CN106755386A

CN106755386A - 一种畜禽源大肠杆菌β‑内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN106755386A
Application number: CN201611157570.7A
Authority: CN
Inventors: 程振涛; 马光强; 周碧君; 文明; 王开功; 岳筠; 李毅
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明涉及一种畜禽大肠杆菌对β‑内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物、模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂。较传统药敏试验，该多重方法将检测时间从数天缩短至1天内完成。病原菌经常含有多种β‑内酰胺酶基因，而该技术满足了同时检测多种基因的需求，提高了检测效率、准确性和特异性。

Description

一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒及其使用方法

发明领域

本发明涉及大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术，属于医学分子生物学领域，具体是关于畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术方法及其在畜禽大肠杆菌耐药性检测中的应用。

背景技术

β-内酰胺类药物是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类药物，包括青霉素、头孢菌素、头霉素、单环β-内酰胺类、β-内酰胺酶阻滞剂以及碳青霉烯类药物。各种β-内酰胺类抗生素的作用机制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类抗生素的广泛使用和致病菌的变迁，产生了细菌对这类抗生素的耐药性问题，细菌产生超广谱β-内酰胺酶是大部分细菌耐药的原因之一。

根据氨基酸序列的同源性，β-内酰胺酶可分为不同基因型。目前可分为TEM、SHV、CTX-M、OXA等基因型，其中以TEM和SHV两种基因型最多，呈世界性分布，不同地区的基因型有差异。例如：美国主要流行TEM和SHV型；阿根廷以CTX-M型为主；西班牙以CTX-M-10为主，其次是SHV-2和TEM-4；希腊以SHV-5为主，其次是CTX-M型；我国主要流行TEM、SHV、CTX-M型。本专利在以畜禽大肠杆菌分子流行病学调查的基础上，建立了TEM、SHV、CTX-M型β-内酰胺酶耐药基因多重PCR检测方法。

传统的细菌耐药性检测方法主要有常规药敏试验、抗性蛋白检测方法和耐药性分子检测方法等。这些方法的特点是易操作、成本低，药物可灵活选择，缺点是操作繁琐、经验依赖性强、报告结果慢。因为抗菌药物的广泛使用及耐药基因的多样性、复杂性，单一临床病原菌经常含有多个耐药基因，为了提高检测的准确性和特异性，需要对多种耐药基因进行检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种快速检测畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的三重PCR检测试剂盒及其特异性引物、使用方法，能显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性的检测灵敏度和检测效率，降低检测成本，以克服现有技术存在的成本高、耗时长等诸多不足。

本发明的技术内容：一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒，含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂，所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL～50mL和处理液2.5mL～5.0mL组成，所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCR MasterMix 650μL～1300μL，耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL～800μL，灭菌双蒸水1mL～2mL和阴性对照100μL～200μL、阳性对照100μL～200μL。

所述耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下：

CTX-M：For：5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3；

Rev-1：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3；

TEM：For：5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3；

Rev-2：5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3；

SHV：For：5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3；

Rev-3：5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。

本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤：

PCR模板的制备方法：

(1)普通培养基摇瓶培养增菌；

(2)取1mL经3-6h培养的菌液于无菌1.5mL EP管中，8000r/min离心3分钟，弃上清，再加入1mLPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入100μLPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。

畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成：

(1)取2xTaqPCR MasterMix 25μL、耐药基因引物2.9μL于无菌PCR反应薄壁管中。

(2)加入已制备好模板2μL，用灭菌双蒸水补至50μL即可；

PCR扩增参数为：

(1)95℃预变性5min；

(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共35个循环，

(3)72℃延伸7min，取出至4℃保存备用；

耐药基因检测结果判定:取8μLPCR产物，于1.2％琼脂糖凝胶中电泳，100V电压，电泳30min，于凝胶成像仪下拍照判定结果，其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。

本发明有益效果：本发明将显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的检测效率；本发明所建立试剂盒适用于检测畜禽源致病大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性，能实现临床病例和产品污染程度的快速评价，为该类疾病的防控提供技术支持与理论依据，并为动物性食品安全检测提供可靠技术。

本发明与现有技术相比，具有以下技术效果和特点：

(1)便捷性好：本发明以PCR为技术基础，相比传统病原分离鉴定、药物敏感试验，不仅能提高检测效率，还降低了检测成本，缩短了检测时间，该多重方法将检测时间从数天缩短至1天内完成。

(2)特异性好：本发明应用分子生物学技术，针对特定基因设计引物，保证检测结果的特异性。

(3)敏感性高：本发明基于PCR技术建立的PCR试剂盒，可检测病原核酸量最低至1.0×10³copies/μL。

本发明所提供的多重PCR技术正满足了对多种耐药基因进行检测的需求，并具有敏感、特异、快速等优点，可以对微量目的基因进行检测，具有灵敏高效的特点。本发明设计了3对特异性引物，构建多重PCR反应体系，以达到快速检测β-内酰胺类耐药基因的目的，多重PCR技术最有研究前景和应用价值。

附图说明

图1为本发明畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的制备流程图。

具体实施方式

本发明所述畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂，其特征在于：所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL～50mL和处理液2.5mL～5.0mL组成，所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCR MasterMix 650μL～1300μL，耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL～800μL，灭菌双蒸水1mL～2mL和阴性对照100μL～200μL、阳性对照100μL～200μL。

所述三种耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下：

CTX-M：For：5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3

Rev-1：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3

TEM：For：5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3

Rev-2：5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3

SHV：For：5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3

Rev-3：5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3

本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤：

PCR模板的制备方法：

(1)普通培养基摇瓶培养增菌；

(2)加入已制备好模板2μL，用灭菌双蒸水补至50μL即可。

PCR扩增参数为：

(1)95℃预变性5min；

(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共33个循环，

(3)72℃延伸7min，取出至4℃保存备用。

耐药基因检测结果判定:

取8μLPCR产物，于1.2％琼脂糖凝胶电泳中，100V电压，电泳30min，于凝胶成像仪下拍照判定结果，450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。

详细示例：

1、配制反应液

(1)配制引物混合液

A.设计并合成引物针对大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因，用软件Primer Premier 5.0分别设计一对特异性引物，并合成引物。

B.制备引物混合液将三对引物稀释至浓度10μmol/L后，各取100μL，混匀。

(2)多重PCR反应缓冲液

取适量Taq Polymerase、dNTP each、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、MgCl₂储备液溶于500μL双蒸水，使Taq Polymerase终浓度为0.1U/μl、dNTP each终浓度为500μmol/L、Tris-HCl(pH8.3)终浓度为20mmol/L、KCl终浓度为100mmol/L、MgCl₂终浓度为3mmol/L。于-20℃备用。

2、制备阴/阳性对照

(1)制备阳性对照

取普通营养琼脂培养基中大肠杆菌β-内酰胺类药物3种耐药株单个菌落分别接种于普通营养液体培养基中培养24h的培养液1.5mL以4℃10000r/min离心1min，弃上清，提取3种大肠杆菌耐药菌株基因组DNA。

(2)制备阴性对照

以灭菌超纯水为阴性对照。

3、检测过程

(1)反应体系

取无菌PCR反应管，按表1所示依次加入所需试剂；

表1 试剂添加及用量

试剂及添加量	阳性对照	阴性对照	待检样本
				反应缓冲液	25μL	25μL	25μL
引物混合液	2.9μL	2.9μL	2.9μL
				阳性对照	3μL	0	0
阴性对照	0	3μL	0
				待检样本	0	0	1μL～3μL
灭菌超纯水	补足50μL	补足50μL	补足50μL

(2)反应程序

将PCR反应管混匀瞬时离心后，加入20μL灭菌液体石蜡覆于液面上，并置PCR反应管于PCR扩增仪中，以95℃预变性5min；95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共35个循环；72℃延伸7min，取出至4℃保存备用。

(3)结果判定

取8μL扩增产物以1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定：阳性对照应出现清晰的目的条带，阴性对照无任何条带出现；若待检扩增模板出现与阳性对照相同条带，则判定待检样本阳性，若无任何条带出现则判定待检样本阴性。根据耐药基因片段大小与所示阳性对照基因一致性，判定是存在哪种耐药基因。

Claims

1.一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于：含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂，所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL～50mL和处理液2.5mL～5.0mL组成，所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCRMasterMix 650μL～1300μL，耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL～800μL，灭菌双蒸水1mL～2mL和阴性对照100μL～200μL、阳性对照100μL～200μL。

2.根据权利要求1所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下：

CTX-M：For：5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3；

Rev：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3；

TEM：For：5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3；

Rev：5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3；

SHV：For：5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3；

Rev：5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。

3.如权利要求1或2所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

PCR模板的制备方法：

(1)普通培养基摇瓶培养增菌；

(2)取经3-6h培养的菌液于无菌EP管中，离心，弃上清，再加入PCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入PCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用；

(1)取2xTaqPCR MasterMix、耐药基因引物于无菌PCR反应薄壁管中。

(2)加入已制备好模板，用灭菌双蒸水补至50μL即可；

PCR扩增参数为：

(1)95℃预变性5min；

(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共35个循环，

(3)72℃延伸7min，取出至4℃保存备用；

耐药基因检测结果判定:取PCR产物，于1.2％琼脂糖凝胶中电泳，100V电压，电泳30min，于凝胶成像仪下拍照判定结果，其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。