CN106701933A - 一种基于镁试剂i的lamp可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法，并对该试剂参与的环介导等温扩增反应体系进行了优化，包括镁试剂I用于环介导等温扩增时的最适浓度和用量；包括镁试剂I用于环介导等温扩增时其它成分的最适比例；镁试剂I用于环介导等温扩增的特异性和灵敏度测试。通过上述优化，获得的LAMP可视化方法具有高灵敏度、特异性和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及微生物快速检测方法，特别是涉及一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法。
背景技术
环介导的等温扩增技术(LAMP)是日本科学家Notomi发明的一种新型核酸扩增技术。与传统核酸扩增技术相比，LAMP不仅扩增时间短，而且凭借极高的扩增效率及较低的仪器要求，LAMP技术具有良好的现场、野外检测及资源有限的基层实验室检测应用前景。目前LAMP技术已被应用于致病性微生物、致病性寄生虫、转基因成分、肿瘤诊断，以及食品过敏原等领域。
目前用于LAMP检测的主要有凝胶电泳法、浊度法、SYBR Green I荧光法、钙黄绿素法、羟基萘酚蓝法等几种方法。然而，这些方法在检测实际样本时仍然具有一些诸如特异性及灵敏度等局限性。因此，发展新的高灵敏LAMP可视化策略对快速检测技术的发展具有现实意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法，能够实现LAMP可视化检测及提高样本检测灵敏度。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法，包括：
用氢氧化钠配制镁试剂I溶液；
基于镁试剂I的LAMP可视化检测反应体系包括：Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、镁离子、dNTP Mix、LAMP引物混合物，以及DNA模板；
对所述反应体系在一定扩增条件下进行扩增后，加入镁试剂I溶液，然后观察试管颜色变化，并判定检测结果。
其中，所述镁试剂I溶液是由0.4-0.6mol/L的NaOH配制而成。
其中，所述反应体系中镁试剂I溶液的浓度为0.1-0.4mmol/L。
其中，所述反应体系中镁离子的浓度为3.0-10.0mmol/L。
其中，所述反应体系中Bst DNA聚合酶用量为每25μL体系中含6-8U。
其中，所述反应体系中甜菜碱浓度为8-12mmol/L。
其中，所述反应体系中dNTP Mix浓度为1.2-1.6mmol/L。
其中，所述反应体系中每25μL体系中含DNA模板1-2μL。
其中，所述反应体系中LAMP引物混合物包含外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)，各引物浓度和比例如下：外引物(F3和B3)的浓度为0.1-0.3μM/L，内引物(FIP和BIP)的浓度为1.2-1.8μM/L，环引物(LF和LB)的浓度为0.2-0.6μM/L；外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)的摩尔比为：1∶8∶2。
其中，所述扩增条件为在60-65℃下反应15-60分钟，并在80℃反应2-4分钟。
其中，根据反应后颜色进行检测结果判定：黄色表示阴性，紫红色表示阳性。
附图说明
图1是本发明实施方式一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法的流程图；
图2是本发明实施方式一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法效果；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明实施方式的方法作进一步说明。
实施例1基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法
步骤S101：按照常规方法提取沙门氏菌基因组DNA作为LAMP可视化检测的模板。
步骤S102：在LAMP可视化检测反应体系分别加入缓冲液、BstDNA聚合酶、甜菜碱、镁离子、dNTP Mix、引物组以及DNA模板。
步骤S103：对步骤S102得到的反应体系进行扩增，反应结束后加入镁试剂I溶液，然后根据试管颜色变化判定检测结果。
基于镁试剂I的可视化LAMP可视化检测方法的扩增反应体系，其中25μL的反应体系为：LAMP引物混合物1μL，Bst DNA聚合酶8U，反应液8.5μL，样本DNA 1μL，染料1.5μL，然后用无菌去离子水补足至25μL。配制好的反应体系在PCR管混匀后，于62℃反应60分钟，并在80℃反应3分钟。然后观察颜色试管颜色变化，判定检测结果如图2所示，在该反应体系下，对照中镁离子与镁试剂I结合成黄色，而阳性样本中，因镁离子被消耗，镁试剂I呈紫色。
实施例2NaOH浓度对LAMP可视化检测的影响
首先，配置分别配制浓度为0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M及0.7M的NaOH溶液，然后用不同浓度的NaOH溶液配制镁试剂I染料溶液；按照实施例1所述的方法进行检测，优化不同NaOH浓度配制的镁试剂I溶液对检测的影响。结果显示，NaOH浓度在0.4-0.6M之间时，对照为黄色，样本为黄紫色或紫色，对照与样本之间存在颜色差异。因此，在此浓度区间配制的镁试剂I溶液可以用于检测，其中0.5M的NaOH浓度效果最好。
表1 NaOH浓度对LAMP可视化检测的影响
注：根据对照和样本的颜色差异来判定该方法是否可以用于检测。
实施例3镁试剂I浓度对LAMP可视化检测的影响
首先，配置配制浓度为0.5M的NaOH溶液，然后用该浓度的NaOH溶液配制3.5mM浓度的镁试剂I溶液；按照实施例1所述的方法进行检测，加入不同体积3.5mM浓度的镁试剂I溶液，优化体系中不同镁试剂I浓度对检测的影响。结果显示，体系中镁试剂I浓度为0.1-0.4mM，对照与样本之间存在颜色差异。因此，在此浓度区间均可以实现检测，其中以0.2mM时，检测效果最佳。
表2镁试剂I浓度对LAMP可视化检测的影响
注：根据对照和样本的颜色差异来判定该方法是否可以用于检测。
实施例4镁离子浓度对LAMP可视化检测的影响；
按照实施例1所述的方法进行检测，在检测体系中，加入不同体积镁离子溶液，优化体系中不同镁离子浓度对检测的影响。结果显示，体系中镁试剂I浓度为5.0-7.0mM时，对照与样本之间存在颜色差异。因此，在此浓度区间均可以实现检测，其中以6.0mM时，检测效果最佳。
表3镁离子浓度对LAMP可视化检测的影响
注：根据对照和样本的颜色差异来判定该方法是否可以用于检测。
实施例5是一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法的灵敏度；
首先用常规方法培养沙门氏菌，按照实施例1中的方法提取基因组DNA，并使用核酸定量方法对基因组DNA进行定量；定量的基因组DNA用无菌的TE进行浓度调整得到100ng/μL的模板，并进行梯度稀释得到不同浓度的基因组DNA；按照实施例1描述的方法进行检测，结果显示本方法的最低检出度为1pg基因组DNA。
表4一种基于镁试剂I的可视化LAMP可视化检测方法灵敏度试验
注：“+”代表结果为阳性，“-”代表结果为阴性。
Claims (10)
1.一种基于镁试剂I的LAMP可视化检测方法，其特征在于，包括：
A.提取检测目标基因组DNA作为模板；
B.制备基于镁试剂I的LAMP可视化检测反应体系，所述反应体系包括：Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、镁离子、dNTP Mix、LAMP引物以及DNA模板；
C.对B步骤获取的反应体系进行扩增，扩增结束后加入镁试剂I溶液，根据试管颜色变化，获取检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述镁试剂I溶液是由0.4-0.6mol/L的NaOH配制而成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中镁试剂I溶液的浓度为0.1-0.4mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中镁离子的浓度为3.0-10.0mmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中Bst DNA聚合酶用量为每25μL体系中含6-8U。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中甜菜碱浓度为8-12mmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中dNTP Mix浓度为1.2-1.6mmol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中每25μL体系中含DNA模板1-2μL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中LAMP引物包含外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)，各引物浓度和比例如下：外引物(F3和B3)的浓度为0.1-0.3μM/L，内引物(FIP和BIP)的浓度为1.2-1.8μM/L，环引物(LF和LB)的浓度为0.2-0.6μM/L；外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)的摩尔比为：1∶8∶2。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增条件为在61-65℃下反应15-60分钟，并在80℃反应2-3分钟。根据颜色变化判断结果；其中，黄色表示阴性，紫红色表示阳性。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |