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CN106801050A - 一种环状rna高通量测序文库的构建方法及其试剂盒 - Google Patents

一种环状rna高通量测序文库的构建方法及其试剂盒 Download PDF

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CN106801050A
CN106801050A CN201710088699.5A CN201710088699A CN106801050A CN 106801050 A CN106801050 A CN 106801050A CN 201710088699 A CN201710088699 A CN 201710088699A CN 106801050 A CN106801050 A CN 106801050A
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Abstract

本发明公开了一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒，所述构建方法依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。本发明环状RNA高通量测序文库的构建方法高效、稳定，rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。

Description

一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒。
背景技术
环状RNA(ciucular RNA,circRNA)是一种区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，其为不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴且以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。早在1980年，环状RNA就已经被发现，但是在很长的一段时间内，由于研究技术水平的限制，环状RNA被认为是错误可变剪切而形成的副产品，属于自然界中一种极罕见的现象，且甚至被当做遗传意外或实验人为因素所致，并未引起学术界重视。随着深度RNA测序和规模化生物信息技术的发展，研究者才发现在生物体内存在大量环状RNA分子。2012年Salzman等人通过高通量测序的方法发现了环状RNA广泛存在人的转录组当中，从而引起人们对环状RNA研究的兴趣。2013年Hansen等人发现CDR1as/CiRS-7可以作为miR-7 sponge调控基因表达，证实了环状RNA在人体内的重要作用。最新研究表明环状RNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征。目前已有研究显示环状RNA跟神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良、癌症等疾病相关，并且在人唾液和血液中检测到环状RNA的存在，则表明环状RNA可以在血液，尿液，腹水等临床标本中稳定存在，这些特征使得环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
CN 104388548 A公开了一种高通量环状RNA测序的方法，其包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除标记上生物素的套索RNA及线性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的线性RNA，得到第四混合物；对第四混合物进行标准的高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。该方法步骤复杂，且需要预先合成外源RNA。
由于环状RNA无法直接分离，故而迄今文献中对于环状RNA文库构建并没有一个标准的方法，大多数研究中采用去除rRNA并去除线性RNA，然后再构建用于高通量测序文库的方法，也有一小部分研究是去除rRNA后直接建库，或者去除线性RNA后直接建库，还有极小一部分研究是采用去除PolyA+RNA后建库的方法。这些方法存在rRNA去除不彻底，数据重复性差等缺点。因此，如何高效、稳定地构建用于环状RNA高通量测序的文库，仍然是亟待解决的一个技术难题。
此外，目前市场上还没有专门的环状RNA建库试剂盒，需要科研人员从QIAGEN、Illumina、Backman、NEB、Life technology等多家公司分别购买RNA提取、rRNA去除、线性RNA去除、文库构建等产品，然后摸索合适的条件进行建库。这种多家试剂组合建库一方面价格昂贵，另一方面需要有较高实验技能的科研人员花费较长的时间去摸索最佳实验条件，严重限制了环状RNA研究的进展，因此有必要开发一款能高效、稳定地构建用于环状RNA高通量测序文库的专用试剂盒。
发明内容
鉴于上述问题，本发明发明人对环状RNA测序进行反复研究和分析，开发出一种能够高效稳定地构建环状RNA高通量测序文库的方法，该方法rRNA残留比例低，数据重复性较好，且该方法尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。
为了实现上述目的，本发明提供一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：
(S1)提取样品中的总RNA；
(S2)去除样品中的DNA；
(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；
(S4)去除rRNA；
(S5)去除线性RNA；
(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S1)中提取样品中的总RNA是采用Trizol法进行的，该方法特别适用于组织和细胞样品。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S2)中去除样品中的DNA是采用DNase I消化法进行的。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S3)中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：
(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；
(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；
(S33)检测RNA的完整性。
更优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S33)中检测RNA的完整性是利用Agilent 2100生物分析仪进行的。
在本发明中，OD(optical density)表示被检测物质吸收掉的光密度，OD260/280比值是指在波长260nm和280nm处的吸光光度比值，用于判断RNA的纯度。理论上，在纯RNA的情况下OD260/280比值为2，其中OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S4)中去除rRNA是采用RNase H消化法进行的。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S4)去除rRNA依次包括以下步骤：
(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；
(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；
(S43)用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物；
(S44)用DNase I消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；
(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1，优选1:1。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S43)中用RNaseH消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S45)中测定rRNA耗竭的RNA的浓度所采用的荧光计是通过Qubit荧光计进行的。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S5)中去除线性RNA是采用RNase R消化法进行的，其中RNase R与RNA的用量比为(2.5-3.5)U:1ug，优选3:1，即每1微克RNA中加入3个活性单位(U)的RNase R。
更优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S5)中去除线性RNA所采用的RNase R消化法的消化条件为在35-45℃，优选37℃的温度下消化20-40分钟，优选30分钟。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S6)中构建用于高通量测序的环状RNA文库是采用dUTP法进行的。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S6)中构建用于高通量测序的环状RNA文库依次包括以下步骤：
(S61)RNA片段化；
(S62)第一链合成：采用逆转录酶加随机引物的方法进行；
(S63)第二链合成：利用RNase H消化RNA/cDNA杂交物中的RNA链，然后通过DNA聚合酶I合成第二条链；
(S64)末端修复：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基团；
(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；
(S66)Y型Adapter连接：利用T4 DNA Ligase连接Adapter和加了A尾的dsDNA；
(S67)第二链消化和文库扩增：利用UNG酶消化第二链；
(S68)质检及准备标引文库。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S61)中RNA片段化的条件为在90-96℃，优选94℃的温度下片段化3-6分钟，优选5分钟。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S61)中RNA片段化后的峰值位于300-350bp。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S62)第一链合成利用放线菌素D抑制逆转录酶的依赖DNA的DNA聚合酶活性，以保留链的方向性信息。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S66)Y型Adapter连接中Adapter末端采用硫代磷酸酯键连接T，以防止形成Adapter二聚体，进一步优选地，连接产物纯化采用1×beads纯化一次后，0.7×/0.2×beads进行片段大小筛选，以选择合适的大小的片段。
优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S68)质检及准备标引文库依次包括以下步骤：
(S681)检测文库浓度；
(S682)采用Agilent 2100检测文库质量；
(S683)根据文库浓度，将不同的标引文库混合，准备上机测序。
与常规方法相比，本发明所提供的环状RNA高通量测序文库的构建方法高效、稳定，rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。
此外，本发明还提供一种环状RNA高通量测序文库构建的试剂盒，其包括：
(1)环状RNA富集试剂、DNase I、RNase H、RNaseR；
(2)种属特异的DNA探针；
(3)文库构建所需的各种酶：DNA聚合酶I、Large(Klenow)Fragment、T4Polynucleotide Kinase(T4 PNK)、Klenow Fragment、Escherichia coli UDG、T4 DNALigase(Rapid)、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；
(4)磁珠、dNTP、Nuclease Free Water、dUTP、接头、引物等，
其中，所述种属特异的DNA探针能与相应物种的rRNA序列互补。
本发明所提供的环状RNA高通量测序文库构建试剂盒操作简单，条件优化，成本低，是环状RNA研究的一个有力工具。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明环状RNA高通量测序文库的构建方法因为建立了种属特异的DNA探针库，采用RNaseH去除与探针结合的rRNA，并采用RNaseR进一步富集环状RNA，所以rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品；
(2)本发明环状RNA高通量测序文库构建试剂盒操作简单，条件优化，成本低，是环状RNA研究的一个有力工具。
附图说明
图1为本发明环状RNA高通量测序文库的构建方法的一种实施方式的流程图；
图2-1为本发明实施例1细胞样品中的环状RNA高通量测序文库的建库完成后利用Agilent 2100对文库进行质检的结果；
图2-2为本发明实施例2新鲜肝癌组织样品中的环状RNA高通量测序文库的建库完成后利用Agilent 2100对文库进行质检的结果；
图2-3为本发明实施例3FFPE样品中的环状RNA高通量测序文库的建库完成后利用Agilent 2100对文库进行质检的结果；
图3为实施例1细胞样本测序完成后挑选20个环状RNA进行QPCR验证的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明做进一步地详细描述。
具体地，如图1所示，本发明实施例提供一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：
S1，提取样品中的总RNA；
提取样品中的总RNA是采用Trizol法进行的，该方法特别适用于组织和细胞样品。
S2，去除样品中的DNA。
优选地，去除样品中的DNA是采用DNase I消化法进行的。
S3，检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求。
优选地，检测并评定样品中的总RNA质量依次包括以下步骤：
(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；
(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；
(S33)检测RNA的完整性。
所述步骤(S33)中检测RNA的完整性是利用Agilent 2100生物分析仪进行的。
S4，去除rRNA。
去除rRNA是采用RNase H消化法进行的。
RNase H消化法去除rRNA依次包括以下步骤：
(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；
(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中总的RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；
(S43)用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物；
(S44)用DNase I消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；
(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。
所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的质量比为(1-2)：1，优选1:1。
所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃，45℃保温5分钟。
所述步骤(S43)中用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟。
所述步骤(S45)中测定rRNA耗竭的RNA的浓度所采用的荧光计是通过Qubit荧光计进行的。
所述步骤(S45)中得到的产物进一步用安捷伦2100仪器检测证实已看不到18S，28S rRNA存在的典型峰图。
S5，去除线性RNA。
去除线性RNA是采用RNase R消化法进行的，其中RNase R与RNA的用量比为(2.5-3.5)U:1ug，优选3:1，即每1微克RNA中加入3个活性单位(U)的RNase R。
去除线性RNA所采用的RNase R消化法的消化条件为在35-45℃，优选37℃的温度下消化20-40分钟，优选30分钟。
S6，构建用于高通量测序的环状RNA文库。
构建用于高通量测序的环状RNA文库是采用dUTP法进行的。
dUTP法构建用于高通量测序的环状RNA文库依次包括以下步骤：
(S61)RNA片段化；
(S62)第一链合成：采用逆转录酶加随机引物的方法进行，原料为dNTPs(dA,dC,dG和dT各25mM)；
(S63)第二链合成：利用RNase H消化RNA/cDNA杂交物中的RNA链，然后通过DNA聚合酶I合成第二条链，原料为dUTP mix(10mM dA,dC,dG and 20mM dU)；
(S64)末端修复：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基团；
(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；
(S66)Y型Adapter连接：利用T4 DNA Ligase连接Adapter和加了A尾的dsDNA；
(S67)第二链消化和文库扩增：利用UNG酶消化第二链；
(S68)质检及准备标引文库。
所述步骤(S61)中RNA片段化的条件为在90-96℃，优选94℃的温度下片段化3-6分钟，优选5分钟。
所述步骤(S61)中RNA片段化后的峰值位于300-350bp。
所述步骤(S62)第一链合成利用放线菌素D抑制逆转录酶的依赖DNA的DNA聚合酶活性，以保留链的方向性信息。
所述步骤(S66)Y型Adapter连接中Adapter末端采用硫代磷酸酯键连接T，以防止形成Adapter二聚体，进一步优选地，连接产物纯化采用1×beads纯化一次后，0.7×/0.2×beads进行片段大小筛选，以选择合适的大小的片段。
所述步骤(S68)质检及准备标引文库包括以下步骤：
(S681)Qubit荧光计检测文库浓度；
(S682)采用Agilent 2100检测文库质量；
(S683)根据文库浓度，将不同的标引文库混合，准备上机测序。
与常规方法相比，本发明所提供的环状RNA高通量测序文库的构建方法高效、稳定，rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。
为了使本发明的目的及优点更加简洁明了，本发明将用以下具体实施例进行阐明，但本发明绝非仅限于这些实施例。以下实施例仅为本发明较优选的实施例，且仅用于阐述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的实质和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例1细胞样品中的环状RNA高通量测序文库的构建
(S1)细胞样品中的总RNA的提取
取细胞样品1×107个，在4℃下用PBS洗一次，然后向6孔板每个孔中加入1mLTrizol，并用1mL枪头反复吹打10次。将样品收集到EP管内，加入200μL氯仿，上下颠倒混匀30s后静置3min。随后再在4℃的温度和12000rpm的转速下离心15min，溶液裂解液分三层，其中上层为溶于水相的RNA。取上层溶液并向其中加入等体积的异丙醇，混匀并4℃静置10min。之后再次在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清液。随后在沉淀中加入1mL 75％乙醇并上下颠倒混匀重悬沉淀。然后还在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清，保留沉淀。然后将沉淀在室温下干燥15min直至管壁无液体。随后加入25μL DEPC H2O溶解RNA，以获得RNA溶液。
(S2)去除细胞样品中的DNA
配制如下所示的实验体系：
然后将上述实验体系在室温下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并涡旋混匀15s，随后静置10min以使DNase I失活。其后加入250μL无水乙醇并涡旋混匀15s，随后进行短暂离心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子纯化RNA，并使用25μL DEPC H2O进行洗脱，得到去除DNA后的RNA样品。
(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测去除DNA后的RNA样品中的RNA降解程度并确定是否有污染，结果显示该样品无污染且RNA降解程度小。随后利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，其中OD260/280比值为1.95，纯度较高。之后再通过Agilent 2100生物分析仪分析RNA的完整性，显示RNA完整性很好，RIN值为9.2。
(S4)去除rRNA
设计195条与细胞中的rRNA序列互补的50bp DNA探针等质量混合在一起，形成DNA探针库，然后配制如下所示的实验体系：
DNA探针库 5μg
去除DNA后的RNA样品 5μg
5×hybridization buffer 5μL(其成分为1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.4)；
补DEPC水至25μL。
将上述实验体系在95℃下混合两分钟，然后以0.1℃/s的速度将实验体系的温度降低至45℃，形成DNA-RNA杂交物。随后将10μL RNase H(5U/μL)和5μL已预热至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分为：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl2，100mMDTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA杂交物中。然后在37℃的温度下消化与DNA杂交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XPbeads进行纯化。之后向反应体系中加入5μL TurboDNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的条件下消化DNA探针30min。随后使用2.2×RNA Clean XP beads进行纯化，得到rRNA耗竭的RNA，同时用Qubit荧光计测定rRNA耗竭的RNA浓度，结果显示浓度为21.78ng/μL。
(S5)去除线性RNA
配制如下所示的实验体系：
将上述体系置于37℃水浴中消化30min，获得线性RNA去除的RNA，同时用Qubit荧光计测定其浓度，结果显示浓度为4.60ng/μL。
(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库
(S61)RNA片段化
配制如下所示的实验体系：
5×First Strand Buffer 8μL
线性RNA去除的RNA 10μL
Nuclease free H2O 2μL；
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。
(S62)第一链合成：
配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H2O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。随后将反应体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：25℃10min；42℃50min；70℃15min；4℃Hold。之后加入38μLRNA Clean XP和19μL 100％ethanol进行纯化，并使用16μL Nuclease Free H2O进行洗脱，获得RNA/cDNA杂交物，同时转移至新管中。
(S63)第二链合成
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系在16℃下孵育2.5h。随后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇进行纯化并用32μL Qiagen EB进行洗脱，得到dsDNA。
(S64)末端修复
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下保持30min。随后加入28μL RNA CleanXP和14μL乙醇进行并用17μL Nuclease Free H2O进行洗脱，得到末端修复后的dsDNA。
(S65)加A尾
配制如下所示的实验体系：
然后在37℃下孵育30min。随后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇进行纯化并用10μL Nuclease Free H2O洗脱，得到加了A尾的dsDNA。
(S66)Y型Adapter连接：
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下孵育20min，随后与24μL“12P XP”beads混合并在室温下孵育6min，之后保留上清液并将其与12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室温下孵育6min，随后用10μL Nuclease Free H2O洗脱两次，得到洗脱液，之后将洗脱液与12μL AMPure XP混合，再次在室温下孵育6min，然后使用30μL QiagenEB洗脱1次，得到产物。
(S67)第二链消化和文库扩增
将15μL上述产物与1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系近PCR扩增，循环条件为：94℃30s；(98℃10s；65℃30s；72℃30s)循环15个循环；72℃5min；然后将实验体系的温度保持在4℃。随后加入43μL AMPure XPbeads进行纯化并利用12μL Qiagen EB进行洗脱，得到文库。
(S68)质检及准备标引文库
先用Qubit荧光计检测文库浓度，结果为4.06ng/μL。然后使用Agilent 2100生物分析仪检测文库质量，检测结果见图2，结果显示插入片段大小合格，峰型单一，峰值在200-500bp左右。随后根据检测浓度，将不同的标引文库混合。用Qubit荧光计检测文库浓度后开始续上机测序工作。
实施例2新鲜肝癌组织样品中的环状RNA高通量测序文库的构建
(S1)新鲜肝癌组织样品中的总RNA的提取
取新鲜肝癌组织样品50g，在4℃下用PBS洗一次，并剪碎组织。随后加入1mLTrizol，并用手提式高速分散器匀浆15次。之后将样品收集到EP管内并加入200μL氯仿，上下颠倒混匀30s后静置3min。随后再在4℃的温度和12000rpm的转速下离心15min，溶液裂解液分三层，其中上层为溶于水相的RNA。取上层溶液并向其中加入等体积的异丙醇，混匀并静置10min。之后再次在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清液。随后在沉淀中加入1mL 75％乙醇并上下颠倒混匀重悬沉淀。然后还在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清，保留沉淀。然后将沉淀在室温下干燥15min直至管壁无液体。随后加入30μL DEPC H2O溶解RNA，以获得RNA溶液。
(S2)去除新鲜组织样品中的DNA
配制如下所示的实验体系：
然后将上述实验体系在室温下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并涡旋混匀15s，随后静置10min以使DNase I失活。其后加入250μL无水乙醇并涡旋混匀15s，随后进行离心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子纯化RNA，并使用25μL DEPC H2O进行洗脱，得到去除DNA后的RNA样品。
(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测去除DNA后的RNA样品中的RNA降解程度并确定是否有污染，结果显示该样品无污染且RNA降解程度较小。随后利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，其中OD260/280比值为2.05，纯度较高。之后再通过Agilent 2100生物分析仪分析RNA的完整性，显示RNA完整性较好，RIN为7.1。
(S4)去除rRNA
设计195条与新鲜组织中的rRNA序列互补的50bp DNA探针等质量混合在一起，形成DNA探针库，然后配制如下所示的实验体系：
DNA探针库 5μg
去除DNA后的RNA样品 5μg
5×hybridization buffer 5μL(其成分为1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH7.4)
补DEPC水至25μL。
将上述实验体系在95℃下混合两分钟，然后以0.1℃/s的速度将实验体系的温度降低至45℃，形成DNA-RNA杂交物。随后将10μL RNase H(5U/μL)和5μL已预热至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分为：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl2，100mMDTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA杂交物中。然后在37℃的温度下消化与DNA杂交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XP beads进行纯化。之后向反应体系中加入5μLTurbo DNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的条件下消化DNA探针30min。随后使用2.2×RNA Clean XPbeads进行纯化，得到rRNA耗竭的RNA，同时用Qubit荧光计测定rRNA耗竭的RNA浓度，结果显示浓度为24.8ng/μL。
(S5)去除线性RNA
配制如下所示的实验体系：
将上述体系置于37℃水浴中消化30min，获得线性RNA去除的RNA，同时用Qubit荧光计测定其浓度，结果显示浓度为8.2ng/μL。
(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库
(S61)RNA片段化
配制如下所示的实验体系：
5×First Strand Buffer 8μL
线性RNA去除的RNA 10μL
Nuclease free H2O 2μL；
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。
(S62)第一链合成：
配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H2O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。随后将反应体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：25℃10min；-42℃50min；-70℃15min；-4℃Hold。之后加入38μL RNA Clean XP和19μL 100％ethanol进行纯化，并使用16μL Nuclease Free H2O进行洗脱，获得RNA/cDNA杂交物，同时转移至新管中。
(S63)第二链合成
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系在16℃下孵育2.5h。随后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇进行纯化并用32μL Qiagen EB进行洗脱，得到dsDNA。
(S64)末端修复
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下保持30min。随后加入28μL RNA CleanXP和14μL乙醇进行并用17μL Nuclease Free H2O进行洗脱，得到末端修复后的dsDNA。
(S65)加A尾
配制如下所示的实验体系：
然后在37℃下孵育30min。随后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇进行纯化并用10μL Nuclease Free H2O洗脱，得到加了A尾的dsDNA。
(S66)Y型Adapter连接：
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下孵育20min，随后与24μL“12P XP”beads混合并在室温下孵育6min，之后保留上清液并将其与12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室温下孵育6min，随后用10μL Nuclease Free H2O洗脱两次，得到洗脱液，之后将洗脱液与12μL AMPure XP混合，再次在室温下孵育6min，然后使用30μL QiagenEB洗脱1次，得到产物。
(S67)第二链消化和文库扩增
将15μL上述产物与1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系近PCR扩增，循环条件为：94℃30s；(-98℃10s；-65℃30s；-72℃30s)循环15个循环；-72℃5min；然后将实验体系的温度保持在-4℃。随后加入43μL AMPureXP beads进行纯化并利用12μL Qiagen EB进行洗脱，得到文库。
(S68)质检及准备标引文库
先用Qubit荧光计检测文库浓度，结果为5.16。然后使用Agilent 2100生物分析仪检测文库质量，检测结果见图2，插入片段大小合格，峰型单一，峰值在200-500bp左右。随后根据检测浓度，将不同的标引文库混合。用Qubit荧光计检测文库浓度后开始上机测序工作。
实施例3 FFPE样品中的环状RNA高通量测序文库的构建
(S1)FFPE样品中的总RNA的提取
取FFPE样品切片成8μm厚的片状，立即转移7片切片至1.5mL离心管。然后加入1mL二甲苯并剧烈涡旋30s，并在14000rpm的转速下离心2min。之后加入1mL乙醇至样品中并涡旋混匀30s，再在14000rpm的转速下离心2min，移除上清，保留沉淀。在37℃的温度下干燥15min以去除乙醇。随后向沉淀中加入200μL裂解液和20μl Proteinase K并涡旋混匀。其后在55℃的温度下水浴15min，之后在80℃的温度下水浴15min。低速短暂离心后加入200μL缓冲液至样品中并涡旋混匀20s。随后加入600μL无水乙醇至样品中并涡旋混匀20s。之后转移混合液至吸附柱中，并在8000rpm的转速下离心50s，倒弃流出液，把柱子装在收集管中。随后加入500μL漂洗液至柱子中，再在8000rpm的转速下离心50s，倒弃流出液，把柱子装在收集管中。其后再加入500μL漂洗液至柱子中，再在8000rpm的转速下离心50s。倒弃流出液，把柱子装在收集管中。随后在13000rpm的转速下离心3min，以甩干柱子的基质，并将柱子转移至新的1.5mL离心管中。随后加入30μL DEPC水至柱子的膜中央并静置2min，然后在13000rpm的转速下离心1min以获得RNA溶液。
(S2)去除FFPE样品中的DNA
配制如下所示的实验体系：
然后将上述实验体系在室温下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并涡旋混匀15s，随后静置10min以使DNase I失活。其后加入250μL无水乙醇并涡旋混匀15s，随后进行离心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子纯化RNA，并使用25μL DEPC H2O进行洗脱，得到去除DNA后的RNA样品。
(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测去除DNA后的RNA样品中的RNA降解程度并确定是否有污染，结果显示该样品RNA明显降解。随后利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，其中OD260/280比值为2.37。之后再通过Agilent 2100生物分析仪分析RNA的完整性，显示RNA完整性很差，RIN值为4.5。
(S4)去除rRNA
设计195条与FFPE样本中的rRNA序列互补的50bp DNA探针等质量混合在一起，形成DNA探针库，然后配制如下所示的实验体系：
DNA探针库 5μg
去除DNA后的RNA样品 5μg
5×hybridization buffer 5μL(其成分为1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.4)
补DEPC水至25μL。
将上述实验体系在95℃下混合两分钟，然后以0.1℃/s的速度将实验体系的温度降低至45℃，形成DNA-RNA杂交物。随后将10μL RNase H(5U/μL)和5μL已预热至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分为：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl2，100mMDTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA杂交物中。然后在37℃的温度下消化与DNA杂交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XP beads进行纯化。之后向反应体系中加入5μLTurbo DNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的条件下消化DNA探针30min。随后使用2.2×RNA Clean XPbeads进行纯化，得到rRNA耗竭的RNA，同时用Qubit荧光计测定rRNA耗竭的RNA浓度，结果显示浓度为19.9ng/μL。
(S5)去除线性RNA
配制如下所示的实验体系：
将上述体系置于37℃水浴中消化30min，获得线性RNA去除的RNA，同时用Qubit荧光计测定其浓度，结果显示浓度为3.25ng/μL。
(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库
(S61)RNA片段化
配制如下所示的实验体系：
5×First Strand Buffer 8μL
线性RNA去除的RNA 10μL
Nuclease free H2O 2μL；
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。
(S62)第一链合成：
配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H2O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。随后将反应体系放入PCR仪中孵育，所述PCR仪的程序为：25℃10min；-42℃50min；-70℃15min；-4℃Hold。之后加入38μL RNA Clean XP和19μL 100％ethanol进行纯化，并使用16μL Nuclease Free H2O进行洗脱，获得RNA/cDNA杂交物，同时转移至新管中，。
(S63)第二链合成
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系在16℃下孵育2.5h。随后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇进行纯化并用32μL Qiagen EB进行洗脱，得到dsDNA。
(S64)末端修复
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下保持30min。随后加入28μL RNA CleanXP和14μL乙醇进行并用17μL Nuclease Free H2O进行洗脱，得到末端修复后的dsDNA。
(S65)加A尾
配制如下所示的实验体系：
然后在37℃下孵育30min。随后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇进行纯化并用10μL Nuclease Free H2O洗脱，得到加了A尾的dsDNA。
(S66)Y型Adapter连接：
在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系放入PCR仪中并在20℃下孵育20min，随后与24μL“12P XP”beads混合并在室温下孵育6min，之后保留上清液并将其与12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室温下孵育6min，随后用10μL Nuclease Free H2O洗脱两次，得到洗脱液，之后将洗脱液与12μL AMPure XP混合，再次在室温下孵育6min，然后使用30μL QiagenEB洗脱1次，得到产物。
(S67)第二链消化和文库扩增
将15μL上述产物与1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的实验体系：
将上述实验体系近PCR扩增，循环条件为：94℃30s；(98℃10s；65℃30s；72℃30s)循环15个循环；72℃5min；然后将实验体系的温度保持在4℃。随后加入43μL AMPure XPbeads进行纯化并利用12μL Qiagen EB进行洗脱，得到文库。
(S68)质检及准备标引文库
先用Qubit荧光计检测文库浓度，结果为5.24ng/μL。然后使用Agilent 2100生物分析仪检测文库质量，检测结果见图2，插入片段大小合格，峰型单一，峰值在200-500bp左右。随后根据检测浓度，将不同的标引文库混合。用Qubit荧光计检测文库浓度后开始续上机测序工作。
测序实施例生物信息学分析测序数据
将实施例1-3构建的环状RNA高通量测序文库及文献报道方法(参见MolecularCell 56,55–66,October 2,2014)构建的环状RNA高通量测序文库在Illumina测序平台进行测序。结果示于表1中。
表1本发明方法与文献报道方法测序结果生物信息学分析
测序数据经生物信息学分析之后的结果见表1，对比之下，本发明实施例提供的方法能够将样品中的rRNA进一步去除，数据中rRNA残留比例<0.1％，而文献报道方法中rRNA残留为5％，对于FFPE等降解严重的RNA样品更是高达37％，严重浪费数据量，本发明方法使得环状RNA的有效测序数据量显著提高。在环状RNA检测数量方面，RNA完整性好的样品(细胞样品)用文献报道方法检出的环状RNA较多，但是RNA质量差的样品，尤其是FFPE样品本发明方法显著优于文献报道方法。此外，使用本发明方法进行环状RNA高通量测序文库构建，有标准的操作流程，条件优化，结果稳定，成本仅为文献报道方法的1/3。从测序结果中随机挑选20个环状RNA进行QPCR验证，验证结果阳性率100％(图3)，有力证实了本发明方法的可靠性。
由此可证明本发明实施例所用的方法能显著的将样品中的环状RNA进一步富集，大幅度降低环状RNA测序数据量，降低成本，减少人力物力的浪费。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：
(S1)提取样品中的总RNA；
(S2)去除样品中的DNA；
(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；
(S4)去除rRNA；
(S5)去除线性RNA；
(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S3)中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：
(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；
(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；
(S33)检测RNA的完整性。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S4)去除rRNA依次包括以下步骤：
(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；
(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；
(S43)用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物；
(S44)用DNase I消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；
(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1，优选1:1。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S43)中用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S6)中构建用于高通量测序的环状RNA文库依次包括以下步骤：
(S61)RNA片段化；
(S62)第一链合成：采用逆转录酶加随机引物的方法进行；
(S63)第二链合成：利用RNase H消化RNA/cDNA杂交物中的RNA链，然后通过DNA聚合酶I合成第二条链；
(S64)末端修复：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基团；
(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；
(S66)Y型Adapter连接：利用T4DNA Ligase连接Adapter和加了A尾的dsDNA；
(S67)第二链消化和文库扩增：利用UNG酶消化第二链；
(S68)质检及准备标引文库。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S61)中RNA片段化的条件为在90-96℃，优选94℃的温度下片段化3-6分钟，优选5分钟。
9.一种环状RNA高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于，其包括：
(1)环状RNA富集试剂、DNase I、RNase H、RNaseR；
(2)种属特异的DNA探针；
(3)文库构建所需的各种酶：DNA聚合酶I、Large Fragment、T4PolynucleotideKinase、Klenow Fragment、Escherichia coli UDG、T4DNA Ligase、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；
(4)磁珠、dNTP、Nuclease Free Water、dUTP、接头、引物，
其中，所述种属特异的DNA探针能与相应物种的rRNA序列互补。
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