CN106701741A - 一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，包括组分有：磁珠裂解结合液、磁珠、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液。采用的是96孔预分装深孔板模式，可配合核酸自动提取仪，自动提取核酸。在磁珠裂解结合液中，加入TCEP添加剂，大大提高了核酸提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒。本发明还涉及使用磁珠法提取羊水、绒毛样本中核酸的方法。
背景技术
生命体遗传特征的基本单元是核酸，在众多的基因研究等领域中都离不开对核酸的检测，而这关键前提是提取出有效、可靠的核酸，这也是许多核酸分子生物学试验中的关键，如定性PCR、分子杂交，实时荧光定量PCR 等技术。核酸在整个分子生物学中的所具有的无可替代的作用。
在孕妇的产前诊断中，羊水、绒毛样本的核酸检测是非常重要的，特别是针对高龄、高危以及具有不良孕产史、遗传病家族史的孕妇。羊水、绒毛样本的核酸检测可以诊断胎儿是否有先天性畸形、先天代谢缺陷、染色体异常疾病、伴性遗传病等，而这些诊断最主要的前提是有可供检测的核酸。但，羊水、绒毛样本中的遗传物质较少，而且因为涉及到胎儿、孕妇的安全，只能获取少量的样本。还有，羊水、绒毛样本所含的杂质、干扰物质较多，进一步加大了核酸提取的难度。所以，发明一种可以快速、有效、可靠提取羊水、绒毛样本中核酸的试剂盒具有重要的意义，拥有广阔的应用前景。
传统的是用酚-氯仿法等化学方法提取核酸，虽然该方法提取的核酸得率高，纯度好，但其中有使用到酚和氯仿等有毒有害物质，容易对人体的健康造成危害。相比酚- 氯仿法等化学方法的核酸提取技术，柱提法是一种有效、毒性少的核酸提取方法：先裂解样本，然后利用无水乙醇将DNA析出来，通过离心去掉无水乙醇，使核酸吸附于离心柱内硅基质膜上，再通过一系列的洗涤-离心步骤，将核酸以外的杂质去除，最后用低盐洗脱液将核酸从硅基质膜上洗脱下来，得到核酸溶液。除柱提法外，常用的还有磁珠法，这是一种简单有效的核酸提纯方法。磁珠法提取核酸技术是利用磁珠的物理特性提取纯化核酸，不使用酚、氯仿等化学试剂，操作过程涉及到有毒有害的化学物质较少。其使用的磁珠表面连接了可特异地与核酸发生作用的功能基团，具有可逆吸附核酸的特性。提取基本过程是先裂解样品让核酸游离释放，再将核酸与磁珠充分混合，使核酸吸附到磁珠后，在磁场的作用下让磁珠与溶液分离，然后经过几次洗涤，将核酸以外的杂质分离后，用洗脱液使核酸与磁珠分离，磁珠再由磁场中从洗脱液中分离出来，此时洗脱液即为纯化的核酸溶液。虽然柱提法和磁珠法在提取核酸的过程中不使用酚和氯仿等有毒有害物质，但需要反复开盖加液、弃液、离心步骤，经常更换离心管、移液器吸头，且柱提法需要不断离心，磁珠法在弃液时要小心翼翼不能去掉磁珠，当样本数多时，整个步骤就会冗长繁杂，致使提取工作效率低下，容易出差错，且难以避免产生交叉污染。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，该试剂盒操作简单，仅需要添加样本、蛋白酶K即可，使用自动核酸提取试剂仪进行提取，减少了人工操作时间，提高了工作效率，降低了人为错误和交叉污染。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，包括组分有：磁珠裂解结合液、磁珠、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液。所述磁珠裂解结合液含有 Tris-HCl、TCEP、(NH4)2SO4、NP-40、Chelex-100、异丙醇；所述磁珠洗涤液1含有 Tris-HCl、(NH4)2SO4、无水乙醇；所述磁珠洗涤液2中含有CaCl2、EDTA-2Na、无水乙醇；所述磁珠洗脱液中含有Tris-HCl、EDTA-2Na。
进一步的，所述磁珠裂解结合液中：Tris-HCl的浓度为12mmol/L，pH为3.3；TCEP的浓度为40mmol/L；(NH4)2SO4的浓度为80mmol/L；NP-40的浓度为3%；Chelex-100的浓度为0.5%；异丙醇的浓度为40%。
进一步的，所述磁珠洗涤液1中：Tris-HCl的浓度为60mmol/L，pH为6.0；(NH4)2SO4的浓度为250mmol/L；无水乙醇的浓度为50%。
进一步的，所述磁珠洗涤液2中：CaCl2的浓度为5mmol/L；EDTA-2Na的浓度为6mmol/L；无水乙醇的浓度为90%。
进一步的，所述磁珠洗脱液中：Tris-HCl的浓度为20mmol/L，pH为7.5；EDTA-2Na的浓度为2mmol/L。
进一步的，所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是磁珠裂解结合液；第2列和第8列预分装的是磁珠；第3列和第9列预分装的是磁珠洗涤液1；第4、5列和第10、11列预分装的是磁珠洗涤液2；第6列和第12列预分装的是磁珠洗脱液。
进一步的，所述试剂盒采用热封膜，利用热封仪将96孔深孔板封住，防止提取试剂漏液。
进一步的，所述试剂盒配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，自动提取核酸。
一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
步骤1：将96孔预分装深孔板置于离心机中，1500rpm离心1分钟，使液体落回至分装板底部。
步骤2：将96孔预分装深孔板的热封膜小心撕开，在预分装板的第1列和第7列加入200µl的样本，然后加入50µl的蛋白酶K（不能先加蛋白酶K）。
步骤3：将8孔磁套棒置于smart32仪器中后，再将96孔预分装深孔板置于smart32仪器中。
步骤4：按编辑提取程序后，点击运行，进行核酸提取。
步骤5：提取结束后，第6列和第12列中即为核酸溶液。
本发明的有益效果：
（1）提高提取效率
本试剂盒在磁珠裂解结合液中添加了TCEP ，大大提高了提取效率。TCEP是一种无气味、不含硫醇的强力还原剂，可在广泛的pH范围、盐浓度范围、去垢剂浓度范围和温度条件下还原多肽和蛋白的二硫键，提高提取核酸效率。
（2）缩短提取时间
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，仅仅需要离心1min，然后撕开热封膜，加入样本和蛋白酶K即可上自动提取仪提取，人工操作时间是其它提取方法（如酚-氯仿法等化学方法、柱提法、磁珠法）的1/6。
（3）减少人为失误、交叉污染
本试剂盒采用的是96孔预分装深孔板模式，人工操作仅仅需要离心、撕膜、加样本和蛋白酶K，接着直接上自动提取仪即可。简单便捷，不容易犯错，且不用反复加液、弃液等操作，减少了交叉污染。
附图说明
图1为本发明方法提取核酸时使用的96 孔深孔板的俯视图；
图2为按照本发明方法向96孔深孔板各排中注入试剂的示意图；
图3为实施例1的电泳结果图。
具体实施方式：
1.一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒的配制方法：
A 磁珠裂解结合液的配置：先在容量瓶中加入适量无菌水，加入浓度为12mmol/L、pH为3.3的Tris-HCl；加入浓度为40mmol/L的TCEP；加入浓度为80mmol/L的(NH4)2SO4；加入浓度为3%的NP-40；加入浓度为0.5%的Chelex-100；加入浓度为40%的异丙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
B磁珠洗涤液1的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为60mmol/L、pH为6.0的Tris-HCl；加入浓度为250mmol/L的(NH4)2SO4；加入浓度为50%的无水乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
C磁珠洗涤液2的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为5mmol/L的CaCl2；加入浓度为6mmol/L的EDTA-2Na；加入浓度为90%的无水乙醇；混匀，加入无菌水至所需体积。
D磁珠洗脱液的配置：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为20mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl；加入浓度为2mmol/L的EDTA-2Na的；混匀，加入无菌水至所需体积。
E 往96 孔深孔板的第1列和第7列预分装磁珠裂解结合液；往96 孔深孔板的第2列和第8列预分装磁珠；往96 孔深孔板的第3列和第9列预分装磁珠洗涤液1；往孔96 深孔板的第4、5列和第10、11列预分装磁珠洗涤液2；往96 孔深孔板的第6列和第12列预分装磁珠洗脱液。
F封膜：在热封仪上，利用热封仪将96孔板封住。
2. 一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒的应用
以羊水为样本，预分装深孔板1500rpm离心1分钟后，在其第1列和第7列加入200µl的样本后，再加入50µl的蛋白酶K（不能先加蛋白酶K）。然后按照下面表1编辑提取程序，进行核酸提取，最终第6列和第12列中即为核酸溶液。
表1
实施例1
取6份羊水样本，均分为4组。第1组用磁珠裂解结合液中不加添加剂的试剂盒进行提取；第2组及第3组用磁珠裂解结合液中分别加入TCEP、DTT添加剂的试剂盒进行提取，第4组用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit (50)-货号51104试剂盒进行提取。分别将4组提取得到的核酸进行β-Actin扩增，4组PCR产物进行电泳。结果如图3，其中，A1-A6泳道为不加添加剂的结果，B1-B6泳道为Qiagen试剂盒的结果，M泳道为100bp Marker，C1-C6泳道为加入DTT添加剂的结果，D1-D6泳道为加入TCEP添加剂的结果；
表2分别对应在提取相同羊水样本核酸时，磁珠裂解结合液中不加添加剂和分别加入TCEP、DTT添加剂进行提取得到的核酸浓度，以及使用Qiagen公司的QIAamp DNA BloodMini Kit (50)试剂盒提取得到的核酸浓度；
表2
从图3和表2结果看，加了TCEP添加剂后，核酸提取的效率大大提升。
Claims (8)
1.一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠裂解结合液中的各成分分别为：Tris-HCl的浓度为12mmol/L，pH为3.3；TCEP的浓度为40mmol/L；(NH4)2SO4的浓度为80mmol/L；NP-40的浓度为3%；Chelex-100的浓度为0.5%；异丙醇的浓度为40%。
2.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠洗涤液1中各成分分别为：Tris-HCl的浓度为60mmol/L，pH为6.0；(NH4)2SO4的浓度为250mmol/L；无水乙醇的浓度为50%。
3.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠洗涤液2中各成分分别为：CaCl2的浓度为5mmol/L；EDTA-2Na的浓度为6mmol/L；无水乙醇的浓度为90%。
4.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠洗脱液中各成分分别为：：Tris-HCl的浓度为20mmol/L，pH为7.5；EDTA-2Na的浓度为2mmol/L。
5.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用96孔预分装深孔板模式，第1列和第7列预分装的是磁珠裂解结合液；第2列和第8列预分装的是磁珠；第3列和第9列预分装的是磁珠洗涤液1；第4、5列和第10、11列预分装的是磁珠洗涤液2；第5列和第11列预分装的是磁珠洗涤液2；第6列和第12列预分装的是磁珠洗脱液。
6.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的96孔预分装深孔板，加入蛋白酶K和样本即可上机提取，快速简便。
7.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32，自动提取核酸，一次性可提取32人份，耗时约40min。
8.根据权利要求1 所述的一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪smart32提取程序为下表：
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