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CN106801056A - 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用 - Google Patents

一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用 Download PDF

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CN106801056A
CN106801056A CN201710054835.9A CN201710054835A CN106801056A CN 106801056 A CN106801056 A CN 106801056A CN 201710054835 A CN201710054835 A CN 201710054835A CN 106801056 A CN106801056 A CN 106801056A
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cas9
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CN201710054835.9A
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姚永超
陈小平
余松林
肖宏奎
李姣姣
秦莉
赵思婷
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Original Assignee
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
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Abstract

本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，具体为以SIVmac1A11慢病毒为骨架，表达SpCas9蛋白及基因特异性的sgRNA，用于治疗人和猴艾滋病。所述sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明采用了目前最高效的CRISPR/Cas9基因编辑工具，所设计的CXCR4/CCR5基因sgRNA位点具有优于以往研究所报道的其他位点的基因敲除活性，也是首次应用于SIV感染恒河猴的基因治疗，相比ZFN和TALEN具有操作便捷、成本低廉等优势。

Description

一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，具体为以SIVmac1A11慢病毒为骨架，表达SpCas9蛋白及基因特异性的sgRNA，用于治疗人和猴艾滋病。
背景技术
成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关的Cas9蛋白系统(CRISPR/Cas9)是细菌和古细菌用于抵御外源病毒感染的天然防御机制。外源的DNA入侵细菌/古细菌后，会被细胞中与外源DNA特定区域互补的RNA引导序列(guideRNA)识别，并引导Cas9核酸酶到达识别部位，对目标序列进行酶切，从而降解外源DNA。此系统具体工作原理如下：crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物能够引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的目标序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的单链sgRNA(singleguideRNA)，引导Cas9对DNA进行定点切割。
作为一种RNA导向的双链DNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。因此CRISPR/Cas9很快作为新的基因编辑工具被广泛应用于遗传工程、作物育种以及基因治疗等领域。
艾滋病是一种难以根治的慢性传染病。尽管联合抗逆转录病毒治疗可以控制HIV-1病毒的复制，维持患者的生存，但是药物的副作用以及长期用药产生的抗药性等问题仍然存在，寻找更有效，且能改善患者生存质量的治疗策略是艾滋病研究领域的重点和难点。艾滋病的基因治疗已涉及到病毒感染宿主的整个生命周期，其中靶向病毒入侵门户——辅助受体CXCR4和CCR5的治疗策略已经在临床上展现了曙光。2007年一位感染HIV-1且身患急性髓细胞性白血病的男子，经过异体移植CCR5基因天然缺失32个碱基(CCR5Δ32/Δ32)的供者骨髓后，至今仍未检测到体内病毒的反弹，且身体状况良好，被公认是全球第一例被治愈的艾滋病患者。后续的研究表明，表型的供者骨髓是实现根治的关键。然而天然携带CCR5Δ32/Δ32基因型的人数稀少，且存在HLA配型等问题，限制了此疗法的推广。此外，已有大量研究证实，HIV-1不同的毒株具有不同的共受体嗜性(CCR5嗜性，CXCR4嗜性，X4-R5双嗜性等)，并且同一个患者体内也存在不同嗜性的HIV-1变异体。因此利用遗传工具来修饰患者自身CCR5、CXCR4等基因，并自体回输，用于控制和治疗HIV-1感染，有可能最终实现功能性治愈。
CN 104480144 A公开了一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得。其采用的是人的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，其安全性不高。
恒河猴作为艾滋病研究的模型，具有小鼠所不具有的优势：首先猴与人的遗传背景更为接近；其次，研究已证实HIV-1起源于SIV，HIV-1感染人的病程和病理特征与SIV感染恒河猴十分相似。因此，用恒河猴感染SIVmac251作为慢性感染模型，对于临床治疗HIV-1感染具有重要的参考意义。以往的研究中，利用锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)对猕猴的胚胎细胞进行基因的特异性修饰，用于获得转基因猴，但是对于分化的外周原代细胞的基因修饰，所能运用的技术手段有限。利用腺病毒或者腺相关病毒作为载体传递ZFN或TALEN能够对外周血细胞进行适度的修饰，但是这两种技术的运用较为复杂，而腺病毒本身对恒河猴有免疫原性，可能会影响基因修饰的效果。
因此采用SIV慢病毒载体，传递CRISPR/Cas9，既能提高感染原代细胞的效率，同时也能更为方便快捷高效地对目的基因进行修饰，提高基因修饰的安全性。
发明内容
针对目前的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，由于人是HIV-1的天然宿主，以HIV-1为载体的慢病毒对人有潜在的安全隐患，并且对非人灵长类原代细胞尤其是T细胞感染效率很低，本发明提供一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，经过CXCR4和CCR5双基因修饰的猴T细胞在体外的SIV病毒感染试验中表现出优于野生型细胞的抗病毒侵染能力。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种sgRNA，所述sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。
所述核酸序列如下：
SEQ ID NO.1：CTACAGCAGTGTCCTCATCCTGG；
SEQ ID NO.2：CAATGTGTCAACTCTTGACAGGG；
本发明中，所述sgRNA可根据敲除基因的需要进行选择，只需敲除CXCR4选择SEQID NO.1所示的sgRNA，只需敲除CCR5选择SEQ ID NO.2所示的sgRNA，若需要同时敲除CXCR4和CCR5，可分别将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2与启动子连接，共同导入同一个质粒中，实现同时敲除。
优选地，所述sgRNA的启动子为U6启动子。
本发明中，选择SIVmac251感染的中国恒河猴，在病毒感染的慢性期采集患猴的自身细胞，包括造血干细胞(HSC)、外周血CD4+T细胞并体外短期培养扩增，构建同时表达Cas9核酸酶以及靶向CXCR4和/或CCR5基因的sgRNAs的慢病毒载体。由于人是HIV-1的天然宿主，以HIV-1为载体的慢病毒对人有潜在的安全隐患，并且对非人灵长类原代细胞尤其是T细胞感染效率很低，因此选择基于猴免疫缺陷病毒SIVmac1A11的第3代慢病毒骨架，最终获得的慢病毒命名为SIV-CRISPR/Cas9，将SIV-CRISPR/Cas9慢病毒体外感染原代细胞，随后将基因修饰的细胞回输给经过条件性处理的患猴，观察治疗效果。
第二方面，本发明提供一种SIV-CRISP/cas9慢病毒载体，所述慢病毒载体包含如第一方面所述的sgRNA的核酸序列。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的SIV-CRISP/Spcas9慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)使用HpaI和ClaI双酶切pCL20cSLFR MSCV-GFP载体，得到酶切后的载体；
(2)PCR扩增U6启动子-sgRNA-EFS启动子-Cas9序列，通过末端重组的方式克隆到步骤(1)酶切后的载体上，得到所述SIV-CRISP/Spcas9慢病毒载体。
优选地，步骤(2)所述的PCR扩增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
所述核酸序列如下：
SEQ ID NO.3：CGGTGGTTCGAACGCGTTAACCCTATTTCCCATGATTCCTTC；
SEQ ID NO.4：GGTACCGTATACGGCATCGATGTAATCCAGAGGTTGATTGTCG.
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第二方面所述的SIV-CRISP/cas9慢病毒载体与包装辅助质粒pCAG4-RTR-SIV、pCAG-SIVgprre和pCAG-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞。
第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的SIV-CRISP/cas9慢病毒载体用于敲除CXCR4和/或CCR5基因。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第二方面所述的慢病毒载体和/或如第四方面所述的重组慢病毒。
第七方面，本发明提供如第二方面所述的慢病毒载体、如第四方面所述的重组慢病毒或如第六方面所述的组合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的SIV-CRISPR/Cas9慢病毒有别于目前已报道的其他Cas9传递工具，所述SIV慢病毒载体能将CRISPR/Cas9系统成功转入恒河猴原代细胞，从而实现对目标基因的有效敲除，经过CCR5修饰的猴HSC细胞仍然维持分化的潜能，经过CXCR4和CCR5双基因修饰的猴T细胞在体外的SIV病毒感染试验中表现出优于野生型细胞的抗病毒侵染能力；
(2)本发明的SIV慢病毒载体对非人灵长类细胞具有较高的感染能力，可以应用于多种疾病基因治疗的临床前动物试验，由于SIV慢病毒不会感染人体，且对人源的细胞也具有较高的感染效率，因此可以考虑直接用于未来的临床研究；
(3)本专利采用了目前最高效的CRISPR/Cas9基因编辑工具，所设计的CXCR4/CCR5基因sgRNA位点具有优于以往研究所报道的其他位点的基因敲除活性，也是首次应用于SIV感染恒河猴的基因治疗，相比ZFN和TALEN具有操作便捷、成本低廉等优势。
附图说明
图1(A)为本发明靶向CXCR4的SIV-CRISPR/Cas9慢病毒表达载体示意图，图1(B)为本发明靶向CCR5的SIV-CRISPR/Cas9慢病毒表达载体示意图；
图2(A)为本发明筛选最优的CXCR4特异性sgRNA的凝胶电泳图谱，图2(B)为本发明筛选最优的CXCR4特异性sgRNA的凝胶电泳图谱；
图3(A)为本发明猴CD4+T细胞感染SIV-GFP报告病毒后GFP表达水平检测，图3(B)为本发明猴HSC细胞感染SIV-GFP报告病毒后GFP表达水平检测；
图4为本发明CRISPR/Cas9慢病毒有效敲除猴CD4+T细胞CXCR4和CCR5基因，其中，图4(A)为敲除后的凝胶电泳图谱，图4(B)为CXCR4基因的敲除效率，图4(C)为CCR5基因的敲除效率；
图5为本发明CRISPR/Cas9修饰过的猴CD4+T细胞可抵抗SIV病毒的感染；
图6为本发明CRISPR/Cas9慢病毒有效敲除猴HSC细胞CCR5基因；
图7为本发明CRISPR/Cas9修饰过的猴HSC细胞仍保留造血分化的潜力。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1：靶向人/猴CXCR4/CCR5的SIV-CRISPR/Cas9慢病毒表达载体pCL20-CAS-sgRNA的构建
(1)从GenBank数据库搜索人和恒河猴的CXCR4基因和CCR5基因，通过序列比对，找到两者蛋白编码区的同源序列。选择靠近5’端的同源序列，用在线工具(http://crispr.mit.edu/)设计可能的sgRNA，该在线工具能够根据目标序列的碱基分布情况，结合可能的脱靶概率，得到综合评分。分值越高的sgRNA，其可能的敲出效率越高而脱靶效率越低。基于此，本专利中对CXCR4选取排名靠前且靠近编码区5’端的7条sgRNA；对CCR5选取排名靠前且靠近编码区5’端的8条sgRNA，如图1(A)-图1(B)所示。
将构建的所有sgRNA载体转染Hela-CD4细胞，提取DNA，用于扩增目标序列，所用的引物标记为：
SEQ ID No.5:CACTTCAGATAACTACACCGAGG；
SEQ ID No.6:GAGTGTGACAGCTTGGAGATG；
SEQ ID No.7:CGCTCTACTCACTGGTGTTC；
SEQ ID No.8:CCTGTGCCTCTTCTTCTCATT；
将扩增的PCR产物用于Surveyor酶切，随后电泳鉴定出存在较高敲除活性的sgRNA，结果如图2(A)-图2(B)所示，CXCR4和CCR5基因在不同的sgRNA作用下，有不同的基因敲除效率。CRISPR/Cas9造成目标序列发生DNA双链断裂，哺乳动物细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复方式进行断链的修复，随之产生各种突变(InDels)。Surveyor酶则是专门用于检测这些突变的。
(2)将选定的最优sgRNA载体经PCR扩增，得到一段包含sgRNA及Cas9的完整序列：U6启动子-sgRNA-EFS启动子-Cas9，用于扩增的引物标记为：
SEQ ID NO.3：CGGTGGTTCGAACGCGTTAACCCTATTTCCCATGATTCCTTC；
SEQ ID NO.4：GGTACCGTATACGGCATCGATGTAATCCAGAGGTTGATTGTCG.
将扩增的序列与HpaI+ClaI双酶切的pCL20cSLFR MSCV-GFP长片段通过末端重组的方式连接即得到pCL20-CAS-sgRNA载体。采用Vazyme公司的一步法克隆试剂盒进行此步操作。
(3)重组质粒的测序。将重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果与预期的结果比对，证实序列完全正确。
实施例2：慢病毒表达载体和包装载体的大量提取
(1)分别取pCL20-CAS-sgRNA，pCAG4-RTR-SIV，pCAG-SIVgprre，pCAG-VSVG质粒少量转化stbl3大肠杆菌感受态，第二天挑取单克隆接种于1ml含氨苄青霉素(Amp)的LB培养液，摇菌8小时后，取500μl菌液接入含有500ml LB/Amp培养液的培养瓶中，37℃摇床培养12-16小时；
(2)5000*g离心5分钟，收集菌体，倒掉培养基并反扣于吸水纸轻轻拍打以吸尽残液。收集的菌体采用质粒大提试剂盒(广州美基生物科技有限公司)大提质粒。
(3)加入20ml BufferP1/RNase A至菌体中，涡旋重悬细菌(确保细菌完全重悬，重悬后的溶液没有细胞团块)；
(4)向重悬液中加入20ml Buffer P2，颠倒混匀10-15次，静置1-2分钟(一定要轻轻混匀，注意操作时间不能超过4分钟)；
(5)向裂解液中加入20ml Buffer E3，立即颠倒混匀15-20次，混匀过程要轻柔而充分。中和充分的标准是：溶液变得不粘稠，沉淀物分散显白色；
(6)3000*g离心10分钟，然后转移上清液至新的离心管中，加入1/3倍体积BufferE4至上清液中，涡旋混匀；
(7)将MaxPure Micro Column套在50ml离心管中，转移15ml混合液至柱子中，3000*g离心10分钟；
(8)倒掉流出液，把柱子套回收集管中，继续转移剩下的溶液至柱子中，3000*g离心10分钟；
(9)倒掉流出液，把柱子套回收集管中，加入20ml Buffer E5至柱子，3000*g离心10分钟；
(10)倒掉滤液把柱子套回收集管中。加入20ml Buffer PW2(已用无水乙醇稀释)至柱子，3000*g离心10分钟；
(11)倒掉滤液把珠子套回收集管中。加入20ml Buffer PW2(已用无水乙醇稀释)至柱子，3000*g离心10分钟；
(12)倒弃滤液把柱子套回收集管中，4000*g离心10分钟；
(13)把柱子套在灭菌的50ml离心管中，加入30-200ml灭菌水至柱子的膜中央，静置2分钟，10000*g离心5分钟，收集分离液；
(14)进一步抽提去除内毒素，用灭菌水调整质粒浓度在0.1g-0.6mg/ml之间；
(15)加入0.1倍体积Buffer ER1和0.1倍体积Buffer ER2至质粒溶液中，颠倒混匀；
(16)冰上放置20min，期间颠倒混匀多次；
(17)42℃水浴5min后室温在10000*g速度下离心3min；
(18)轻轻取出样品，发现底部形成了一层红色的溶液，小心把上清液转移到离心管仲，加入0.7倍体积的异丙醇至上清液中，颠倒混匀多次；
(19)室温下，在10000*g速度下离心10min，倒掉上清液，加入1倍体积的70％乙醇至沉淀中。涡旋混匀15-30s；
(20)室温下，在10000*g速度下离心3min，小心倒掉上清液；
(21)室温下，在10000*g速度下离心1min收集管壁上的液滴，不要吸到沉淀，在空气中干燥10min；
(22)加入适量无菌水到质粒中，涡旋10-20s混匀，室温静置30min让质粒充分溶解，期间颠倒混匀多次；
(23)在Nanodrop紫外分光光度计上测量质粒浓度，然后将质粒保存在-20℃中。
实施例3：慢病毒的包装、浓缩和滴定。
3.1慢病毒的包装
(1)细胞预板：在转染前24h，取长满的293T细胞进行预板，以第二天能达到70％汇合度为宜(75mm培养皿内预板500万)；
(2)第二天：转染；
(a)观察预板细胞的生长情况，以细胞的汇合度在90％左右为宜，吸去培养基，加入新鲜预热的完全培养基(75mm培养皿内15mL)；
(b)转染前将转染所需的PEI、质粒、Opti-MEM I Reduced Serum Medium等放置室温平衡；
(c)制备质粒的混合液。本次包装共10皿293T细胞，每一皿细胞准备混合液500μL，故需准备混合液总体积为5mL。先根据各种质粒用量加入三种质粒，共420μg(pCL20-CAS-sgRNA：pCAG4-RTR-SIV：pCAG-SIVgprre：pCAG-VSVG＝5:3:3:3)，加入Opti-MEM I ReducedSerum Medium调整体积到2.5mL，吹打混匀后室温放置10min。再取PEI和Opti-MEM IReduced Serum Medium各1.25mL，混匀后室温放置10min。最后将以上两种溶液混合，混匀后室温放置10min，即为转染用的混合液；
(d)混合液逐滴加入培养皿中，每皿500μL；
(3)转染6h以后，需把每皿培养基换成17mL UltraCLUTURE无血清培养基；
(4)第三至五天：病毒的收集。转染48h-72h，分别收集培养上清，收集的病毒上清暂存于4℃。
3.2慢病毒纯化与浓缩
将收集的培养上清用0.45um的膜过滤后用切向流超滤膜(Millipore TFF BiOmax100k超滤膜包)进行纯化：将原液中的小分子杂蛋白滤除，介质置换为无菌的不含Ca2+、Mg2+离子的PBS，同时缩小总体积至30-40ml。超速离心浓缩慢病毒：SW-32Ti的转子25000rpm(对应离心力为106750g)，4度离心2小时。去上清后，用400ul的PBS重悬，保存于-80℃。
3.3慢病毒的滴定
(1)6孔板中预铺板Hela细胞，1×105cells/well，37℃5％CO2培养箱中培养过夜(大约18-20h)；
(2)配制polybrene母液：灭菌纯水，8mg/mL，0.22μm滤头过滤，分装，保存于-20℃备用；
(3)配制含polybrene的DMEM培养基：+10％FBS，+1％双抗，8μg/mL polybrene(培养基体积的千分之一)；
(4)融化病毒：从-80℃取出病毒冻存液，在室温融化，融化后置于冰上拿进细胞间备用；
(5)稀释病毒：用配好的含polybrene的10％FBS DMEM(DF-10)完全培养基将病毒原液进行10倍稀释，得到10-1-10-4的病毒稀释液。注意每次吸取病毒液进行下一步稀释前要混匀；
(6)弃掉旧培养基，第一孔中加入1mL不含病毒的培养基作为阴性对照。其余每孔中加入1mL对应的病毒稀释液。37℃培养18-20h；
(7)第二天早上去掉含病毒的培养基，加入DF-10(含10U/ml的DNase I)于37℃孵育15min以除去残留的核酸；替换为2mL不含聚凝胺的DF-10培养基。
(8)继续培养两天后，吸去培养基，然后用胰酶消化细胞；
(9)将细胞吹成单个细胞，加入适量完全培养基终止胰酶反应，300g 3min离心收集细胞；
(10)提取细胞DNA，参考血液和组织基因组提取试剂盒(Qiagen)说明书；
(11)参考文献合成WPRE引物和探针，用所提的DNA为模板，进行Real time qPCR反应。包括两个独立的反应，反应一：扩增整合慢病毒(前病毒)中的WPRE序列，反应二：扩增内参基因RNaseP，两个反应用相同的DNA模板，反应条件完全一致：95℃，1分钟；95℃，15秒，60℃，15秒，读板，共45个循环；4℃，10秒；
(15)计算公式：滴度(IU/ml)＝(P×N×D×1000)/V，P＝每个基因组的前病毒拷贝数，N＝转染时的细胞数,D＝慢病毒稀释倍数，V＝所加入病毒稀释液体积，其中P的数值需根据质粒标准品以及RNaseP内参的数值来确定。
实施例4：恒河猴T细胞的分离、培养和感染
4.1 PBMC细胞的分离
(1)采血50mL，1100g离心10min(加速设置为3，降速设置为1)；
(2)取白细胞层，用2％FBS稀释至8mL；
(3)吸取5mL LymphoPrep加入15mL离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，保持两者界面清晰；
(4)1100g离心20min(加速设置为1，降速设置为1)；
(5)用巴氏吸管轻轻吸出灰白色的单个核细胞，加入另一支已含有10mL RF-10的离心管中，混匀；
(6)以500g离心5min，弃上清；
(7)加10mL RF-10重悬细胞，trypan blue计数，300g离心10min，弃上清。
4.2磁珠分选恒河猴CD4+T细胞
(1)涡旋混匀磁珠，取25μL磁珠于试管中，加入1mL Buffer 1混匀，将试管放在磁力架上1min，去上清。加25μL Bffer1重悬磁珠备用；
(2)PBMC用Buffer 1重悬至密度为107个/mL；
(3)向1mL的PBMC中加入25μL洗涤的磁珠，2-8℃孵育20min，放在摇床上倾斜旋转；
(4)将试管放在磁铁上2min，收集上清；
(5)移开试管，加1mL Buffer 1，吹打混匀，放在磁珠上2min，收集上清，重复一次；
(6)重复步骤(5)；
(7)加100μL Buffer 2重悬细胞，加10μL DETCHaBEAD，室温下孵育45min使细胞从磁珠上释放；
(8)将试管放在磁力架上1min，含有细胞的上清转移到新的试管中，加500μLBuffer 2洗涤磁珠2-3次，收集上清；
(9)加4mL Buffer 2，350g离心5min，去上清，用T细胞培养基重悬细胞；
4.3恒河猴CD4+T细胞的培养
(1)磁珠分选后的CD4+T细胞350g离心10min；
(2)RF-10重悬计数；
(3)将CD4+T细胞接种于48-well板，细胞密度为5×105个/mL；
(4)在T细胞专用培养基加入CD3/CD28抗体磁珠。加入磁珠的量按与细胞的比例1:1加入；
(5)加rhIL-2，使终浓度为10ng/ml。
(6)每周计数2-3次，记录细胞的增殖情况。
4.4 T细胞的慢病毒转染。
(1)磁珠分选后的CD4+T细胞350g离心10min，加完全培养基重悬计数；
(2)加CD4+T细胞于96孔板中培养，细胞密度为5×105个/mL，每孔细胞数为1×105个；
(3)洗涤磁珠，向培养皿中加入与细胞1:1比例的磁珠；
(4)加rhIL-2，使终浓度为10μg/L；
(5)刺激24h后，感染细胞，加polybrene，使终浓度为6μg/mL，混匀；
(6)16-24h后换液。
荧光显微镜拍照病毒感染T细胞的情况，如图3(A)所示。
提取基因敲除后的T细胞基因组，检测CXCR4和CCR5的基因敲除效率，结果如图4(A)、4(B)、4(C)显示CXCR4和CCR5的基因敲除效率。
基因敲除后的T细胞在体外感染猴艾滋病毒，检测对艾滋病毒的抵抗情况。结果如图5所示，CCR5基因敲除后的T细胞，对CCR5嗜性的猴艾滋病毒具有抵抗性。
实施例5：猴造血干细胞(HSC)细胞的分离和培养
(1)对SIV感染猴进行造血干细胞的动员：联合注射rhSCF(100μg/kg/day)和rhG-CSF(25μg/kg/day)，连续3天；
(2)用血细胞分离机分离动员后的外周血单个核细胞，按照步骤4.1的操作分离PBMC；
(3)按照CD34阳性细胞磁珠分选试剂盒操作说明，分选CD34+HSC。按照1×106/ml的浓度将HSC铺于预先包被有25μg/cm2RetroNectin纤连蛋白的24孔培养板，培养基为StemSpanⅡSFEM干细胞培养基(StemCell)，添加的细胞因子有：SCF，Flt3L，TPO，浓度均为100ng/ml，称为HSC完全培养基；
(4)细胞预刺激2小时后，按照MOI＝100添加SIV-sgR5/Cas9慢病毒(只用于敲除CCR5)，感染24h后替换为新鲜的完全培养基；荧光显微镜拍照病毒感染造血干细胞的情况如图3(B)所示。
(5)继续培养2天后，收集细胞，用于检测CCR5基因敲除效率，结果如图6所示，猴造血干细胞中的CCR5基因具有一定效率的敲除；评价修饰后细胞的表型；检测修饰后的HSC细胞体外向多个造血系分化的能力等。
实施例6：猴HSC细胞的体外造血分化集落(CFU)分析
(1)收集感染过SIV-sgR5/Cas9以及未感染的对照HSC细胞，准确计数；
(2)各个处理组分别取1000个活细胞，重悬于300μL HSC完全培养基中，补充添加G-CSF，IL-3，IL-6，各50ng/ml；
(3)将重悬的细胞转入3ml预热的甲基纤维素半固体培养基(StemCell)中，震荡混匀后，铺于低吸附的6-孔板。每个板只接种1孔细胞，其余5孔加入无菌水各2ml；
(4)将孔板置于37℃，培养12-14天，观察和计数各种不同的集落：BFU-E/CFU-E/CFU-G/CFU-M/CFU-GM/CFU-GEMN等，结果如图7所示，基因敲除后的造血干细胞具有分化成各种细胞集落的能力；
(5)挑取所有的单克隆细胞集落，用于提取DNA，检测每个克隆的基因敲除情况，进行统计。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
ctacagcagt gtcctcatcc tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
caatgtgtca actcttgaca ggg 23
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
cggtggttcg aacgcgttaa ccctatttcc catgattcct tc 42
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
ggtaccgtat acggcatcga tgtaatccag aggttgattg tcg 43
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
cacttcagat aactacaccg agg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
gagtgtgaca gcttggagat g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
cgctctactc actggtgttc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
cctgtgcctc ttcttctcat t 21

Claims (10)

1.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的启动子为U6启动子。
3.一种SIV-CRISP/cas9慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含如权利要求1或2所述的sgRNA的核酸序列。
4.一种如权利要求3所述的SIV-CRISP/Spcas9慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用HpaI和ClaI双酶切pCL20cSLFR MSCV-GFP载体，得到酶切后的载体；
(2)PCR扩增U6启动子-sgRNA-EFS启动子-Cas9序列，通过末端重组的方式克隆到步骤(1)酶切后的载体上，得到所述SIV-CRISP/Spcas9慢病毒载体。
5.根据权利要求4所述的方法，步骤(2)所述的PCR扩增的引物的核酸序列如SEQ IDNO.3-4所示。
6.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求3所述的SIV-CRISP/cas9慢病毒载体与包装辅助质粒pCAG4-RTR-SIV、pCAG-SIVgprre和pCAG-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为HEK293T细胞。
8.一种如权利要求3所述的SIV-CRISP/cas9慢病毒载体用于敲除CXCR4和/或CCR5基因。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求3所述的慢病毒载体和/或如权利要求6所述的重组慢病毒。
10.如权利要求3所述的慢病毒载体、如权利要求6所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
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