CN106755102A - 一种58型hpv病毒e6/e7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过检索NCBI 58型HPV病毒基因组序列，获取其E6及E7基因序列信息，以47‑941位点区域构建58型HPV病毒E6及E7致癌基因共同标准品质粒，参照所得目的基因序列，分别在上述位点区域内设计58型HPV病毒E6、E7荧光定量PCR特异性引物，利用所得58型HPV病毒E6/E7共同标准品质粒作为参考品，通过相关检测方案检测细胞样品的58型HPV病毒E6及E7致癌基因绝对定量拷贝数。本发明可检测HPV‑58病毒E6基因以及E7基因在细胞样品中的拷贝数，并进行绝对定量，从而对细胞的癌变预后以及干预效果判断提供数据支持。

Description

一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法

技术领域

本发明属于病毒诊断技术领域，具体涉及HPV-58病毒E6/E7致癌基因共同标准对照质粒的构建方案及在细胞样本中E6以及E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是导致宫颈癌的一个重要因素。宫颈癌在妇科肿瘤中发病率居第2位，全球每年新发病例约50万人，死亡例数约25万人。

HPV基因组DNA全长约8kb，包括6个早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)开放式阅读框(open-reading frame，ORF)、2个晚期基因(L1、L2)开放式阅读框及1个非编码长控制区(non-coding long control region，LCR)，其中，E6、E7基因为两个主要的原癌基因。

HPV分为皮肤型和粘膜型2大类。粘膜型HPV主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮，导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系大小，粘膜型HPV分为高危型(high-risk，HR)和低危型(low-risk，LR)。高危型主要有HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66型；而低危型主要有HPV-6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81型。基于分子流行病学和病毒学的研究发现，HPV特别是高危型HPV感染宫颈可发展为宫颈癌，宫颈鳞状细胞癌患者中，58型HPV为其中的一个主要感染亚型，其E6/E7致癌基因的在组织细胞中的拷贝数与肿瘤的发生和发展密切相关。

目前，针对人乳头状瘤病毒基因的实验室检测和研究方面主要采用相对定量PCR检测、核酸杂交检测(包括核酸印迹原位杂交、斑点杂交、杂交捕获等)。这些方法可进行HPV分型，实时PCR检测可以初步对病毒拷贝数进行相对定量。值得注意的是，常用的相对定量检测方法由于没有设计病毒拷贝数的标准对照参比品及绝对定量拷贝数计算体系，因而对于细胞样品中病毒绝对拷贝数的具体信息未能知晓，因而不能为后续的研究和结果解读提供足够的信息。

发明内容

本发明旨在针对58型HPV病毒E6及E7致癌基因构建共同标准品质粒，建立58型HPV病毒E6及E7致癌基因在细胞样品中的绝对定量检测体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，快速断定细胞样品是否受到HPV病毒感染，且对细胞样品中中HPV-58型病毒E6及E7致癌基因DNA拷贝数进行绝对定量，从而为细胞样品后续的研究，样品病毒感染情况和癌变可能的预判解读提供足够的信息。

本发明通过下列技术方案实现：一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，经过下列各步骤：

(1)构建58型HPV病毒E6/E7标准品质粒：

a.根据NCBI数据库中58型HPV(GenBank：D90400.1)基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物：

HPV58E6/E7For：5'-ACG GTC TGA CCG AAA CCG GTG-3'

HPV58E6/E7Rev：5'-ACC TCA AAC CAG CCA GTA CAG-3'

b.HPV-58阳性细胞中总DNA的提取：先将1mL HPV-58阳性细胞保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液【50mM Tris-HCl(pH 8.1)，1mM EDTA，0.5％Tween 20】，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200μL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mL EP管中，-70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；

c.将步骤(1)b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒E6/E7基因，将扩增产物连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；

d.将步骤(1)c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：

Number of copies(copies/μl)＝(Amount×6.022×10²³)/(Length×1×10⁹×650)

其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μl)，Length代表模板DNA长度；

(2)参照步骤(1)c所得的58型HPV病毒目的基因序列分别设计下列58型HPV病毒E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：

HPV58E6For：5'-TGT CAG GCG TTG GAG ACA TC-3'

HPV58E6Rev：5'-ATA GCA ATC GTA AGC ACA CT-3'

HPV58E7For：5'-ACC AAC TGA CCT ATT CTG CTA TG-3'

HPV58E7Rev：5'-ACG TCG GTT GTT GTA CTG TTG AT-3'

(3)利用步骤(1)d所得58型HPV病毒标准品质粒分别检测细胞样品中的E6和E7致癌基因拷贝数，具体检测方法如下：

a.将步骤(1)d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10^-7，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得58型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀作为Y轴绘制58型HPV标准品质粒的标准曲线，进而得到58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的标准曲线方程：

所述PCR反应体系如下：

表1荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μl)

采用的反应程序如下：

b.按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测细胞样品DNA，分别根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得细胞样品中HPV病毒E6及E7致癌基因的绝对定量拷贝数。

所述步骤(3)a中用双蒸水按梯度稀释至10^-7是指将58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒分别用双蒸水稀释成以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

本发明是通过检索NCBI 58型HPV病毒基因组序列，针对58型HPV病毒E6/E7基因，以47-941位点区域构建HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒，即将58型HPV病毒E6/E7基因选定区构建到同一个载体上，建立58型HPV病毒E6/E7致癌基因绝对定量体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，快速断定细胞样品是否受到HPV病毒感染，并对细胞样品中HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数进行绝对定量，从而对细胞癌变的预后判断提供数据参考。

本发明具备的优点和效果：本发明是针对58型HPV病毒E6/E7基因特定区域构建标准品质粒，即将58型HPV病毒E6/E7基因选定区域基因构建到同一个载体上，随后通过建立的58型HPV病毒E6/E7致癌基因荧光定量PCR绝对定量体系进行检测，该E6/E7致癌基因共同标准品对照质粒的构建及检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，来达到对细胞样品中的HPV病毒E6及E7致癌基因DNA拷贝数进行绝对定量的目的，从而对细胞样品癌变预后判断以及干预后对癌变进程的影响提供重要数据参考。

附图说明

图1为58型HPV病毒E6/E7区域基因PCR扩增片段；图中，M：markerDL1200；

图2为荧光定量PCR检测直接获得的58型HPV病毒E6/E7致癌基因标准品质粒及宫颈癌细胞样本中E6基因的扩增曲线；

图3为荧光定量PCR检测直接获得的58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒及宫颈癌细胞样本中E6基因的溶解曲线；

图4为58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒检测E6基因的标准曲线；

图5为荧光定量PCR检测直接获得的58型HPV病毒共同标准品质粒及宫颈癌细胞样本中E7基因的扩增曲线；

图6为荧光定量PCR检测直接获得的58型HPV病毒标准品质粒及宫颈癌细胞样本中E7基因的溶解曲线；

图7为58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒检测E7基因的标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

(1)构建58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒：

a.根据NCBI数据库中58型HPV病毒E6/E7的序列(GenBank:D90400.1)，按表2设计特异性引物，扩增E6/E7区基因序列：

表2 58型HPV病毒E6/E7区域的PCR引物

b.宫颈癌细胞中提取总的DNA：

先将1mL HPV-58阳性组织细胞保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液【50mM Tris-HCl(pH8.1)，1mM EDTA，0.5％Tween 20】，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200μL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mL EP管中，-70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；

c.将步骤(1)b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒E6/E7基因，将扩增产物(见图1)连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV病毒E6/E7目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；

d.将步骤(1)c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：

Number of copies(copies/μl)＝(Amount×6.022×10²³)/(Length×1×10⁹×650)

其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μl)，Length代表模板DNA长度；58型HPV病毒E6/E7标准品质粒DNA Length为3587bp。在该实施例中，紫外分光光度计测得58型HPV病毒E6/E7标准品质粒Amount为228ng/μl，计算得58型HPV病毒E6/E7标准品质粒拷贝数为5.89×10¹⁰copies/μl。

(2)参照步骤(1)c所得58型HPV病毒E6/E7基因目的基因序列设计表3的E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：

表3 58型HPV病毒E6、E7荧光定量PCR引物

(3)利用步骤(1)d所得58型HPV病毒E6/E7标准品质粒检测HPV-58阳性宫颈癌细胞中58型HPV DNA拷贝数，具体检测方法如下：

a.将步骤(1)d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10^-7，即以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别使用58型HPV病毒E6、E7荧光定量PCR引物，按表4PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测分别获得58型HPV E6/E7致癌基因共同标准品质粒检测E6、E7基因的扩增曲线(见图2，图5)与溶解曲线(见图3，图6)，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀(见表5，表6)作为Y轴绘制58型HPV病毒E6/E7标准品质粒的标准曲线(见图4，图7)，进而分别得到58型HPV病毒E6/E7标准品质粒检测E6、E7基因的标准曲线方程：y＝-0.3726x+14.478及y＝-0.5477x+15.597。

所述PCR反应体系如表4：

表4荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μl)

采用的反应程序如下：

表5 58型HPV病毒标准品E6基因检测结果

表6 58型HPV病毒标准品E7基因检测结果

b.按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测HPV-58病毒阳性宫颈癌细胞中提取的总DNA，获得宫颈癌细胞样本中58型HPV病毒E6、E7的扩增曲线(见图2，图5)和溶解曲线(见图3，图6)，根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程(见图4，图7)，进而分别获得宫颈癌细胞中58型HPV病毒E6/E7致癌基因的拷贝数(见表7和表8)：

表7宫颈癌细胞样本中58型HPV病毒E6基因检测结果

表8宫颈癌细胞样本中58型HPV病毒E7基因检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 1

acggtctgac cgaaaccggt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 2

acctcaaacc agccagtaca g 21

<210> 3

<211> 895

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 3

acggtctgac cgaaaccggt gcatatataa agcagacatt ttttggtagg ctactgcagg 60

actatgttcc aggacgcaga ggagaaacca cggacattgc atgatttgtg tcaggcgttg 120

gagacatctg tgcatgaaat cgaattgaaa tgcgttgaat gcaaaaagac tttgcagcga 180

tctgaggtat atgactttgt atttgcagat ttaagaatag tgtatagaga tggaaatcca 240

tttgcagtat gtaaagtgtg cttacgattg ctatctaaaa taagtgagta tagacattat 300

aattattcgc tatatggaga cacattagaa caaacactaa aaaagtgttt aaatgaaata 360

ttaattagat gtattatttg tcaaagacca ttgtgtccac aagaaaaaaa aaggcatgtg 420

gatttaaaca aaaggtttca taatatttcg ggtcgttgga cagggcgctg tgcagtgtgt 480

tggagacccc gacgtagaca aacacaagtg taacctgtaa caacgccatg agaggaaaca 540

acccaacgct aagagaatat attttagatt tacatcctga accaactgac ctattctgct 600

atgagcaatt atgtgacagc tcagacgagg atgaaatagg cttggacggg ccagatggac 660

aagcacaacc ggccacagct aattactaca ttgtaacttg ttgttacact tgtggcacca 720

cggttcgttt gtgtatcaac agtacaacaa ccgacgtacg aaccctacag cagctgctta 780

tgggcacatg taccattgtg tgccctagct gtgcacagca ataaacacca tctgcaatgg 840

atgaccctga aggtacaaac ggggtagggg cgggctgtac tggctggttt gaggt 895

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 4

tgtcaggcgt tggagacatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 5

atagcaatcg taagcacact 20

<210> 6

<211> 166

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 6

tgtcaggcgt tggagacatc tgtgcatgaa atcgaattga aatgcgttga atgcaaaaag 60

actttgcagc gatctgaggt atatgacttt gtatttgcag atttaagaat agtgtataga 120

gatggaaatc catttgcagt atgtaaagtg tgcttacgat tgctat 166

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 7

accaactgac ctattctgct atg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 8

acgtcggttg ttgtactgtt gat 23

<210> 9

<211> 177

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 58

<400> 9

accaactgac ctattctgct atgagcaatt atgtgacagc tcagacgagg atgaaatagg 60

cttggacggg ccagatggac aagcacaacc ggccacagct aattactaca ttgtaacttg 120

ttgttacact tgtggcacca cggttcgttt gtgtatcaac agtacaacaa ccgacgt 177

Claims (3)

1.一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）构建58型HPV病毒 E6/E7致癌基因共同标准品质粒：

a．根据NCBI数据库中58型HPV基因序列，针对E6/E7基因47-941位点区域，按下述设计特异性引物：

HPV58 E6/E7For：5'-ACG GTC TGA CCG AAA CCG GTG-3'

HPV58 E6/E7Rev：5'-ACC TCA AAC CAG CCA GTA CAG-3'

b．宫颈癌细胞中总DNA的提取：先将1 mL HPV-58阳性细胞保存液吸入1.5 mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mL Tris-HCl 洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mL Tris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200 µL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液， 在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mL EP管中，-70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；

c．将步骤（1）b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒 E6/E7基因，将扩增产物连接到pMD-18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；

d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：

Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）

其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；

（2）参照步骤（1）c所得的58型HPV目的基因序列分别设计下列58型HPV病毒 E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：

HPV58 E6For：5'-TGT CAG GCG TTG GAG ACA TC-3'

HPV58 E6Rev：5'-ATA GCA ATC GTA AGC ACA CT-3'

HPV58 E7For：5'-ACC AAC TGA CCT ATT CTG CTA TG-3'

HPV58 E7Rev：5'-ACG TCG GTT GTT GTA CTG TTG AT-3'

（3）利用步骤（1）d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒分别检测宫颈癌细胞中的58型HPV病毒 E6和E7拷贝数，具体检测方法如下：

a．将步骤（1）d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10^-7，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀作为Y轴绘制标准品质粒的标准曲线，进而得到58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的标准曲线方程：

所述PCR反应体系如表1：

表1 荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）

采用的反应程序如下：

b．按步骤（3）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测细胞中HPV病毒DNA，分别根据步骤（3）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌细胞中HPV病毒 E6以及E7致癌基因DNA的绝对定量拷贝数。

2.根据权利要求1所述的绝对定量检测方法，其特征在于：所述步骤（1）58型HPV基因序列在基因库中的收录号为D90400.1。

3.根据权利要求1所述的绝对定量检测方法，其特征在于：所述步骤（3）a中用双蒸水按梯度稀释至10^-7是指将58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒分别用双蒸水稀释成以下梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。