物胶束的TEM图，显示了纳米金颗粒的分布较为均匀(约为9nm左右)，由于聚合物胶束的组成元素为C、H、O等序数较低原子，相对于Ag的反射信号非常弱，因此，载金聚合物胶束的TEM图中只能看到金纳米颗粒的轮廓而看不到胶束的形貌。图9为载金聚合物胶束溶液的UV-vis谱图，可以看出溶液在528nm处存在最大吸收峰，这是因为球形金纳米颗粒特有的等离子共振吸收峰，说明了金纳米颗粒成功的通过原位还原法制备得到。图10为载金聚合物胶束的XRD表征谱图，在38.5°、44.8°、64.2°和78.0°四处分别对应着金标准衍射图中的(111)、(200)、(220)和(311)四个晶面，这也从另一个方面证明了GNPs的成功合成。
实施例9：载药/载金两亲性聚合物胶束的制备
将载金聚合物胶束和水难溶性药物阿霉素溶于同一溶剂DMSO，搅拌4h后转入透析袋(Mw＝3500Da)中，然后用去离子水(pH7.4)透析12h，每2h换一次水，最后通过0.45μm滤膜过滤后冻干，最终得到载药/载金聚合物胶束。
图11为载药/载金聚合物胶束的DLS图，胶束粒径分布较为均匀，约为192nm，说明负载药物和纳米金颗粒后，胶束依然有良好的形态分布。图12为不同药物投料比例下胶束的载药量和包封率，从图中可以看出，胶束载药量随着投料比例的增大而增大，而药物包封率则在投料比例为1/3时具有最大的药物包封率，约为48.4％。
实施例10：载药/载金聚合物胶束的稳定性测试
取2mL实施例9中制备的载药/载金聚合物胶束溶液(1mg/mL)，室温下，分别将溶液调至不同的环境：(1)pH 7.4，(2)pH 5.0，(3)pH 7.4，10mM GSH，(4)pH 5.0，10mM GSH，用DLS测试12h后胶束的粒径分布变化。
图13为在不同pH及GSH浓度环境中的粒径分布。如图所示，在正常生理环境中(pH7.4)，胶束粒径并未发生明显变化，而在pH 5.0环境中，胶束粒径增大，平均粒径达到254nm，这可能是因为弱酸性条件下胶束外壳PDMAEMA质子化导致胶束的溶胀，进而粒径增大。当10mM还原剂GSH存在时，聚合物胶束发生了明显的聚集，粒径高达1000nm，这说明了细胞内部的高浓度的GSH可以引起胶束结构的失稳降解。这有利于胶束内核药物的快速释放，实现短时间内高浓度药物累积进而克服肿瘤细胞的抗药性，达到较好的肿瘤治疗效果。
实施例11：载药/载金聚合物胶束体外药物释放实验
两亲性嵌段聚合物载药/载金胶束在不同环境中的释放实验通过药物溶出仪测试完成。具体步骤如下：分别取3份3mg实施例9中制备的两亲性嵌段聚合物载药/载金胶束分散于3mL PBS(pH 7.4)、醋酸缓冲液(pH 5.0)、醋酸缓冲液(pH 5.0，10mM GSH)中，并转入透析袋中，置于47mL对应的缓冲液中后，放入药物溶出仪中，在37℃，100rpm转速下进行体外释放，定时取样4mL溶液测试其吸光度，同时补充4mL新鲜缓冲液。利用紫外分光光度计测定不同时间点所取溶液中的阿霉素浓度，绘制阿霉素的体外释放曲线。
图14为不同环境中的36h药物体外释放曲线。从图中可以看出，在正常的生理环境中(pH 7.4)，药物释放非常缓慢，前12h只释放了22.1％的DOX，36h的累积DOX释放量仅为29.9％。这也从侧面说明了负载药物需要克服同疏水内核间的疏水-疏水作用才能顺利释放出来。当pH降低至pH 5.0时，胶束外壳PDMAEMA侧链的叔氨基几乎全部质子化，引起了胶束较大程度的溶胀，疏松的结构引起了DOX的释放加速。这种条件下，12h后的DOX累积释放量相对于pH 7.4的增加了30％，36h增加了43％。在模拟的肿瘤细胞内部弱酸和强还原性的微环境中(pH 5.0，10mM GSH)，DOX几乎呈线性速度快速释放，12h的DOX累积释放量高达78.8％，并在36h后达到了96％。这说明肿瘤细胞内高浓度的GSH破坏了胶束间亲疏水链段间的二硫键节点，PDMAEMA从疏水内核PCL上脱离，造成胶束解体，极大的促进了DOX的释放。
实施例12：细胞毒性测试
以1×104细胞/孔的细胞浓度将100μL HepG2肝癌细胞培养基接种于96孔板中，放置于37℃中，饱和湿度并且含有5％CO2的培养箱中培养24h。再将载金聚合物胶束(实施例8产物)、载药/载金聚合物胶束(实施例9产物)和游离阿霉素用细胞培养基稀释成不同的浓度，加入孔板中进行细胞培养。加入新鲜培养基一组作为对照组。培养48h后，用PBS冲洗细胞，然后分别加入MTT并置于培养箱中培养4h。培养结束后再次用PBS溶液冲洗细胞，然后每个孔中加入DMSO，摇床振荡15min后利用酶标仪测定57nm处每个孔的吸光度OD570。细胞活性计算公式如下：
Cell viability(％)＝(ODtest/ODcontrol)×100％
图15是载金聚合物胶束的细胞毒性测试结果，如图所示，载金聚合物胶束材料细胞毒性较低。在较高浓度时，细胞依然具有高于80％的活性，这说明了载金聚合物胶束具有良好的生物相容性。图16是载药/载金聚合物胶束的细胞毒性测试结果。经过48h的培养后，载药/载金聚合物胶束有着明显的细胞毒性，在较低的浓度(0.01μg/mL)时就对细胞的生长增殖有着显著的抑制作用，并且随着浓度的增大，载药/载金聚合物胶束对HepG2细胞的毒性随之增强，这说明了实施例9中制备的载药/载金聚合物胶束具有优良的抗癌活性。
实施例13：载药/载金聚合物胶束的X-射线衍射实验
载药载金聚合物胶束的X-射线衍射性能测试步骤如下：取实施例9中制备得到的载药/载金聚合物胶束溶于PBS缓冲液中，配置成不同金纳米粒子浓度的溶液，0.01M、0.02M、0.03M、0.06M、0.08M和0.10M各200μL。纳米金溶液于离心管(1.5mL)扫描，测量各浓度下的CT信号值。另外，各金溶液以相同碘浓度的非离子型造影剂欧乃派克(Omnipaque)溶液作为对照。
图17为载药/载金聚合物胶束的X-射线吸收性效果图，测试中HU值表明了X射线穿过物质被吸收后的衰减值，反映了组织的密度，HU值大小也代表了测试材料的CT成像效果。从图中可以看出，X-射线衰减性能(HU值)随着金浓度的增大而逐渐升高，呈线性关系，并且亮度逐渐增强。相比于传统造影剂欧乃派克，实施例9中制备得到的载药/载金聚合物胶束的X-射线衰减性能更强，这有利于其作为良好的CT造影剂并在肿瘤组织处成像的应用。
实施例14：载药/载金聚合物胶束的体外细胞CT成像
将一系列金浓度为0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM的载药/载金聚合物胶束溶液250μL。将HepG2细胞接种于六孔板中，每孔2×106个。培养过夜后除去培养基，加入新鲜培养基3mL和上述复合胶束溶液，继续培养4h。除去培养基，PBS润洗，胰蛋白酶消化，2min后加入DMEM终止消化，离心，除去上层液，再分散于0.2mL PBS溶液中，转入离心管(1.5mL)中，然后CT扫描测试各浓度处理的细胞溶液的X-射线吸收值的高低和成像效果。
图18为载药/载金聚合物胶束的体外细胞CT成像效果图，CT值随着金浓度的增大而升高，并且比欧乃派克的HU值高，这说明了载药/载金聚合物胶束的造影效果较好，是一种潜在的CT成像造影剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物，其特征在于具体为聚己内酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，将其命名为PCL-SS-PDMAEMA，具体如下式(一)所示结构：
其中，x＝40～60，y＝40～70。
2.根据权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物，其特征在于数均分子量为11082～22008g/mol。
3.一种权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物的制备方法，其特征在于包括以下两个步骤：
(1)制备聚己内酯ATRP大分子引发剂PCL-SS-iBuBr：将小分子引发剂HO-SS-iBuBr、ε-己内酯和催化剂混合，加热反应，得到大分子引发剂PCL-SS-iBuBr；
(2)制备两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA：将步骤(1)制备的大分子引发剂PCL-SS-iBuBr，甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺和催化剂加入到溶剂中，搅拌均匀，加入还原剂，加热反应，得到两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA。
4.根据权利要求3所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中反应物摩尔份数的配方如下：
HO-SS-iBuBr 1份；ε-己内酯40～60份；
所述步骤(2)中反应物摩尔份数的配方如下：
大分子引发剂PCL-SS-iBuBr 1份；甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯40～70份；1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺1～2份。
5.根据权利要求3所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加热反应指加热到110～135℃反应24～48h；步骤(2)中所述的加热反应指加热到60～90℃反应8～16h。
6.一种基于权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物的聚合物胶束系统，其特征在于通过包括以下步骤方法制备得到：将权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物溶于溶剂中，用去离子水透析，得到两亲性嵌段聚合物胶束体系。
7.一种基于权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物的负载金纳米粒子的胶束系统，其特征在于通过包括以下步骤方法制备得到：将权利要求1所述的主链中含有二硫键节点的两亲性线性可降解双响应聚合物溶于溶剂中，透析，再加入氯金酸，室温下避光搅拌，得到负载金纳米粒子的胶束体系。
8.权利要求7所述的负载金纳米粒子的胶束系统在CT成像和药物递释领域中的应用。
9.权利要求7所述的负载金纳米粒子的胶束系统在负载水难溶性药物方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于具体包括以下步骤：将所述的负载金纳米粒子的胶束系统冷冻干燥后，再和水难溶性药物溶解于溶剂中，室温搅拌，透析，得到包载水难溶性药物的聚合物胶束体系。
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