CN106701816B - 一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，步骤为：海带雌配子体细胞的转化；重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达；重组玉米蛋白z108β的提取和纯化。本发明首次通过海带配子体细胞的大量培养获得纯度达到99.9％的重组玉米蛋白，重组玉米蛋白z108β在海带配子体细胞的表达，使得海带雌配子体细胞成为一种可以生产生物农药的生物反应器，本发明在水生植物中表达陆生植物的重组蛋白，而且大规模培养条件下分裂的雌配子体细胞具有目标基因的遗传稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体涉及通过基因转化的方法将玉米蛋白的基因z108β在海带雌配子体内表达，通过蛋白纯化和提取，获得具有应用价值的重组玉米蛋白z108β。
背景技术
重组玉米蛋白是一种II型核糖体失活蛋白(RIP)，是植物体内一种抑制异源生物体活性的防卫蛋白，其主要功能表现在水解后的蛋白RIP具有两个肽链——α肽和β肽，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有类凝聚素的Lectin活性。α肽可以专一切割核糖体28RrRNA 4324的腺苷，阻遏延伸因子EF-2与核糖体的结合，从而抑制外源生物有机体的蛋白合成。从玉米胚芽中获得的z108基因经过重组以后，在大肠杆菌表达的重组蛋白对于黄曲霉(A.flavus)等多种植物病原菌具有抑制孢子萌发的作用，是一种具有抗菌特点的防卫蛋白；而它的β肽链能够独立地与细胞表面的糖元或半乳糖结合，抑制甜菜夜蛾(S.exigua)等害虫的取食，表现出一种抑制鳞翅目昆虫生长的作用。
发明人在过去的研究中已经将玉米的核糖体失活蛋白基因z108转移到大肠杆菌BL21中，在实验室条件下提取、纯化并获得重组的抗菌蛋白。2010年获得了一项发明专利(一种玉米抗菌蛋白的基因及其编码蛋白的应用ZL200810014139.6)。海带(L.japonica)属于褐藻门，是多年生的大型藻类，烟台市及其周边沿海的海带养殖面积达15多万亩，年产鲜海带150多万吨，占全国的80％。海带中含有多种药用活性成分，如岩藻聚糖硫酸酯——一种对巨噬细胞、T细胞有直接作用的抗癌药物。用充气悬浮培养的海带雌配子体细胞，生长极快，生物量可每周翻一番，一个月的生物量可提高20倍。重组玉米蛋白z108β基因在海带雌配子体上表达并实施大规模的细胞培养，是以玉米蛋白抗虫功能表达作为一种廉价的生物反应器合成生物农药。
发明内容
本发明将重组玉米蛋白基因z108β在海带雌配子体内表达，并进行大规模的细胞培养，有助于利用海带作为海洋生物反应器来生产重组玉米蛋白。
重组玉米蛋白z108β是一个长度为375bp，共有124个氨基酸的小的肽链，重组玉米蛋白z108β的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。重组的玉米蛋白z108β是一个构建在重组质粒pBA002载体中的转化载体pBA002-z108β，其转化的作用就是将z108β基因整合到海带的基因组中，并且让海带种苗在海水的生长中表达这样一个基因，产生这样一个蛋白。
转化载体pBA002-z108β的构建：载体质粒pBA002用XbaI/SacI双酶切，与pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(经过XbaI/SacI双酶切)连接，其连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β，-70℃保存。
本发明中基因转化的方法使用的是基因枪轰击技术，通过金粒击打海带配子体细胞的细胞膜，让重组质粒载体携带重组玉米蛋白的基因整合到海带染色体的基因组中，并获得遗传上稳定的表达。该发明是用基因枪以金粒轰击海带配子体的方法再加入质粒共培养可以获得更多的雌配子体转化细胞，通过基因检测也能够大幅度提高海带雌配子体细胞的转化率。
本发明的技术方案如下：
一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)海带雌配子体细胞的转化
①生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为5×105-2×106个/mL(用血球计数板计数)。转化时用60mm的无菌培养皿，将雌雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈。
优选的，生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为1×106个/mL。
②用试剂盒提取质粒pBA002-z108β的DNA，用以轰击后的共培养和基因转化。
③对海带雌配子体细胞团进行轰击：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；
④向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是11-13℃，光照为800Lux，共培养48小时；
优选的，向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是12℃，光照为800Lux。共培养48小时。
⑤在草丁膦40mg/L的浓度下筛选转化的雌配子体细胞。
(2)重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达
转化后的雌配子体细胞培养28-35d，挑取克隆单独培养。将海带配子体均匀涂布在带有滤纸的培养皿中，在解剖镜下用毛细管挑取褐色的转化体，加入培养液大量培养。培养海带雌配子体细胞的营养液为：灭菌海水中添加浓度为10.0g/L的NaNO3和浓度为1.0g/L的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量为每升海水添加1.0-10.0mL；KH2PO4溶液的添加量为每升海水添加0.4-1.0mL。并且每天更换一次营养液，培养温度是11-13℃，每天为光照培养14小时、暗培养10小时，光照为800Lux；将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养5-10d。
优选的，转化后的雌配子体细胞培养30d；NaNO3溶液的添加量为每升海水添加5.0mL，KH2PO4溶液的添加量为每升海水添加0.7mL；海带雌配子体细胞的培养条件为：培养温度是12℃，每天为光照培养14小时、暗培养10小时，光照为800Lux；将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养8d。
对筛选出来的海带雌配子体细胞进行大规模培养，连续不停地进行PCR检测，优化海带配子体转基因的方法，提高转化率和转化体的成活率，建立完整的海带雌配子体细胞无性繁殖体系。
海带雌配子体细胞培养两周后在草丁膦40mg/L的浓度下保持褐色，未被草丁膦杀死，也有部分海带配子体变绿，褪色，是未被转化的、不含有重组玉米蛋白z108β的雌配子体细胞。
(3)重组玉米蛋白z108β的提取和纯化
①海带雌配子体转化体细胞的破碎和分离
取0.1g样品放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液(sample buffer)200μL(1.0Mtris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL)，混合后煮沸5min，12000rpm离心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE电泳鉴定
取20μL上清液，用于点样检验；SDS-PAGE电泳采用10％的分离胶(去离子水9.9mL，30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％过硫酸铵(AP)0.25mL，TEMED 0.01mL)和积层胶(无离子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8)1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。
蛋白样品上样，每孔20μL，80V电压下电泳30分钟后电压120V电泳60-80分钟。
③重组玉米蛋白z108β的蛋白印迹法验证和纯化
海带雌配子体细胞转化体的验证使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行PVDF转膜，电流90mA，转膜100min。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂洗1分钟，以洗去膜上的转膜液。放入封闭液中，摇床上封闭2小时。清洗后将膜浸于稀释好的一抗(新西兰大白兔的Z108抗血清与5％脱脂奶粉的比例为1：1000)中，37℃孵育1-2h；用10mLTBST洗膜3次；再将膜浸于稀释好的二抗(HRP标记的羊抗兔IgG与5％脱脂奶粉的比例为1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色拍照。
优选的，清洗后将膜浸于稀释好的一抗中，37℃孵育1.5h。
获得的重组玉米蛋白用8kD的再生棉绒纤维素透析膜(货号F128056-0001，上海生工)透析除盐，并12000rpm离心20分钟沉淀。
④重组蛋白的浓缩和保藏
将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米蛋白z108β在-20℃条件下保存。
经电泳蛋白标准测试，重组玉米蛋白z108β的含量达到0.2μg/μL；纯度达到99.9％。
本发明中除特殊说明外，“％”均表示质量浓度。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明首次通过海带配子体细胞的大量培养获得纯度达到99.9％的重组玉米蛋白，这一发明使得人工条件下实现目标基因编码蛋白的表达量能够满足实际应用的要求；
2、重组玉米蛋白z108β是一种具有抑制鳞翅目昆虫发育的作用，该基因在海带配子体细胞的表达使得海带雌配子体细胞成为一种可以生产生物农药的生物反应器。
3、海带配子体细胞大量培养的条件必须满足：
(1)灭菌海水中添加终浓度为10mg/L的NaNO3和1.0mg/L的KH2PO4作为生长的营养物质，并且每天更换一次营养液，培养温度11-12℃。光照为800Lux。每天为光照培养14小时、暗培养10小时。
(2)持续使用40mg/L草丁膦作为雌配子体细胞大规模培养的筛选压力，维持重组玉米蛋白表达海带配子体细胞具有目标蛋白的表达能力。
4、在水生植物中表达陆生植物的重组蛋白，而且大规模培养条件下分裂的雌配子体细胞具有目标基因的遗传稳定性。
附图说明
图1为重组玉米蛋白基因z108β的酶切电泳验证图；用XbaI/SacI双酶切后的片段长度为389bp。
图2为大规模培养的表达重组玉米蛋白的海带雌配子体细胞图；图A为筛选后显微镜下存活的褐色海带雌配子体细胞；图B为表达重组玉米蛋白的海带雌配子体细胞形态；图C为不表达的海带雌配子体细胞变绿并渐渐发白凋亡。
图3为重组玉米蛋白z108βPCR扩增产物的凝胶电泳图；DNA片段大小为375bp。
图4为SDS-PAGE电泳显示海带配子体细胞中分离的重组玉米蛋白图；蛋白大小为20.5kDa。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明具体实施例中使用的海水取自山东省烟台市沿海，而适合海带生长的海水都适用于本发明。
实施例1一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)海带雌配子体细胞的转化
①生长中的海带雌配子体细胞品系13号(来源于中国科学院海洋研究所藻类生物学实验室)的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为1×106个/mL左右(用血球计数板计数)。转化时用60mm的无菌培养皿，将雌雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈。
②用试剂盒提取质粒pBA002-z108β的DNA，用以轰击后的共培养和基因转化。
转化载体pBA002-z108β的构建：载体质粒pBA002用XbaI/SacI双酶切，与pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(经过XbaI/SacI双酶切)连接，其连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β，-70℃保存。用XbaI/SacI双酶切重组玉米蛋白z108β的酶切电泳验证图，如图1所示。
③对海带雌配子体细胞团进行轰击：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；
④向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是12℃，光照为800Lux。共培养48个小时。
⑤在草丁膦40mg/L的浓度下筛选转化的雌配子体细胞。
(2)重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达
转化后的雌配子体细胞培养30d，挑取克隆单独培养。将海带配子体均匀涂布在带有滤纸的培养皿中，在解剖镜下用毛细管挑取褐色的转化体，加入培养液大量培养。培养海带雌配子体细胞的营养液为：灭菌海水中添加浓度为10.0g/L的NaNO3和浓度为1.0g/L的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量为每升海水添加5.0mL；KH2PO4溶液的添加量为每升海水添加0.7mL。并且每天更换营养液一次，培养温度是12℃。光照为800Lux。每天为光照培养14小时、暗培养10小时。将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养8d。
对筛选出来的海带雌配子体细胞进行大规模培养，连续不停地进行PCR检测，优化海带配子体转基因的方法，提高转化率和转化体的成活率，建立完整的海带雌配子体细胞无性繁殖体系。转化方式分别为轰击后加入质粒与轰击时加入质粒，二者细胞转化率的平均值分别达到39.87％和23.89％，如表1所示：
表1基因枪转化效率的测试
海带雌配子体细胞培养两周后在草丁膦40mg/L的浓度下保持褐色，未被草丁膦杀死，也有部分海带配子体变绿，褪色，是未被转化的、不含有重组玉米蛋白z108β的雌配子体细胞。
大规模培养的表达重组玉米蛋白的海带雌配子体细胞图如图2所示；图A为筛选后显微镜下存活的褐色海带雌配子体细胞；图B为表达重组玉米蛋白的海带雌配子体细胞形态；图C为不表达的海带雌配子体细胞变绿并渐渐发白凋亡。
(3)重组玉米蛋白z108β的提取和纯化
①海带雌配子体细胞转化体的破碎和分离
取0.1g样品放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液(sample buffer)200μL(1.0Mtris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL)，混合后煮沸5min，12000rpm离心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE电泳鉴定
取20μL上清液，用于点样检验；SDS-PAGE电泳采用10％的分离胶(去离子水9.9mL，30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％过硫酸铵(AP)0.25mL，TEMED 0.01mL)和积层胶(无离子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8)1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。
蛋白样品上样，每孔20uL，80V电压下电泳30分钟后电压120V电泳60-80分钟，结果如图3所示，蛋白大小为20.5KD，与玉米胚乳中产生的一种核糖体失活蛋白z108的β肽链大小一致。
③重组玉米蛋白z108β的蛋白印迹法验证和纯化
海带雌配子体细胞转化体的验证使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行PVDF转膜，电流90mA，转膜1h40min。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂洗1分钟，以洗去膜上的转膜液。放入封闭液中，摇床上封闭2小时。清洗后将膜浸于稀释好的一抗(新西兰大白兔的Z108抗血清于5％脱脂奶粉的比例为1：1000)中，37℃孵育1.5h；用10mLTBST洗膜3次；再将膜浸于稀释好的二抗(HRP标记的羊抗兔IgG与5％脱脂奶粉的比例为1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色拍照。
获得的重组玉米蛋白用8kD的再生棉绒纤维素透析膜(货号F128056-0001，上海生工)透析除盐，并12000rpm离心20分钟沉淀。
④重组蛋白的浓缩和保藏
将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米蛋白z108β在-20℃条件下保存。
经电泳蛋白标准测试，重组玉米蛋白z108β的含量达到0.2μg/μL；纯度达到99.9％。
试验例1海带雌配子体细胞转化体的提取和PCR验证
(1)DNA提取：取在40mg/L除草剂条件下的海带雌配子体转化体细胞放入液氮中研磨，加入200μLDNA提取液(1.0MTris-HCL(PH 6.8)1mL，CTAB 200mM 2mL，ddH2O 7.mL，适量巯基乙醇)，65℃温浴20分钟，12000rpm离心10min；
取离心管加入两倍体积的预冷的异丙醇，1/10体积的NaAC，加入离心后的上清液，置于-70℃冰箱中保存20min，充分沉淀。12000rpm，离心10min，弃上清；沉淀加入预冷的75％的乙醇，重复洗涤两次后离心。吹干后，用TE溶解DNA，加1μL RNase 37℃保温1小时后进行1％琼脂糖凝胶电泳。
(2)PCR反应体系：40μLddH2O，5μL10×PCR Buffer，1μL10mM dNTP，1μL模板，1μLPfu，上、下游引物各1μL。引物序列为：
Jpri-1191(204)F ATGGCCGAGATAACCCTAGAGCCGAGT
Jpri-1191(204)R TCAGGCCTCGTCGTCGTCGTTGTCAGCACT
(3)PCR反应程序：95℃预变性10min；然后95℃、30S；55℃、50S；72℃、80S，进行34个循环；最后72℃延伸10min。4℃保存。0.8％琼脂糖凝胶电泳点样，TAC缓冲液，90V，40分钟，紫外灯下检测扩增片段的大小为375bp，如图4所示。
〈110〉中国农业大学烟台研究院、青岛农业大学
〈120〉一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法
〈130〉16-1-1166
〈160〉2
〈170〉PatentIn Version 3.5
〈210〉1
〈211〉375 bp
〈212〉DNA
〈213〉重组玉米蛋白基因z108β
〈400〉1
atggccgaga taaccctaga gccgagtgat cttgacccac aggccgacac gaagagcaag 60
ctggtgaagc tggtggtcat ggtgtgcgag gggctgcggt tcaacaccgt gtcccgcacg 120
gtggacgcgg ggttcaacag ccagcacggg gtgaccttga ccgtgacgca ggggaagcag 180
gtgcagaagt gggacaggat ctccaaggcg gccttcgagt gggctgacca ccccaccgct 240
gtgatccccg acatgcagaa gcttggcatc aaggataaga acgaagcagc gaggatcgtt 300
gcgctcgtta agaatcaaac tactgccgct gccgctactg ctgccagtgc tgacaacgac 360
gacgacgagg cctga 375
〈210〉2
〈211〉124AA
〈212〉氨基酸
〈213〉重组玉米蛋白z108β
〈400〉2
MET Ala Glu Ile Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser Lys 20
Leu Val Lys Leu Val Val MET Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr 40
Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln 60
Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala 80
Val Ile Pro Asp MET Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile Val 100
Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp 120
Asp Asp Glu Ala * 124
Claims (8)
1.一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）海带雌配子体细胞的转化
包括如下步骤：
①生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为5×105-2×106个/mL，转化时用60mm的无菌培养皿，将雌雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm的圆形轰击圈；
②用试剂盒提取质粒pBA002-z108β的DNA，用以轰击后的共培养和基因转化；
③对海带雌配子体细胞团进行轰击：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；
④向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是11-13℃，光照为800Lux，共培养48小时；
⑤在草丁膦40mg/L的浓度下筛选转化的雌配子体细胞；
（2）重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达
转化后的雌配子体细胞培养28-35d，挑取克隆单独培养，将海带配子体均匀涂布在带有滤纸的培养皿中，在解剖镜下用毛细管挑取褐色的转化体，加入培养液大量培养，培养海带雌配子体细胞的营养液为：灭菌海水中添加浓度为10.0g/L的NaNO3和浓度为1.0g/L的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量为每升海水添加1.0-10.0mL；KH2PO4溶液的添加量为每升海水添加0.4-1mL，并且每天更换一次营养液，培养温度是11-13℃，每天为光照培养14小时、暗培养10小时，光照为800Lux；将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养5-10d；
（3）重组玉米蛋白z108β的提取和纯化
包括如下步骤：
①海带雌配子体转化体细胞的破碎和分离
取0.1g转化培养后的海带配子体转化体样品放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液200μL，混合后煮沸5min，12000rpm离心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE电泳鉴定
取20μL上清液，用于点样检验；SDS-PAGE电泳采用10%的分离胶和积层胶；
蛋白样品上样，每孔20μL，80V电压下电泳30分钟后电压120V电泳60-80分钟；
③重组玉米蛋白z108β的蛋白印迹法验证和纯化
海带雌配子体细胞转化体的验证使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行PVDF转膜，电流90mA，转膜100min，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂洗1分钟，以洗去膜上的转膜液，放入封闭液中，摇床上封闭2小时；清洗后将膜浸于稀释好的一抗中，37℃孵育1-2h；用10mLTBST洗膜3次；再将膜浸于稀释好的二抗中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色拍照；
获得的重组玉米蛋白用8kD的再生棉绒纤维素透析膜透析除盐，并12000rpm离心20分钟收集沉淀；
④重组蛋白的浓缩和保藏
将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米蛋白z108β在-20℃条件下保存；
所述的1×样品缓冲液的配方为：1.0 M tris-HCL pH 6.8 1mL，10% SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL；
所述的10%的分离胶的配方为：去离子水 9.9mL，30%丙烯酰胺 8.3mL，Tris-HCL pH8.8 6.3mL，10% SDS 0.25 mL，10% 过硫酸铵 0.25mL，TEMED 0.01mL；
所述的积层胶的配方为：无离子水 5.5mL，30%丙烯酰胺 3.5mL，Tris-HCL pH 8.81.5mL，10% SDS 0.08mL，10%过硫酸铵0.08mL，TEMED 0.008mL；
所述的一抗是由新西兰大白兔的z108抗血清与5%脱脂奶粉按比例1：1000混合而成；
所述的二抗是由HRP标记的羊抗兔IgG与5%脱脂奶粉按比例1：2000混合而成；
所述的重组玉米蛋白z108β的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为1×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是12℃，光照为800Lux，共培养48小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中转化后的雌配子体细胞培养30d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中NaNO3溶液的添加量为每升海水添加5.0mL，KH2PO4溶液的添加量为每升海水添加0.7mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中海带雌配子体细胞的培养条件为：培养温度是12℃，每天为光照培养14小时、暗培养10小时，光照为800Lux。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养8d。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂洗1分钟，以洗去膜上的转膜液，放入封闭液中，摇床上封闭2小时；清洗后将膜浸于稀释好的一抗中，37℃孵育1.5h。
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| CN1157326A (zh) * | 1996-10-23 | 1997-08-20 | 中国科学院海洋研究所 | 生产转基因海带的方法 |
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| 转基因海带配子体的制备与高效增殖;邓祥元;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20091015(第10期);第42-58页第二章第二节 * |
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