CN106810608A - 高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清及其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清及其制备方法，包括以下步骤：先减弱眼镜蛇毒的神经毒性，然后将其包埋于聚丙烯酰胺凝胶中，最后将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，获得抗血清，冷冻保存，即可。本发明用不同剂量的眼镜蛇毒，采用加热、SDS和β‑巯基乙醇处理减弱神经毒性，聚丙烯酰胺凝胶包埋代替乳化，保证被免疫动物健康存活、降低抗血清的生产成本、制备出了高效价的抗血清。
Description
技术领域
一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，属于免疫技术领域。
背景技术
眼镜蛇(Naja naja atra Cantor) 属于眼镜蛇科、眼镜蛇属，在我国分布广泛，是神经型毒蛇, 其主要毒素为神经毒素。神经毒素分为二类：突触前神经毒素和突触后神经毒素，前者抑制神经传导中乙酰胆碱的释放，后者能够与运动终板乙酰胆碱受体结合，二者都导致神经传导阻断。二类神经毒素都为碱性蛋白，不含非蛋白成分，分子量小，含4-5个二硫健，耐热性很强。
由于眼镜蛇毒神经毒素的稳定性很强，一般的减毒方法很难改变其毒性，在制备神经毒素抗血清过程中，注射的抗原量很少动物才能存活，抗原量小导致抗血清效价低，治疗效果不佳。制备高效价抗血清对于有效治疗眼镜蛇咬伤、降低死亡率有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清及其制备方法，本发明利用眼镜蛇毒神经毒素耐高温的特点,加热后离心获得神经毒素,将神经毒素用SDS和β-巯基乙醇处理降低神经毒性，并包埋在聚丙烯酰胺凝胶中减少释放速度，将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，获得高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清。
本发明的具体技术方案如下：
一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
a、按照0.08-0.12g眼镜蛇毒用0.8-1.2 mL 生理盐水溶解，沸水浴中加热8-12分钟，离心去除非神经毒素沉淀，然后加48-52 mg SDS和1.8-2.2 uL β-巯基乙醇充分混合减弱其神经毒性；
b、神经毒素的包埋： 将经过减毒处理的神经毒素包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；
c、将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，经几次免疫注射后，以切断颈动脉方式杀死家兔取血， 离心获得抗血清。
所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,步骤c所述的免疫注射家兔的具体操作方：将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，进行4次免疫注射，每次注射间隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后，第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清。
所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法制得的抗血清。
所述的抗血清在治疗眼镜蛇咬伤患者上的应用。
本发明技术效果体现在二个方面：
1、保证制备抗血清的高效价
由于神经毒素活性大部分被抑制，注射量增加，被注射动物不会因为神经毒素的作用而死亡，保证了制备的抗血清效价高。通过比较，本发明比传统方法制备的抗血清效价高出约7倍，治疗效果大大提高；
2、不使用昂贵的福氏佐剂，降低抗血清的生产成本。
本发明将神经毒素包埋在网状的聚丙烯酰胺凝胶中，神经毒素从网状的聚丙烯酰胺凝胶中缓慢释放到动物体内，抗原在动物体内停留时间长，能充分刺激免疫系统，而且用聚丙烯酰胺凝胶替代了昂贵的福氏佐剂。
具体实施方式
实施例一：
第一步：眼镜蛇神经毒素的获得
将0.1g 眼镜蛇毒溶解于1.0 mL 生理盐水，沸水浴中加热10分钟，离心（13000转/分）去除非神经毒素沉淀，然后加50 mg SDS和2 uL β-巯基乙醇充分混合减弱其神经毒性；
第二步：神经毒素的包埋
将上述神经毒素溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %过硫酸铵、2uL 四甲基乙二胺(TEMED)，充分混匀，沿试管壁缓慢加入0.5mL 异丙醇，1 小时后凝固，去除异丙醇，取出胶体用手术刀平均分成4份，每份约1 g，冷冻保存；
第三步：注射免疫家兔，获得抗血清
取1份上述胶体，加2.0 mL生理盐水，于研钵内充分磨细，吸入到5mL规格的一次性注射器中，总体积约3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次免疫间隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL,腹腔注射2.25mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。
第四步：抗血清效价的测定
抗血清效价的测定与ELISA方法相似。
将眼镜蛇毒用包被液（0.1mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液）配制成10μg/mL作为抗原样品，将获得的抗血清进行倍比稀释，以不含蛇毒的包被液代替抗原样品作为空白，以正常兔血清（未免疫的家兔血清）替代待测抗血清作为阴性对照，用制备的抗血清作为一抗，羊抗兔IgG-碱性磷酸酶为二抗，1 mg/mL的p-NPP为底物，显色45分钟后在酶标仪上测定OD405值，以空白对照调零，待测抗血清的吸光值2倍于阴性对照吸光值的效价定为1，抗血清的稀释倍数既为抗血清的效价。
（1）抗原包被：酶标板每孔加100μL包被抗原，酶标板置4oC冰箱过夜。
（2）封闭：加封闭液，每孔120 μL ，37 oC孵育1 h。
（3）加一抗：加入倍比稀释的抗血清（ELISA缓冲液稀释），阴性为未免疫的家兔血清，37 oC孵育1 h。
（4）加酶标二抗：加入1/10000的羊抗兔IgG-碱性磷酸酶（Sigma，ELISA缓冲液稀释），37 oC孵育1 h。
（5）加底物：1 mg/mL的p-NPP（Sigma，溶于底物缓冲液，pH 9.8），37 oC黑暗中孵育45 分钟，测OD405值。
注：每一步完成后均用PBST洗3次，每次5分钟以上。
经过计算，实施例一制备的抗血清效价达到560，而用常规蛇毒加佐剂乳化制备的抗血清效价只有80，可见本发明制备的抗血清效价提高约7倍。
实施例二：
第一步：眼镜蛇神经毒素的获得
除了用0.09g 眼镜蛇毒外其他步骤与“实施例一”第一步相同。
第二步：神经毒素的包埋
将第一步获得的神经毒素溶液加入1.3mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uLTEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；
第三步：注射免疫家兔,获得抗血清
与“实施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效价的测定
测定过程与“实施例一”第四步相同。
经过计算，“实施例二”制备的抗血清效价达到544，而用常规蛇毒加佐剂乳化制备的抗血清效价只有80，可见本发明制备的抗血清效价提高约6.8倍。
实施例三：
第一步：眼镜蛇神经毒素的获得
除了用0.11g 眼镜蛇毒外，其他步骤与“实施例一”第一步相同。
第二步：蛇毒蛋白的包埋
将第一步获得的神经毒素溶液加入1.5mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uLTEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；
第三步：注射免疫家兔,获得抗血清
与“实施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效价的测定
检测过程与“实施例一”第四步相同。
经过计算，“实施例三”制备的抗血清效价达到584，而用常规蛇毒加佐剂乳化制备的抗血清效价只有80，可见本发明制备的抗血清效价提高7.3倍。
本发明用不同剂量的眼镜蛇毒，采用加热、SDS和β-巯基乙醇三种处理减弱神经毒性，聚丙烯酰胺凝胶包埋代替乳化，均获得稳定和满意的结果，说明该技术实用、可靠。
Claims (4)
1.一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
a、按照0.08-0.12g眼镜蛇毒用0.8-1.2 mL 生理盐水溶解，沸水浴中加热8-12分钟，离心去除非神经毒素沉淀，然后加48-52 mg SDS和1.8-2.2 uL β-巯基乙醇充分混合减弱其神经毒性；
b、神经毒素的包埋： 将经过减毒处理的神经毒素包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；
c、将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，经几次免疫注射后，以切断颈动脉方式杀死家兔取血， 离心获得抗血清。
2.根据权利要求1所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,步骤c所述的免疫注射家兔的具体操作方：将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，进行4次免疫注射，每次注射间隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后，第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清。
3.权利要求1或2任一项所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法制得的抗血清。
4.权利要求3所述的抗血清在治疗眼镜蛇咬伤患者上的应用。
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