CN106755059B - 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框位于同一双元载体中，crRNA表达框由水稻U3启动子，壮观霉素抗性基因和Poly‑T终止子依次构成；LbCpf1核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的LbCpf1编码序列和35s终止子依次构成。本发明还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。本发明的骨干质粒载体能够用于进行有效地目标片段的基因打靶，获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。
背景技术
水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的产量和品质与国民经济及生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺性状的品种对于水稻生产至关重要。与传统育种方法相比，随着生物技术的不断发展，近些年逐渐成熟的基因打靶技术为水稻产量和品质等关键性状的优化提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)、类转录因子激活物技术(TALEN)和CRISPR/Cas9技术，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。而CRISPR/Cas9技术由于其在靶位点选择上具有一定的局限性，并且其剪切后修复易形成单碱基的缺失或插入，在一定程度上影响了突变体的获得。
近2年发展出的CRISPR/Cpf1技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1能够独自地对crRNA前体进行加工，然后利用成熟的crRNA特异性的识别和剪切DNA。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成带有与Cpf1结合和特异识别靶位点的crRNA，同样可以引导Cpf1切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。目前，在大鼠中已成功实现了基因组的CRISPR/Cpf1定向基因打靶。在植物中还没有利用CRISPR/Cpf1系统实现基因打靶的报道。
发明内容
本发明提供了一种用于水稻基因打靶的基因工程骨干载体。
具体而言，一方面，本发明提供了一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，
包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。
优选地，在所述骨干质粒载体中，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如SeqID No.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1709至1716位所示，
b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至3777位所示；水稻偏好密码子改造后的Cpf1编码序列，其核苷酸序列如Seq IDNo.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第7614至7878位所示。
优选地，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。
另一方面，本发明提供一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，文中称为pHUN611。
另一方面，本发明提供一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有以下5’TTTN-(N)X-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，TTTN中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个(优选地，X为25)；
将所述靶标片段整合到上述的骨干质粒载体中，形成带有所述标靶片段的crRNA。
优选地，所述载体构建包括，
按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-GGCA-(N)X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-(N’)X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)X和反向寡核苷酸中的(N’)X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。
另一方面，本发明提供一种上述重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下，
将所述重组载体转入水稻细胞，使所述水稻细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
优选地，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。
优选地，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
另一方面，本发明提供一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的重组载体导入目标菌落。
本发明所述的基因工程骨干载体是包含T-DNA边界序列的双元载体，在T-DNA左右两个边界内，包含2个表达框：Cpf1基因表达框和crRNA表达框，还可以包括潮霉素抗性基因表达框。在T-DNA边界外的载体骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等结构(图1)。
在本发明中，SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如Seq ID No.1第495位和1701位所示)，用于插入靶标片段。
本发明还提供包含携带所述重组载体的转化子，其中，所用宿主为微生物，具体的为大肠杆菌和农杆菌。
本发明的一个目的是应用所述重组载体，实现目的基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。具体而言，是通过重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，目的基因的双链靶标片段被剪切，诱导水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
所述应用中，crRNA由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和与cpf1结合的骨架片段连接而成。所述crRNA中能与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’TTTN-(N)X-3’中(N)X互补结合的RNA片段。
所述Cpf1核酸酶由SEQ ID No.1中第3786至7607位核苷酸所示DNA转录的RNA片段翻译而成的蛋白质。
所述重组载体转入水稻细胞的方法为：向植物细胞直接导入重组载体的DNA序列，具体如PEG介导的原生质体瞬时转化或农杆菌介导的愈伤组织稳定转化。
所述再生植株，由转化的水稻细胞或组织，如原生质体或愈伤组织分化再生而来。所述应用可获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
为了实现CRISPR/Cpf1系统在水稻基因组中的打靶，在本发明中，采用了水稻U3启动子表达crRNA和ZmUBI启动子驱动水稻偏好密码子化改造的Cpf1基因的组合，并且成功的实现了在水稻中的基因打靶，获得对应的水稻突变体植株。同时，本发明预先将crRNA表达框和Cpf1表达框预置与同一质粒骨架上，简化了针对某一基因构建重组打靶载体的流程。
在一种实现方式中，本发明的骨干质粒载体的核苷酸序列如下(与序列表中SEQID No.1相同)：
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技术效果
本发明的骨干载体将crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框整合在一个双元载体上。简化了载体构建步骤；2、在载体上整合了SPR基因，为载体鉴定提供了抗生素筛选条件，从而简化鉴定步骤。
附图说明
图1为本发明一个实施例中的骨干质粒载体pHUN611的载体示意图；
图2为应用pHUN611-BEL重组载体转入原生质体对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；
图3为应用PHUN611-BEL重组载体通过PEG介导转入原生质体后再生植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；
图4为应用pHUN4c16-BEL重组载体通过农杆菌介导的稳定转化获得的转基因植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。
实施例
骨干质粒载体的设计
具体而言，本发明设计了这样的骨干质粒载体，其包括crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，crRNA表达框包括：水稻U3启动子、壮观霉素抗性基因以及Poly-T终止子。Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子、水稻偏好密码子化改造的Cpf1编码序列和35s终止子。上述序列是该骨干质粒载体的特有部分，其还可以包括一些常规载体所具有的一般结构，这里不再累述。Seq ID NO.1中示出了本发明所设计的骨干质粒载体的一种实现方式。该载体可以采用现有技术中的常规方式来构建。
用于水稻BEL基因打靶的重组载体的制备。
1.1，选择水稻BEL基因(LOC_Os03g55240)中第2463-2487位的核苷酸序列TTTGGAAGAGAGTGACTGCGCTAGCAATC，(下划线部分为所述5’TTTN-(N)X-3’结构中TTTG部分)，作为打靶位点。
1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(BEL KO1 P1)和可与之互补的反向寡核苷酸链(BEL KO1P2)，
具体序列为：
其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除TTTN的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
1.3,经过退火程序，将BEL KO1P1和BEL KO1P2两条链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。
1.4，用BsaI内切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN611载体2小时，65℃失活酶切体系20分钟，作为构建重组载体的骨架片段。
1.5，用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻BEL基因CRISPR/Cpf1打靶的重组载体质粒，命名为pHUN611-BEL。
实施例2、原生质体瞬时转化介导的水稻BEL基因打靶。
2.1,利用PEG法将pHUN611-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Zhang等A highly efficient rice green tissue protoplastsystem for transient gene expression and studying light/chloroplast-relatedprocesses.Plant Method(2011).中公开的实验方法。
2.2，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，在水稻原生质体转化后48小时提取其基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：
Bel KO1 genome check FP:GTGGAGGTCGACATGACTGAAG
BelKO1 genome check RP:TTGCACATTCATACAAATTGGT
2.3，所获PCR扩增片段经电泳回收后，将其克隆至pEASY-T载体(全式金公司)，用M13F引物测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测120个克隆中，40个克隆携带BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为33.3％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图2所示。
2.4，利用PEG法将pHUN611-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，并获得再生水稻植株。水稻原生质体转化和植株再生具体过程参考了文献Hayashimoto等A PolyethyleneGlycol-Mediated Protoplast Transformation System for Production of FertileTransgenic Rice Plants.Plant Physiology(1990).中公开的实验方法。
2.5，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获60棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述Bel KO1 genome check FP和Bel KO1 genomecheck RP。
2.6，以Bel KO1 genome check FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测60棵植株中，9棵植株带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为15.0％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图3所示。
实施例3、农杆菌稳定转基因介导的水稻BEL基因打靶。
3.1，利用冻融法将pHUN611-BEL重组载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，获得阳性克隆。
3.2、成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
3.3、采用上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，ChenguangZhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selectionin Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。共获得34株pHUN611-BEL植株(pHUN611-BEL转基因水稻植株)。
3.4，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获34株pHUN611-BEL转基因水稻植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述Bel KO1 genome check FP和Bel KO1 genome check RP。
3.5，以Bel KO1 genome check FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测34株植株中，14株带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为41.2％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图4所示。
从图4中可以明显看出，利用本发明的载体进行基因打靶可以实现水稻特异位点的基因打靶。
序列表
<110> 安徽省农业科学院水稻研究所
<120> 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
<130> HCI20160266
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13069
<212> DNA
<213> 骨干质粒载体
<400> 1:
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60
aatctgatcc aagctcaagc taagctcacg tgacggaatt aagcttaagg gatctttaaa 120
catacgaaca gatcacttaa agttcttctg aagcaactta aagttatcag gcatgcatgg 180
atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg accatagcac aagacaggcg tcttctactg 240
gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa cactgggtac gttggaaacc acgtgatgtg 300
aagaagtaag ataaactgta ggagaaaagc atttcgtagt gggccatgaa gcctttcagg 360
acatgtattg cagtatgggc cggcccatta cgcaattgga cgacaacaaa gactagtatt 420
agtaccacct cggctatcca catagatcaa agctgattta aaagagttgt gcagatgatc 480
cgtggcaaga gaccaaccca gtggacataa gcctgttcgg ttcgtaagct gtaatgcaag 540
tagcgtatgc gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc 600
gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg 660
gcatccaagc agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac 720
gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa acaaagttaa acatcatggg ggaagcggtg 780
atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa 840
ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac 900
agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct 960
ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct 1020
gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc 1080
gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc 1140
acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg 1200
gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg 1260
ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat 1320
gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag 1380
gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt 1440
gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 1500
ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt 1560
ctagctagaa attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 1620
atgcactaag cacataattg ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt 1680
tttaagcgtg cataataagc cggtctcatt ttttttagta gtagcatctg acggtgggga 1740
agcttgatat cgaattcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa 1800
tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt 1860
gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat 1920
ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg 1980
gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg 2040
catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat 2100
tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat 2160
ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt 2220
atttaataat ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc 2280
ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc 2340
ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc 2400
gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag 2460
ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaatgcgtg gcggagcggc 2520
agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg 2580
gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc 2640
ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga 2700
tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 2760
ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc 2820
tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc 2880
gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc 2940
tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt 3000
tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca 3060
cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg 3120
gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt 3180
aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga 3240
tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca 3300
gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg 3360
ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact 3420
gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct 3480
aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag 3540
catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta 3600
taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt 3660
ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc 3720
accctgttgt ttggtgttac ttctgcagcc cgggggatcc ccaatacttg tatggccgcg 3780
gccgcatgtc caagctggag aagtttacaa actgttacag cctctccaaa accctcaggt 3840
ttaaagcgat cccggtgggc aagacccagg agaacatcga caacaagagg ctcctggtgg 3900
aagacgagaa gcgcgccgaa gactacaagg gcgtgaagaa gctgctcgat aggtactacc 3960
tcagctttat taacgacgtg ctgcacagca tcaaactcaa gaatctcaac aactacatct 4020
ccctcttccg caaaaagacc cgcaccgaga aggagaacaa ggagctggag aacctggaga 4080
tcaacctccg caaggaaatc gccaaagcgt tcaagggcaa tgaagggtac aagagcctct 4140
tcaagaaaga catcatcgaa actatcctcc cagagtttct cgatgacaag gacgagatcg 4200
cgctggtgaa ctcctttaac gggttcacaa ccgcgtttac cggcttcttt gataacaggg 4260
aaaatatgtt ctccgaggag gccaagtcca ccagcatcgc cttcaggtgt atcaacgaga 4320
acctcacccg ctacatttcc aatatggaca ttttcgagaa ggtggatgcg atcttcgata 4380
agcacgaggt gcaggagatc aaagagaaga ttctcaattc cgattatgac gtcgaggatt 4440
tcttcgaagg ggagttcttt aattttgtgc tcacacaaga gggcattgac gtgtacaacg 4500
cgattatcgg gggcttcgtc acagagtccg gggagaagat taaggggctg aatgagtaca 4560
tcaatctgta caatcagaag accaagcaga aactgccgaa attcaagccg ctctacaagc 4620
aagtcctgtc cgatagggaa agcctctcct tctacggcga gggctatacc agcgacgagg 4680
aggtgctgga agtcttccgc aacacactga ataagaatag cgagattttc tcctccatca 4740
agaagctcga gaagctcttt aagaactttg acgagtacag ctccgccggg attttcgtga 4800
agaacgggcc ggcgatcagc accatctcca aggacatctt tggcgagtgg aacgtcatca 4860
gggacaagtg gaacgccgag tacgacgaca tccacctgaa gaagaaggcg gtggtgaccg 4920
agaagtatga ggacgatcgc aggaagtcct tcaaaaaaat cggctccttc agcctcgaac 4980
agctccagga gtatgccgat gcggatctgt ccgtcgtcga gaagctgaag gaaatcatca 5040
ttcagaaggt cgacgagatc tataaagtgt acgggtccag cgagaagctg ttcgacgccg 5100
actttgtgct cgagaagtcc ctcaaaaaga atgacgccgt ggtggccatt atgaaagacc 5160
tgctcgactc cgtgaagtcc ttcgaaaatt acattaaagc gttctttggg gaggggaagg 5220
aaactaacag ggatgagtcc ttctatggcg actttgtcct cgcgtacgac atcctgctga 5280
aggtcgacca catttacgac gcgatccgca actacgtgac acagaagccg tactccaaag 5340
acaagttcaa gctgtacttc cagaacccgc aatttatggg gggctgggac aaggataaag 5400
agacagacta ccgcgcgaca attctccgct atggctccaa atactatctg gccatcatgg 5460
acaagaagta cgcgaagtgc ctgcagaaga tcgacaaaga cgacgtcaat ggcaactatg 5520
aaaagatcaa ctacaagctg ctgccgggcc cgaacaagat gctcccgaag gtgttcttca 5580
gcaagaagtg gatggcctac tacaatccaa gcgaggatat tcagaaaatc tataaaaacg 5640
ggaccttcaa gaagggggac atgtttaacc tcaacgactg ccacaagctc attgatttct 5700
tcaaggatag catttcccgc tacccgaaat ggtccaatgc gtacgatttt aacttctccg 5760
agacagaaaa gtacaaagac atcgcgggct tttacaggga ggtggaggag caagggtata 5820
aagtttcttt tgaatccgcg agcaagaagg aagtcgacaa gctcgtcgag gagggcaagc 5880
tctacatgtt ccaaatttat aacaaggact tttccgacaa gagccatggg accccaaacc 5940
tccacaccat gtacttcaaa ctgctctttg acgagaacaa ccacgggcaa atcaggctga 6000
gcggcggcgc cgaattattc atgcgcaggg cctccctcaa gaaggaagag ctggtcgtcc 6060
atccagccaa ttccccgatc gcgaacaaga acccggacaa tccgaaaaag accaccaccc 6120
tgtcctacga cgtctacaag gacaaacgct tcagcgaaga ccagtacgaa ttacacatcc 6180
caattgcgat taataagtgc ccaaagaata tcttcaaaat taatacagag gtcagggtgc 6240
tgctcaaaca cgacgacaat ccgtatgtca tcggcattga caggggcgag cgcaatctgc 6300
tctatatcgt ggtcgtggat gggaagggca atattgtgga gcagtactcc ctgaacgaga 6360
ttatcaacaa cttcaatggg attaggatta agaccgacta tcacagcctg ctcgacaaga 6420
aagaaaaaga gaggtttgag gcccgccaaa actggacctc cattgagaat atcaaagaat 6480
taaaggccgg ctatatttcc caagtcgtcc acaagatctg cgagctggtg gagaaatatg 6540
acgccgtgat tgcgctcgaa gacttaaatt ctgggttcaa gaactcccgc gtgaaggtgg 6600
aaaaacaggt gtatcagaaa ttcgagaaaa tgctgatcga caaactcaat tatatggtgg 6660
ataagaagtc caacccgtgt gccacagggg gcgcgctgaa gggctatcag atcaccaaca 6720
agttcgagag cttcaagagc atgagcaccc agaacgggtt tattttctac atcccggcgt 6780
ggctcacctc caagattgac ccgagcaccg gcttcgtgaa cctcctgaag acaaagtata 6840
cctccattgc cgacagcaag aagtttatct cctccttcga ccgcattatg tatgtgccgg 6900
aggaggacct cttcgagttc gccctcgact acaaaaactt cagccgcaca gatgcggatt 6960
acatcaagaa gtggaagctg tactcctacg ggaacaggat ccgcatcttc aggaatccaa 7020
aaaaaaataa cgtctttgac tgggaggaag tgtgcctgac atccgcctac aaggaactgt 7080
tcaataaata cggcatcaat taccagcagg gcgacattcg cgccctcctc tgtgagcagt 7140
ccgacaaagc gttttactcc agcttcatgg ccctcatgtc cctgatgctc caaatgagga 7200
atagcatcac agggcgcacc gacgtcgact tcctcatcag cccggtgaag aactccgacg 7260
ggatctttta cgactcccgc aactatgagg cgcaagagaa tgcgatcctc ccgaagaacg 7320
ccgatgcgaa cggggcctat aatatcgcca ggaaagtgct ctgggccatc gggcagttca 7380
aaaaggcgga ggatgagaag ctcgacaagg tgaaaattgc catttccaac aaggagtggc 7440
tggagtacgc gcagacctcc gtgaagcaca aaaggccggc ggccacgaaa aaggccggcc 7500
aggcaaaaaa gaaaaaggga tcctacccat acgatgttcc agattacgct tatccctacg 7560
acgtgcctga ttatgcatac ccatatgatg tccccgacta tgcctaagag ctccggccgg 7620
gagcatgcga cgtcgatcta actgactagc cgcggccatg ctagagtccg caaaaatcac 7680
cagtctctct ctacaaatct atctctctct atttttctcc agaataatgt gtgagtagtt 7740
cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 7800
cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 7860
accaaaatcc agtgacctga attcgaggcg gtttgcgtat tggctagagc agcttgccaa 7920
catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga 7980
ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca 8040
ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa 8100
atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc 8160
caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 8220
ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa 8280
gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt 8340
aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac 8400
agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt 8460
tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 8520
ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 8580
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gaccttcctc tatataagga 8640
agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 8700
ctctcgagct ttcgcagatc ccggggggca atgagatatg aaaaagcctg aactcaccgc 8760
gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct 8820
ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct 8880
gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc 8940
atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gagtttagcg agagcctgac 9000
ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact 9060
gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag 9120
ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg 9180
tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga 9240
caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg 9300
ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa 9360
tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga 9420
ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta 9480
cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccacga ctccgggcgt atatgctccg 9540
cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg 9600
ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca 9660
aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag 9720
tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaagaaa tagagtagat gccgaccgga 9780
tctgtcgatc gacaagctcg agtttctcca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg 9840
gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg 9900
tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca 9960
gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt cggcgttaat tcagtacatt aaaaacgtcc 10020
gcaatgtgtt attaagttgt cactagtcag gttaactcaa ttcggcgtta attcagtaca 10080
ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat 10140
atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac 10200
tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg gcgtcagcgg gagagccgtt gtaaggcggc 10260
agactttgct catgttaccg atgctattcg gaagaacggc aactaagctg ccgggtttga 10320
aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg ttgattgtaa cgatgacaga gcgttgctgc 10380
ctgtgatcac ttaagtaact aactaacagg aagagtttgt agaaacgcaa aaaggccatc 10440
cgtcaggatg gccttctgct tagtttgatg cctggcagtt tatggcgggc gtcctgcccg 10500
ccaccctccg ggccgttgct tcacaacgtt caaatccgct cccggcggat ttgtcctact 10560
caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt ccgactgagc 10620
ctttcgtttt atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc ttagtagtta gacgtccccg 10680
agatccatgc tagaccatga atccagaagc ccgagaggtt gccgcctttc gggctttttc 10740
tttttcaaaa aaaaaaattt ataaaacgat ctgttgcggc cggccgccgg gttgtgggca 10800
aaggcgctcg acggtgggca accgcttgcg gttgtccacg ggcggagccg gtgcgcgtag 10860
cgcattgtcc acaagccaag ggcgaccaat aattgatata tatattcata attgaaaagc 10920
taattgaaca tactacttgc tgtaactact tgccggagcg aggggtgttt gcaagctgtt 10980
gatctgaaag ggctattagc gttctcacgt gcctttttga ttagcgattt cacgtgacct 11040
tattagcgat ttcacgtact ccgattagcg atttcacgta ccctgattag cgatttcacg 11100
tggatagttt ttggagcggg ccggaaagcc ccgtgaatca aggctttgcg gggcattagc 11160
ggtttcacgt ggataactac cctctatcca caggcttccg gggataaaaa agcccgctcg 11220
acggcgggct gttggatggg gatctagcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 11280
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 11340
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 11400
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 11460
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 11520
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 11580
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 11640
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 11700
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 11760
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 11820
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 11880
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 11940
aagaagatcc tttgatcttt tctaccgggt ctgacgctca gtggaacggg gcccaatctg 12000
aataatgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 12060
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 12120
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 12180
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 12240
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat 12300
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 12360
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 12420
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcagggac actgccagcg 12480
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgtttttc 12540
cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 12600
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 12660
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 12720
agcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 12780
aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgacgt ttcccgttga atatggctca 12840
taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 12900
ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac gggccagagc tgcagtttga 12960
tcccgagggg aaccctgtgg ttgacatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt 13020
cacgcccttt taaatatccg ttattctaat aaacgctctt ttctcttag 13069
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> BEL KO1 P1
<400> 2:
ggcagtcaaa agaccttttt aatttctact cttgtagatg aagagagtga ctgcgctagc 60
aatcgctc 68
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> BEL KO1 P2
<400> 3:
aaaagagcga ttgctagcgc agtcactctc ttcatctaca agagtagaaa ttaaaaaggt 60
cttttgac 68
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Bel KO1 genome check FP
<400> 4:
gtggaggtcg acatgactga ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Bel KO1 genome check RP
<400> 5:
ttgcacattc atacaaattg gt 22
Claims (9)
1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，
由crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框组成，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。
2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1709至1716位所示，
b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至3777位所示；LbCpf1编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第7614至7878位所示。
3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。
4.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。
5.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’TTTN-(N)X-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，TTTN中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个；
将所述靶标片段整合到权利要求1-4中任意一项所述的骨干质粒载体中，形成带有所述标靶片段的crRNA。
6.根据权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-GGCA-(N)X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-(N’)X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)X和反向寡核苷酸中的(N’)X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。
7.一种通过权利要求6所述方法构建的重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，所述应用包括步骤如下，
将所述重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。
9.一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将通过权利要求5中所述方法获得的重组载体导入目标菌落。
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