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CN106770824A - 利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法 - Google Patents

利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法 Download PDF

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CN106770824A
CN106770824A CN201611192839.5A CN201611192839A CN106770824A CN 106770824 A CN106770824 A CN 106770824A CN 201611192839 A CN201611192839 A CN 201611192839A CN 106770824 A CN106770824 A CN 106770824A
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祝伟霞
杨冀州
刘亚风
陈科
付光宇
鲁清月
韩艳林
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Autobio Diagnostics Co Ltd
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Abstract

本发明涉及利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法，可有效解决利用质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的问题。方法是，配制标准品工作液和内标物工作液：取血浆样本加入内标物工作液混匀，后加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，上清液过活化的HLB固相萃取柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，吹干，得抽提物，抽提物用甲醇水溶液复溶，过滤，滤液用液相色谱‑质谱仪检测；设定液相色谱‑质谱仪的检测条件，将血浆样本用赛默飞QE质谱仪测出的结果与已知浓度的6个工作点的醛固酮标准品工作液的标准曲线进行比较，实现血浆中痕量醛固酮的检测。本发明方法简单，易操作，检测准确，效果好，具有很强的实际应用价值，经济和社会效益显著。

Description

利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法
技术领域
本发明涉及检测方法，特别是一种利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法。
背景技术
醛固酮(Aldosterone)是由肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌的一种类固醇类激素，属于盐皮质激素家族。它有三个主要功能：1)和远端小管和集尿管的主细胞内的盐皮质激素受体结合，增加管腔膜对钾离子和钠离子的渗透性，同时激活基底侧的Na+/K+泵，增加对钠离子和水的重吸收，同时排出更多的钾离子到尿液中。2)刺激集尿管对氢离子的分泌，调控血浆中碳酸氢根的浓度，保持酸碱平衡。3)通过垂体后叶作用于中枢神经系统，刺激抗利尿激素(ADH)的释放，通过直接增加肾小管对水分的重吸收起到保水的作用。
醛固酮是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的一部分，对维持血压稳定起着重要作用。醛固酮的分泌也是通过RAAS调节实现的。当血压降低时，肾小球旁细胞分泌肾素，肾素促进血管紧张素原转变成血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ经血管紧张素转化酶(ACE)转化成血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ促进血管收缩升高血压。同时血管紧张素Ⅱ作用于肾上腺皮质增加醛固酮的分泌，进而升高血压。
继发性高血压检验项目的临床应用是临床医生评估受检者高血压病因诊断、治疗、预后判断的重要依据。继发性高血压常与肾素-血管紧张素II-醛固酮系统(RAAS)中的肾素(Renin)、醛固酮(Aldosterone)、血管紧张素II(Angiotensin II)，和下丘脑-垂体-肾上腺系统(HPA)中的促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(Cortisol)的异常有关。如原发性醛固酮增多症和库欣氏综合征。原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)是临床上最常见的内分泌性高血压原因,其致病机制主要为由于肾上腺皮质肿瘤或增生、分泌过量的醛固酮,从而导致水钠储留、血容量增加、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem)活性受抑制,临床表现主要为高血压、低血钾。近年的研究发现,过多醛固酮可以通过多个途径导致心肌肥厚、心力衰竭和肾功能受损、甚至胰岛素抵抗,是心血管事件的独立危险因素。在过去多数学者认为原发性醛固酮增多症在高血压患者中所占比率不到1％，目前研究资料显示原发性醛固酮增多症在高血压患者中所占比率要超过10％。对血浆中醛固酮的定量检测，可以辅助诊断原发性、继发性醛固酮增多症、肾上腺肿瘤等疾病，帮助寻找高血压和低血钾的病因。
近年来，随着高血压发病率的提高，临床检验越来越重视对肾素-血管紧张素-醛固酮系统的各项检测。针对醛固酮的定量检测，市场上出现以免疫学为基础的放射免疫法(RIA)、酶联免疫法、化学发光法等检测试剂盒。其中，RIA法有灵敏度高、特异性强等优点，但其缺点试剂的半衰期、费用高及废物处理等问题也在一定程度上限制了它的应用。酶联免疫法和化学发光法因检测快速简便而在临床上应用广泛。
气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)是近年来发展较快的化学分析方法，这些方法可以克服类似物交叉反应等问题。因这些方法需要对生物样品进行前处理，所消耗时间及花费使其在临床检测的应用上受到一定的限制。
醛固酮在人血浆中的浓度较低，为皮克每毫升级别，且其物质结构本身不易被质子化，使之在GC-MS和LC-MS/MS上的准确定量检测成为一个难题。特别是GC-MS检测法，需对样品需要做衍生化等处理，而LC-MS检测法则无需复杂的衍生步骤。随着液质仪器的在灵敏度等方面的提高，超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)对醛固酮的检测在2005年以后得到较多的关注与研究。有多篇外文文献报道液质方法检测人血浆或血清样本中醛固酮，2008年Yamashita等利用安捷伦1100HPLC系统串联AB Sciex API 3000三重四级杆质谱(PESciex)建立了一个高灵敏度的醛固酮定量方法，实现了对醛固酮的准确测定。Taylor等在2009年开发并验证了一个在线半自动化的醛固酮液相色谱串联质谱的测定方法。2014年Das等利用高效液相色谱串联质谱检测醛固酮，并做了两种抗压药物的研究。2015年Meunier等也开发并验证了醛固酮的HPLC-MS/MS测定方法，该测定方法的批内批间精密性＜10％，线性范围为1.44×10-5μg/mL-1.175×10-3μg/mL。
赛默飞公司的QE质谱仪是新兴的一种高分辨质谱仪。QE结合高选择性四极杆离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数(HR/AM)测量技术，在分辨率、扫描速度和灵敏度上进一步提升，可进行高通量的目标物或非目标物筛选，实现高可靠性的确证定量分析。但至今未见有利用赛默飞QE质谱仪检测人血浆样本中的醛固酮方法的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法，可有效解决利用质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的问题。
本发明解决的技术方案是，本发明方法包括以下步骤：
(1)、配制标准品工作液和内标物工作液：
将醛固酮标准品用甲醇溶解，制成梯度质量浓度为2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL的醛固酮标准品工作液；
取内标物Aldosterone-D7用甲醇溶解制成质量浓度2×10-5μg/mL的内标物工作液；
(2)、血浆样本(即待测血浆)处理：
取血浆样本加入内标物工作液混匀，后加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，上清液过活化的HLB固相萃取柱，待上清液全部流出，用水淋洗两次，抽干，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，吹干，得抽提物，抽提物用甲醇水溶液复溶，过滤，滤液用液相色谱-质谱仪检测；
所述的蛋白沉淀剂是：0.5mol/L乙酸锌溶液和甲醇以体积比计1︰5混合在一起制成；
(3)、设定液相色谱-质谱仪的检测条件：
检测用的液相色谱-质谱仪为赛默飞QE质谱仪(赛默飞公司生产的QE质谱仪)，液相色谱条件为：
色谱条件：
色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱；柱温：30℃；流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵水溶液；进行梯度洗脱，流速：0.3mL/min；进样体积：20μL；
质谱条件
离子模式：ESI-；蒸发温度：350℃；喷雾电压：2500V；鞘气：45psi；辅助气：15psi；质量扫描范围：133.4～2000m/z；检测模式：全扫描自动触发二级扫描(Full MS-MS2)；一级扫描分辨率：70000，二级分辨率：17500；
Aldosterone
定性离子对：359.19>331.19，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：359.19>189.10，碰撞电压：25.00eV
Aldosterone-D7
定性离子对：366.23>194.12，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：366.23>338.23，碰撞电压：25.00eV
(4)、检测血浆中痕量醛固酮：
根据醛固酮在液相色谱-质谱仪检测条件下的响应量，以醛固酮标准品工作液的6个浓度作为工作点，每一浓度点中的内标物含量均为1.6×10-6μg/mL；
将血浆样本用赛默飞QE质谱仪测出的结果与已知浓度的6个工作点的醛固酮标准品工作液的标准曲线进行比较，即可得出未知样本中的醛固酮浓度，实现血浆中痕量醛固酮的检测。
本发明方法简单，易操作，检测准确，效果好，可有效解决血浆中痕量醛固酮的检测，为免疫检测筛选合适原材料(抗原、抗体)、提高检测特异性等提供技术支持，也为临床诊断和医药研究提供科学依据，具有很强的实际应用价值，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2本发明血浆样本中醛固酮的抽提与纯化工艺流程图。
图3标准品和血浆样本检测图谱。
图4、图5为醛固酮两种标准曲线线性相关系数R2≥0.999，线性回归方程图。
图6本发明标准品在仪器中的定量限图。
图7为10种类似物在醛固酮检测方法下的离子图。
图8为10种类似物和醛固酮标准品共同检测的离子图。
图9为氢化泼尼松和醛固酮离子图。
图10为氢化泼尼松离子图。
图11为可的松和醛固酮的离子图。
图12为可的松离子图。
具体实施方式
以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)、配制标准品工作液和内标物工作液：
将冻存的醛固酮标准品5.0mg，恢复至室温，用色谱级甲醇溶解成质量浓度为100μg/mL的醛固酮标准品母液，再用色谱级甲醇进行梯度稀释至2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，成醛固酮标准品工作液；
取内标物Aldosterone-D7 5.0mg，用色谱级甲醇溶解成质量浓度为500μg/mL作为内标物母液，再用色谱级甲醇稀释至2×10-5μg/mL，成内标物工作液；
(2)、血浆样本处理：
取1mL血浆样本置于10mL的离心管里，加入2×10-5μg/mL的内标物工作液40μl，放振荡器中振荡1小时充分混匀，后加入2mL的蛋白沉淀剂，涡旋1min，5000r/min离心10min，上清液过HLB固相萃取柱；
HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化，将上述离心后的上清液转移至HLB固相萃取柱中，待上清液全部流出后用3mL水淋洗两次，使柱体保持抽干5min，3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃，氮气吹干，得抽提物，抽提物用质量浓度30％甲醇水溶液0.5mL复溶，过0.22μm滤膜后，滤液用液相色谱-质谱仪检测；
(3)、设定液相色谱-质谱仪的检测条件：
检测用的液相色谱-质谱仪为赛默飞QE质谱仪(赛默飞公司生产的QE质谱仪)，液相色谱条件为：
色谱条件：
色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱，50×2.1mm，1.9μm；柱温：30℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.1mmol/L乙酸铵水溶液；色谱梯度为：0min，30％A相和70％B相；2.5min，30％A相和70％B相；4min，80％A相和20％B相；4.1min，80％A相和20％B相；8min，30％A相和70％B相，流速：0.3mL/min；进样体积：20μL；
质谱条件
离子模式：ESI-；蒸发温度：350℃；喷雾电压：2500V；鞘气：45psi；辅助气：15psi；质量扫描范围：133.4～2000m/z；检测模式：全扫描自动触发二级扫描(Full MS-MS2)；一级扫描分辨率：70000，二级分辨率：17500；
Aldosterone
定性离子对：359.19>331.19，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：359.19>189.10，碰撞电压：25.00eV
Aldosterone-D7
定性离子对：366.23>194.12，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：366.23>338.23，碰撞电压：25.00eV
(4)、检测血浆中痕量醛固酮：
根据醛固酮在液相色谱-质谱仪检测条件下的响应量，以醛固酮标准品工作液的6个浓度作为工作点，这些工作点覆盖检测浓度的范围在低值区域的点更多，6个工作点的浓度为：2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，其每一浓度点中的内标物含量均为1.6×10-6μg/mL；
将血浆样本用赛默飞QE质谱仪测出的结果与已知浓度的6个工作点的醛固酮标准品工作液的标准曲线进行比较，即可得出未知样本中的醛固酮浓度，实现血浆中痕量醛固酮的检测。
本发明经试验和实地应用，具有操作方便，实用性强，准确、稳定可靠，可有效用于对血浆中醛固酮痕量的检测，开拓了血浆中醛固酮痕量检测的新途径，为免疫检测筛选合适原材料(抗原、抗体)、提高检测特异性等提供技术支持，也为临床诊断和医药研究提供技术支撑和科学依据，有关试验资料如下：
1材料、试剂、仪器
醛固酮标准品：Sigama公司，Aldosterone，分子式：C21H28O5分子量：360.44，结构式：
内标物：Sigama公司，aldosterone-2,2,4,6,6,21,21-d7，分子式：C21D7H21O5分子量：367.49，结构式：
试剂：色谱级甲醇、纯水(去离子水)、乙酸锌、乙酸铵。
蛋白沉淀剂：0.5mol/L乙酸锌溶液：甲醇(V/V,1:5)；复溶液：30％甲醇-水溶液
仪器：赛默飞液相色谱-高分辨质谱仪(Thermo Fisher/Q Exactive)，24位固相萃取装置(德国CNW公司)，OASIS HLB固相萃取柱(3mL/60mg，美国Waters公司)。
2.醛固酮标准品和内标物工作液的配制
取出冻存的醛固酮标准品，恢复至室温。取一个干净的50mL容量瓶，置十万级电子天平上调零，用吸水纸擦干净小药匙，称取醛固酮纯品放置容量瓶底部，尽量避免醛固酮纯品粉末沾到容量瓶上部，共称5.0mg，色谱级甲醇溶解，甲醇定容到50mL，上下颠倒混匀。醛固酮标准品母液最终浓度为100μg/mL，取一定量的保存液，稀释至2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，将其作为醛固酮标准品；
称取5.0mg的Aldosterone-D7，用色谱级甲醇溶解，容量瓶定容到50mL，上下颠倒混。Aldosterone-D7保存液最终浓度为500μg/mL。取一定量的Aldosterone-D7保存液，稀释至2×10-5μg/mL，将其作为内标物工作液。
3.3样本前处理(见图2)
样本前处理主要包括血浆蛋白沉淀和固相萃取柱抽提两个步骤。
取1mL血浆样本置于10mL的离心管里，加入2×10-5μg/mL的内标40μl，放振荡器中振荡1小时，使内标与样本中充分混匀。后加入2mL的蛋白沉淀剂，涡旋1min，5000r/min离心10分钟，上清液待过固相萃取柱；
HLB柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将上述离心后的上清液转移至固相萃取柱中，待样液全部流出后用3mL水淋洗两次，使柱体保持抽干5min，3mL甲醇洗脱，洗脱步骤取干净玻璃管收集洗脱液，40℃，氮气吹干。氮气吹干的抽提物质用0.5mL 30％甲醇-水溶液复溶，过0.22μm滤膜，转移至进样小瓶待进液相色谱-质谱仪检测。
4仪器条件：
4.1液相色谱条件
Ultimate 3000液相色谱系统色谱条件：色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱，50×2.1mm，1.9μm；柱温：30℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.1mmol/L乙酸铵水溶液。色谱梯度为：0min，30％A相和70％B相；2.5min，30％A相和70％B相；4min，80％A相和20％B相；4.1min，80％A相和20％B相；8min，30％A相和70％B相。流速：0.3mL/min；进样体积：20μL。
4.2QE质谱条件
离子模式：ESI-；蒸发温度：350℃；喷雾电压：2500V；鞘气：45psi；辅助气：15psi；质量扫描范围：133.4～2000m/z；检测模式：全扫描自动触发二级扫描(Full MS-MS2)；一级扫描分辨率：70000，二级分辨率：17500。
Aldosterone
定性离子对：359.19>331.19，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：359.19>189.10，碰撞电压：25.00eV
Aldosterone-D7
定性离子对：366.23>194.12，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：366.23>338.23，碰撞电压：25.00eV
5标准品和样本检测(见图3)
根据醛固酮在仪器条件下的响应量，标准曲线选择了6个点，这6个点覆盖检测浓度范围更广，在低值区域的点更多，6个浓度点：2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，这6个点由醛固酮的母液梯度稀释而成，其每一浓度点中的内标含量为1.6×10-6μg/mL。
在液相色谱条件和QE质谱条件下，将标准曲线6个点和制备好的样本溶液进仪器检测。根据已知浓度的标准曲线计算未知样本中的醛固酮浓度。
6方法准确性验证
6.1标准曲线的线性回归方程与相关系数(见图4、图5)
标准曲线线性相关系数R2≥0.999，线性回归方程如图4、图5：
6.2定量限(LOQ，见图6)
血浆样本中的醛固酮含量极低，醛固酮分子结构在液质上较难质子化，且响应值与仪器本身的灵敏度也有很大关系，定量限为响应信号与噪音信号比为S/N＝10时的标准品浓度值，该方法下，检测3×10-5μg/mL的标准品时，信噪比为S/N＝46，以此计算信噪比为10时的LOQ＝6.5×10-6μg/ml。
6.3准确度和基质效应(见表1)
基质效应是指除被测量以外的样品特性，对特定测量程序测定被测量及其测量值的影响。在该研究中，采取HLB固相萃取小柱对血浆进行抽提、纯化。HLB柱具有较好的除盐、除杂效果，抽提后的物质用液质的流动相溶液进行复溶。
加标回收率，是在定值血浆中加入不同浓度梯度的标准品，仪器检测换算回收率。它可以验证所建方法的准确性，在一定程度上可以表明检测是否有其他物质干扰，同时也可以作为一种简单直接的测定基质效应的方法。
选定一已知浓度的血浆，加入3种梯度浓度的标准品作为3组，每组至少两管，与血浆样本做同样的抽提、纯化处理，随后进液质仪器检测，计算回收率。
表1加标回收率
注：单位为μg/mL
6.4精密度实验(见表2)
以天为单位分组，设立3组，每组包含3种不同浓度的血浆，每一浓度血浆至少3管。前处理方法同血浆样本制备。
表2精密度实验
单位：μg/mL
6.5干扰实验(见表3、图9-12)
类固醇类激素有着相同的甾体环，其合成途径复杂，中间代谢产物较多。醛固酮作为其中的一种，有较多的同分异构体和结构类似物，免疫检测方面会有较多的交叉干扰反应，影响检测的特异性。LC-MS/MS检测可以对待测物进行结构确证，排除类似物的干扰，所以是很多种分析物检测的决定性方法。
本发明在实验中，对醛固酮代谢物或其他类固醇的代谢物进行分析，以确定这些物质是否会干扰醛固酮的定量检测。在液质检测中，将各代谢类似物标准品制备成混标，具有相同分子量的物质，结构上的差异影响它们在色谱柱上的保留时间，通过液相色谱达到分离不同物质的目的。对分子量不同而结构类似的物质，质谱的多反应选择检测模式可以将其与醛固酮分子区分开来。
在本实验中根据目标物的性质和检测仪器的特点，选取了以下10种可能对目标物产生干扰的物质对所建立目标物检测方法进行验证。
表3 10种类似物
编号 名称 分子式 分子量
1# Prednisolone C21H28O5 360.44
2# Cortisone C21H28O5 360.44
3# Hydrocortisone C21H30O5 362.46
4# Dehydroisoandosterone C19H28O2 288.42
5# 5β-PREGNAN-3α,11β,17,21-TETROL-20-ONE C21H34O5 366.49
6# 5β-PREGNAN-3α,17,20α-TRIOL C21H36O3 336.51
7# 4-PREGNAN-17,20β,21-TRTOL-3,11-DIONE C21H30O5 362.5
8# 4-PREGNEN-11β,17,20β,21-TETROL-3-ONE C21H32O5 364.48
9# 4-PREGNEN-17,20α,21-TEIOL-3,11-DIONE C21H30O5 362.46
10# 3α-Hydroxy-5β-tetrahydroaldosterone C21H32O5 364.49
从图9和图10可以看出，10种醛固酮干扰物中母离子为359的物质在全扫描条件下有峰出现，与醛固酮有相近的保留时间，有可能影响到醛固酮的定量检测。后续对氢化泼尼松和可的松进行了单独检测，以验证是否对醛固酮检测有影响。
由图11和图12可看出，氢化泼尼松和醛固酮出峰时间不同，可以区分开来。并且，氢化泼尼松在正离子模式下离子碎片较少，对其的检测应选择正离子模式。故氢化泼尼松在该检测方法下不会对醛固酮检测造成影响。
同样，对于分子量和醛固酮相同的可的松这种物质，其分子量360.44，负离子模式下，离子对为359.20＞329.10，359.20＞301.10，二者在液相条件下出峰时间不一致，可以区分开来，且醛固酮的离子对为359.19＞331.19，359.19＞189.10，质谱条件下也可区分，故可的松也不会对醛固酮的检测有影响。
并按上述实验方法，经多次反复试验(12次待测血浆进行检测试验)均取得了相同或相近似的结果，表明方法稳定可靠，检测准确，具有可行性。
结论
Oasis HLB固相萃取柱是独特创新的水可浸润性反相吸附剂，可提取复杂样品中各种不同的酸性、碱性和中性化合物，同时去除样品中不保留的基质组份(如：盐、糖、极性脂质、蛋白质等)，具有高吸附容量、高保留能力、宽PH0-14范围的优点，广泛应用于食品、药品、环境样品以及生物样品中目标化合物的样品前处理。该检测技术中采用Oasis HLB柱对样本中的醛固酮进行纯化与抽提，有效去除了血浆样本中的复杂基质组分，抽提效率高，重复性好。
本发明采用赛默飞QE(Thermo Fisher/Q Exactive，配备的液相系统为ThermoUltiMate3000)仪器为主要检测工具。Q Exactive是以高分辨静电场轨道阱orbitrap为核心的串联质谱，具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可快速正负切换扫描等优点，可有效提高代谢物研究的分析通量和分析效果，尤其对于复杂基体中的痕量代谢组分的识别效率好、同时定性和定量能力强，适用于小分子激素、多肽、蛋白类物质的检测。
在本发明检测方法中，醛固酮在仪器中的响应量远高于其他质谱仪器，其定量限LOQ达到6.5×10-6μg/ml，可以满足对血浆中含量极低的醛固酮准确定量检测的需求。制备的6个点的标准曲线，从2×10-5μg/mL到2×10-3μg/mL，涵盖了临床检测中高、低值。标准曲线的线性相关性系数R2≥0.999，这表明所建立的标准曲线具有非常好的线性相关性，为醛固酮的准确定量奠定了良好的基础。在连续3天的精密度实验中，高、中、低值样本每个样本做3个重复。高值样本的不精密度为2.09％，低值样本的不精密度小于5％，远远低于一般临床不精密度要求(≤15％)。在加标回收实验中，在固定的血浆样本中加入了不同倍数的标准品，检测结果表明，不同添加量的回收率在95％-105％间，这个回收率也高于临床要求(85％-115％)。同时，加标回收实验也证明样本抽提纯化后进仪器检测没有明显基质效应。在干扰检测实验里，所选择的类似物与目标物醛固酮具有相同的甾体母环，其中氢化泼尼松和内源性的可的松与醛固酮具有相同的分子量。该检测方法中，优化后的液相色谱梯度流动相成功的将氢化泼尼松、可的松与醛固酮分离开，三者具有不同的出峰时间。质谱分析仪将与醛固酮分子量不同的物质有效区分。这10种类似物对醛固酮的定量检测没有干扰。
本发明方法实现了对血浆样本中醛固酮的准确定量检测，可为医院临床检验开展醛固酮质谱检测提供一种新模式。同时，对体外诊断企业醛固酮免疫检测试剂盒的开发与量值确认具有重要的指导意义，有显著的经济和社会效益。

Claims (2)

1.一种利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、配制标准品工作液和内标物工作液：
将醛固酮标准品用甲醇溶解，制成梯度质量浓度为2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL 、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL的醛固酮标准品工作液；
取内标物Aldosterone-D7用甲醇溶解制成质量浓度2×10-5μg/mL的内标物工作液；
（2）、血浆样本处理：
取血浆样本加入内标物工作液混匀，后加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，上清液过活化的HLB固相萃取柱，待上清液全部流出，用水淋洗两次，抽干，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，吹干，得抽提物，抽提物用甲醇水溶液复溶，过滤，滤液用液相色谱-质谱仪检测；
所述的蛋白沉淀剂是：0.5mol/L乙酸锌溶液和甲醇以体积比计1︰5混合在一起制成；
（3）、设定液相色谱-质谱仪的检测条件：
检测用的液相色谱-质谱仪为赛默飞QE质谱仪，液相色谱条件为：
色谱条件：
色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱；柱温：30℃；流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵水溶液；进行梯度洗脱，流速：0.3 mL/min；进样体积：20 µL；
质谱条件
离子模式：ESI-；蒸发温度：350℃；喷雾电压：2500V；鞘气：45psi；辅助气：15psi；质量扫描范围：133.4~2000m/z；检测模式：全扫描自动触发二级扫描；一级扫描分辨率：70000，二级分辨率：17500；
Aldosterone
定性离子对：359.19>331.19，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：359.19>189.10，碰撞电压：25.00eV
Aldosterone-D7
定性离子对：366.23>194.12，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：366.23>338.23，碰撞电压：25.00eV
（4）、检测血浆中痕量醛固酮：
根据醛固酮在液相色谱-质谱仪检测条件下的响应量，以醛固酮标准品工作液的6个浓度作为工作点，每一浓度点中的内标物含量均为1.6×10-6μg /mL；
将血浆样本用赛默飞QE质谱仪测出的结果与已知浓度的6个工作点的醛固酮标准品工作液的标准曲线进行比较，即可得出未知样本中的醛固酮浓度，实现血浆中痕量醛固酮的检测。
2.根据权利要求1所述的利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、配制标准品工作液和内标物工作液：
将冻存的醛固酮标准品5.0mg，恢复至室温，用色谱级甲醇溶解成质量浓度为100μg/mL的醛固酮标准品母液，再用色谱级甲醇进行梯度稀释至2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL 、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，成醛固酮标准品工作液；
取内标物Aldosterone-D7 5.0mg，用色谱级甲醇溶解成质量浓度为500μg/mL作为内标物母液，再用色谱级甲醇稀释至2×10-5μg/mL，成内标物工作液；
（2）、血浆样本处理：
取1mL血浆样本置于10mL的离心管里，加入2×10-5μg/mL的内标物工作液40μl，放振荡器中振荡1小时充分混匀，后加入2mL的蛋白沉淀剂，涡旋1min，5000r/min离心10min，上清液过HLB固相萃取柱；
HLB固相萃取柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，将上述离心后的上清液转移至HLB固相萃取柱中，待上清液全部流出后用3 mL水淋洗两次，使柱体保持抽干5 min，3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃，氮气吹干，得抽提物，抽提物用质量浓度30%甲醇水溶液0.5mL复溶，过0.22μm滤膜后，滤液用液相色谱-质谱仪检测；
（3）、设定液相色谱-质谱仪的检测条件：
检测用的液相色谱-质谱仪为赛默飞QE质谱仪，液相色谱条件为：
色谱条件：
色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱，50×2.1mm，1.9μm；柱温：30℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.1mmol/L乙酸铵水溶液；色谱梯度为：0min，30% A相和70%B相；2.5min，30% A相和70%B相；4min，80% A相和20%B相；4.1min， 80% A相和20%B相；8min，30% A相和70%B相，流速：0.3 mL/min；进样体积：20 µL；
质谱条件
离子模式：ESI-；蒸发温度：350℃；喷雾电压：2500V；鞘气：45psi；辅助气：15psi；质量扫描范围：133.4~2000m/z；检测模式：全扫描自动触发二级扫描；一级扫描分辨率：70000，二级分辨率：17500；
Aldosterone
定性离子对：359.19>331.19，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：359.19>189.10，碰撞电压：25.00eV
Aldosterone-D7
定性离子对：366.23>194.12，碰撞电压：25.00eV
定量离子对：366.23>338.23，碰撞电压：25.00eV
（4）、检测血浆中痕量醛固酮：
根据醛固酮在液相色谱-质谱仪检测条件下的响应量，以醛固酮标准品工作液的6个浓度作为工作点，这些工作点覆盖检测浓度的范围在低值区域的点更多，6个工作点的浓度为：2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL 、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，其每一浓度点中的内标物含量均为1.6×10-6μg /mL；
将血浆样本用赛默飞QE质谱仪测出的结果与已知浓度的6个工作点的醛固酮标准品工作液的标准曲线进行比较，即可得出未知样本中的醛固酮浓度，实现血浆中痕量醛固酮的检测。
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