CN106701669A

CN106701669A - 临床治疗用间充质干细胞及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN106701669A
Application number: CN201510459332.0A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 岳�文; 贾雅丽
Original assignee: South China Institute Of Biomedicine
Current assignee: South China Institute Of Biomedicine
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了临床治疗用间充质干细胞及其制备方法和用途，其中该方法包括：(1)将多个含有间充质干细胞的组织块在第一培养皿中进行培养，以便获得从所述多个组织块中爬出的间充质干细胞，并且从所述多个含有间充质干细胞的组织块中选择优化组织块；(2)将步骤(1)中所获得的优化组织块在第二培养皿中进行培养，以便获得从所述优化组织块爬出的间充质干细胞，其中，在步骤(1)中选择优化组织块的条件包括下列至少之一：(a)无内皮细胞爬出；(b)有间充质干细胞爬出；(c)间充质干细胞最快爬出。该方法对脐带组织的利用率高，细胞的产率大大提高，并且得到的间充质干细胞纯度高，活性好，能够满足临床应用的要求。

Description

临床治疗用间充质干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及细胞的制备方法，更具体地，涉及临床治疗用间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，广泛分布于动物体内骨髓、肝脏、脂肪等多种组织中。MSCs具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞。同时，MSCs易于纯化分离，无免疫原性，且没有伦理问题，使得关于它的基础研究及其临床应用蓬勃发展。

人脐带间充质干细胞(HUMSCs)，是在脐带中在动静脉之间的特殊胚胎粘液样结缔组织华尔通氏胶(Whartonps Jelly)分离得到的基质细胞。人脐带间充质干细胞在细胞含量、增殖能力方面要优于骨髓MSCs，且免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，对产妇及新生儿没有任何的损害，不会有肿瘤细胞，病毒和病原微生物的感染及传播几率也相对较低，无伦理学争议等优点，因此，越来越受到研究工作者们的关注。

然而，脐带间充质干细胞的临床应用还有待进一步开发。

目前，通常采用酶消化法或者是植块法从脐带组织中获取MSCs，酶消化法在酶的选择和消化时间上没有统一的标准，多使用胶原酶，使动物组织细胞间的胶原纤维和胞外蛋白酶解，从而获得单个细胞。但胶原酶消化过度会导致细胞表面一些生活物质的改变进而影响细胞活力，对细胞具有损伤作用。对酶消化脐带组织的时间有一定的要求，且待消化的脐带组织又不是一个完全均一的体系，很难保证所有细胞消化程度的统一性，因此很难把握最佳的消化时间，会影响所得细胞的数量和质量，进而影响以后的研究及使用。另由于现有胶原酶来源于动物内脏，应用酶消化法在分离培养时，存在动物源蛋白和动物源病原物的污染，增加了临床应用干细胞的风险。与胶原酶法相比，植块法可避免上述问题,组织损伤小，脐带组织利用率高，易获得存活较好的细胞。由于迁出细胞未受到损害，且在早期有组织块分泌的营养物质支持，因此较易存活。而现有的植块法虽然操作简单，但是通过机械操作形成的组织块质量参差不齐，贴壁能力也不尽相同，这样会大大影响培养周期；且经常会有内皮细胞的残留，影响原代细胞的质量和纯度；同时对P0代细胞进行传代后，原代组织块完全丢弃，细胞的得率受到很大的制约。更重要的是，以上操作对脐带组织的利用率非常低，且是一个极大的浪费。

因此，间充质干细胞的制备方法有待进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种脐带组织利用率高、细胞得率高、且活性好、纯度高的临床治疗用间充质干细胞，同时提出了该间充质干细胞在制备药物中的用途。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备临床治疗用间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将多个含有间充质干细胞的组织块在第一培养皿中进行培养，以便获得从所述多个组织块中爬出的间充质干细胞，并且从所述多个含有间充质干细胞的组织块中选择优化组织块；以及

(2)将步骤(1)中所获得的优化组织块在第二培养皿中进行培养，以便获得从所述优化组织块爬出的间充质干细胞，

其中，在步骤(1)中选择优化组织块的条件包括下列至少之一：

(a)无内皮细胞爬出；

(b)有间充质干细胞爬出；

(c)间充质干细胞最快爬出。

发明人惊奇的发现，与已经报道的间充质干细胞制备方法相比，本发明的临床级脐带间充质干细胞制备方法：对脐带组织的利用率高，尤其，细胞的产率大大提高，能够进一步满足临床应用量大的需求；并且制备得到的临床治疗用间充质干细胞纯度高，细胞状态好，活性高，分化能力强，能够满足临床应用的功能性质量要求。

另外，根据本发明上述实施例的制备临床治疗用间充质干细胞的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述含有间充质干细胞的组织块来源于脐带组织。

根据本发明的另一些实施例，所述含有间充质干细胞的组织块是通过下列步骤获得的：剔除脐带组织的脐动脉和脐静脉；以及从所述脐带组织中分离华尔通氏胶，其中，所述华尔通氏胶构成所述含有间充质干细胞的组织块。由此，得到的脐带组织的间充质干细胞组织的纯度高，内皮细胞含量少。

根据本发明的实施例，在步骤(2)之后，进一步包括：(3)将所述优化组织块在第三培养皿中进行培养，5-7天后可获得从所述优化组织块爬出的P0代间充质干细胞。由此，该可以获得较多P0代间充质干细胞，对脐带组织的利用率高。

根据本发明的实施例，重复步骤(3)至少一次，优选2～5次。由此，通过重复培养，实现了优化组织块的多次利用，可以获得大量的原代(即P0代)间充质干细胞，对脐带组织的利用率显著提高。

根据本发明的实施例，收集步骤(1)～(3)中所获得的P0代间充质干细胞进行传代培养。由此可以获得大量的P3-P5代的间充质干细胞，从而能够同时满足临床治疗用间充质干细胞对细胞代数和数量的要求。

根据本发明的实施例，所述传代培养采用无血清培养基。根据本发明的一些具体示例，所述传代培养采用无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染。由此，细胞增殖速度快，活性高。

根据本发明的实施例，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，所述传代的时间间隔为2-4天，并且将所得到的P3～P5代间充质干细胞作为临床治疗用间充质干细胞。由此，通过细胞的传代可快速获得临床级别数量的低代数间充质干细胞。

根据本发明的实施例，在步骤(1)～(3)中采用无血清培养基对所述组织块进行培养。根据本发明的一些具体示例，所述培养基为无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染。由此，从组织块爬出的间充质干细胞状态好，增殖能力强，活力高。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种间充质干细胞。所述间充质干细胞是通过前面所述的制备临床治疗用间充质干细胞的方法获得的。发明人惊奇的发现，与已经报道的临床级脐带间充质干细胞制备方法相比：利用本发明的方法制备获得的临床治疗用间充质干细胞纯度高，细胞状态好，活性高，分化能力强，干细胞指标好，具有很高的临床应用价值。

根据本发明的第三方面，本发明提供了前面所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗组织损伤。发明人惊奇的发现，利用前面所述的本发明的方法制备的临床治疗用间充质干细胞，细胞纯度高，活性好，分化能力强，干细胞指标好，能够有效用于制备用于治疗组织损伤的药物，且对组织损伤治疗效果突出。

根据本发明的第四方面，本发明提供了前面所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。发明人惊奇的发现，利用前面所述的本发明的方法制备的临床治疗用间充质干细胞，细胞纯度高，活性好，分化能力强，干细胞指标好，能够有效用于制备治疗阿尔茨海默病的药物，该药物对于阿尔茨海默病病理的各指标均有很大程度的改善。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，两种间充质干细胞的显微观察的形态图片，

其中，

图1A显示了采用常规植块法制备的原代间充质干细胞的细胞形态图片，

图1B显示了采用本发明的方法经第四次重复培养获得的原代间充质干细胞的细胞形态图片；

图2显示了根据本发明一个实施例，实施例1中的优化组织块进行第四次重复培养时获得的原代间充质干细胞传代培养至第3代(P3)的细胞表面标志表达情况的图片；

图3显示了根据本发明一个实施例，实施例1中的优化组织块进行第四次重复培养时获得的原代间充质干细胞传代培养至第3代(P3)时的间质细胞标记和上皮细胞标记表达情况的免疫化学荧光方法检测结果；

图4显示了根据本发明一个实施例，实施例1中的优化组织块进行第四次重复培养时获得的原代间充质干细胞传代培养至第3代(P3)时向成脂、成骨和成软骨分化情况的图片；

图5显示了根据本发明一个实施例，实施例1中的优化组织块进行第四次重复培养时获得的原代间充质干细胞传代培养至第15代(P15)时的核型分析结果图；

图6显示了根据本发明一个实施例，实施例1中获得的间充质干细胞用于小鼠对照组和MSC治疗组的水迷宫结果分析图；

图7显示了根据本发明一个实施例，实施例1中获得的间充质干细胞用于小鼠对照组和MSC治疗组大脑海马部位和皮层部位阿尔茨海默病相关分子标记物表达结果分析图；以及

图8显示了根据本发明一个实施例，实施例1中获得的间充质干细胞用于小鼠对照组和MSC治疗组大脑海马区和皮层神经干细胞关键标志物Nestin蛋白表达结果分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备临床治疗用间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(a)无内皮细胞爬出；

(b)有间充质干细胞爬出；

(c)间充质干细胞最快爬出。

其中，需要说明的是，与普通的间充质干细胞相比，临床治疗用间充质干细胞，一般对细胞的需求量比较大，对细胞的纯度和活性的要求更高，且干性指标正常，即细胞的体外的分化能力得到确认，通常临床用的间充质干细胞为P3-P5代的间充质干细胞，因此需要提高原代间充质干细胞组织的细胞得率，获得尽可能多的原代间充质干细胞，即P0代间充质干细胞。本发明的培养方法，通过对快速爬出间充质干细胞的组织块进行挑选，并转移到第二培养皿进行继续培养，可以分得高纯度，无内皮细胞污染的原代间充质干细胞，从而可以显著提高间充质干细胞的活性和纯度。

根据本发明的实施例，含有间充质干细胞的组织块的来源不受特别的限制，可以通过市售直接购买，也可以从脐带组织中获得。根据本发明的实施例，所述含有间充质干细胞的组织块来源于脐带组织。其中，从脐带组织中获得所述含有间充质干细胞的组织块的方法也不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述含有间充质干细胞的组织块是通过下列步骤获得的：剔除脐带组织的脐动脉和脐静脉；以及从所述脐带组织中分离华尔通氏胶，其中，所述华尔通氏胶构成所述含有间充质干细胞的组织块。由此，得到的脐带组织的间充质干细胞组织的纯度高，内皮细胞含量少。

需要说明的是，步骤(1)中所获得的从各组织块中爬出的间充质干细胞，以及步骤(2)～(3)中所获得的从优化组织块中爬出的间充质干细胞，均为P0代间充质干细胞。

根据本发明的实施例，重复步骤(3)至少一次，优选2～5次。由此，通过重复培养，实现了优化组织块的多次利用，可以获得大量的原代间充质干细胞，对脐带组织的利用率显著提高。

根据本发明的实施例，收集步骤(1)～(3)中所获得的P0代间充质干细胞进行传代培养。由此，可以获得大量的P3-P5代的间充质干细胞，从而能够同时满足临床治疗用间充质干细胞对细胞代数和数量的要求。

根据本发明的实施例，用于进行传代培养的培养基种类不受特别限制，只要能够有效实现间充质干细胞传代，保证细胞增殖速度，保持传代细胞的干细胞活性即可。根据本发明的一些实施例，所述传代培养采用无血清培养基。根据本发明的一些具体示例，所述传代培养采用无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染。由此，细胞增殖速度快，活性高，且能够保持良好的干细胞活性。并且上述无血清培养基中不含任何动物来源的血清与抗生素，能够有效降低传代培养中的异源性蛋白、支原体等污染。

根据本发明的实施例，步骤(1)～(3)中用于对组织块进行培养的培养基种类不受特别限制，只要能够有效促进间充质干细胞爬出，且爬出的间充质干细胞状态好，增殖能力强，活力高即可。根据本发明的一些实施例，在步骤(1)～(3)中采用无血清培养基对所述组织块进行培养。根据本发明的一些具体示例，所述培养基为无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染。由此，从组织块爬出的间充质干细胞状态好，增殖能力强，活力高。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种间充干细胞。所述间充质干细胞是通过前面所述的制备临床治疗用间充质干细胞的方法获得的。发明人惊奇的发现，与已经报道的临床级脐带间充质干细胞制备方法相比：利用本发明的方法制备获得的临床治疗用间充质干细胞纯度高，细胞状态好，活性高，分化能力强，干细胞指标好，具有很高的临床应用价值。

其中，需要说明的是，可以直接将间充质干细胞用于治疗组织损伤或阿尔茨海默病，也可以将以间充质干细胞制备的药物用于治疗组织损伤或阿尔茨海默病。

因而，根据本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，该药物用于治疗组织损伤。发明人惊奇的发现，利用前面所述的方法制备的临床治疗用间充质干细胞，细胞纯度高，活性好，分化能力强，干细胞指标好，能够有效用于制备用于治疗组织损伤的药物，且对组织损伤治疗效果突出。

根据本发明的再一方面，本发明提供了前面所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，该药物可以用于治疗阿尔茨海默病。发明人惊奇的发现，利用前面所述的方法制备的临床治疗用间充质干细胞，细胞纯度高，活性好，分化能力强，干细胞指标好，能够有效用于制备治疗阿尔茨海默病的药物，该药物对于阿尔茨海默病病理的各指标均有很大程度的改善。

其中，根据本发明的一些具体实施例，在本发明的用途中，所采用的间充质干细胞为第3代至第5代。由此，细胞的活性好，纯度高，分化能力强，干细胞指标好，从而，临床治疗效果好。发明人发现，通过采用该间充质干细胞的治疗效果明显优于通过其他方式获得的间充质干细胞。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的间充质干细胞可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在阿尔茨海默病治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防阿尔茨海默病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述间充质干细胞的药物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的间充质干细胞或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的间充质干细胞或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的间充质干细胞、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Gibco公司。

实施例1

以常规植块法为对照(具体方法可参见：Nekanti U,Mohanty L,et al.Optimizationand scale-up of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells for clinicalapplications.Stem Cell Res.2010；5(3):244–254.，通过参照将其全文并入本文)，根据本发明的制备临床治疗用间充质干细胞的方法，按照以下步骤制备间充质干细胞：

首先，收集XX医院新生儿的脐带组织，用含青霉素和链霉素的生理盐水将无乙肝、梅毒、艾滋病感染的健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，其中该剪碎的华通氏胶即为包含间充质干细胞的组织块。

接着，将上述获得的多个包含间充质干细胞的组织块接种于培养皿中，利用无血清培养基(为美国Sciencell公司生产的MSC无血清培养基MSCM-SF，货号：7511)重悬，置于体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱培养7-10天，镜检挑选出最快爬出MSCs(即间充质干细胞)并且无内皮细胞爬出的组织块——即优化组织块。

接下来，将上述筛选获得的优化组织块转移到新培养皿中继续培养，并收集原培养皿中从组织块爬出的间充质干细胞(即P0代间充质干细胞)进行传代培养。其中，优化组织块的培养仍采用上述的无血清培养基，5-7天后可获得从所述优化组织块爬出的P0代间充质干细胞。

进一步，再将所述优化组织块转至新培养皿中进行培养(同样采用上述的无血清培养基)，以便获得从所述优化组织块爬出的间充质干细胞。

接下来，重复上述步骤2-5次，以便充分利用所述优化组织块，获得从优化组织快中爬出的间充质干细胞。

收集每次培养中从组织块爬出的P0代间充质干细胞，至新培养皿中进行传代培养，其中，该传代培养采用上述的无血清培养基，每2-4天传代一次，利用该方法可以得到大量的高纯度原代MSCs。

对比发现，本发明的方法在P0代细胞在得率方面较对照(即常规植块法)提高20-50倍，以此得率传代至临床用细胞代数，可级数增长获得同一批细胞，完全能够满足一个人的多次治疗或者多个人的同时治疗。且与对照相比，本方法对原代细胞的培养条件进行优化，间充质干细胞在无血清培养基中进行培养，可以获得很好的扩增能力，更重要的是，不含任何动物来源血清与抗生素能够降低异源性蛋白、支原体等污染。利用上述无血清培养基进行间充质干细胞的培养，细胞的状态好，增殖能力快，活力高。

实施例2

发明人选取实施例1中的优化组织块进行第4次重复培养时获得的原代间充质干细胞进行形态学检测和表面分子标记物流式检测，以便确保没有内皮细胞以及其他造血细胞的污染，保证细胞的纯度；进行免疫化学荧光、分化实验和细胞核型分析检测，以便确保获得的原代间充质干细胞的质量。具体如下：

1、细胞形态检测

针对实施例1中的优化组织块进行第4次重复培养时获得的原代间充质干细胞(即利用本发明的方法制备的)，以及与本发明的方法同步的对照获得的间充质干细胞进行形态检测，结果见图1。如图1所示，图A显示了利用对照“常规植块法”获得的原代MSC出现明显的内皮细胞；而图B显示了利用本发明的方法“优化组织块法”制备的优化组织块经第四次重复培养时获得的原代MSC，无内皮细胞，形态均一，呈旋涡状贴壁生长。由此，表明采用本发明的方法培养制备的间充质干细胞的纯度和细胞活性明显优于采用常规植块法(对照)获得的间充质干细胞。

2、流式细胞仪检测细胞表面标志

利用流式细胞仪对实施例1中利用本发明的方法获得的P3代间充质干细胞进行表面标志检测，其中该P3代间充质干细胞是将通过本发明的方法制备的优化组织块经第4次重复培养得到的原代间充质干细胞，进行传代培养至P3代获得的。检测方法具体如下：

(1)将优化组织块经第4次重复培养得到的原代MSC细胞传代培养至P3代的细胞，消化后制成单细胞悬液，计数，按4×10⁵个每管分装至离心管。

(2)将离心后的细胞用PBS洗一次，300g离心10min，弃上清。

(3)100微升PBS重悬细胞，加入一抗CD3-FITC，CD29-PE，CD73-PE，CD166-PE，CD105-FITC，CD90-PE，CD14-FITC，CD45-PE，HLA-DR-PE，CD38-FITC，CD31-APC，CD34-PE，并设两个对照，其中一管为直标抗体PE-isotype空白对照，另一管为直标抗体FITC-isotype空白对照，然后于4℃摇床避光反应40min。

其中，各一抗的加入量如下：

(4)用PBS对反应后的细胞清洗3次，每次300g离心10min，1％多聚甲醛固定，4℃下放置，然后进行流式细胞仪检测(一周之内检测完毕)，检测结果见图2。图2显示了细胞的表面标志表达情况。如图2所示，细胞表型均一，细胞表达间质细胞标记CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD166，不表达造血细胞标记CD3、CD14、CD34、CD38和内皮细胞标记CD31，且不表达人白细胞抗原HLA-DR，完全符合“国际细胞治疗协会”关于间充质干细胞表面标志物规定的标准。

3、免疫荧光染色法检测细胞表面标志

通过免疫荧光染色检测法对间充质干细胞进行染色观察，具体方法如下：

(1)将实施例1中通过本发明的方法制备的优化组织块经第4次重复培养得到的原代间充质干细胞，传代培养至P3代以5.0×10³个/孔接种于24孔板，将24孔板中的培养基弃去，用PBS洗涤1～2次。

(2)固定：用新鲜配制(2周内)的4％多聚甲醛室温固定15min，冷却至室温后用含0.05％Tween-20的PBS洗2次。

(3)破膜：常温加0.1％triton-x-100破膜10分钟，PBS洗2次。

(4)封闭：用封闭液(10％山羊血清)室温封闭30分钟，吸去封闭液。

(5)一抗孵育：一抗用封闭液稀释(1:200)，4℃孵育过夜，PBS洗，3×5min。其中一抗包括下列：小鼠抗人a-SMA(Sigma,1:800)，小鼠抗人E-cadherin(BD,1:100)，小鼠抗人N-cadherin(BD,1:100)，兔抗人CK18(Santa cruz,1:50)。

(6)二抗孵育：加入TRITC/FITC标记的IgG二抗(1:100)室温避光反应30min，PBS洗，3×5min。其中二抗包括下列：罗丹明(TRITC)标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，1:100)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，1:100)。

(7)加入室温反应2min，PBS洗，3×5min，第三次PBS留于孔中，置于荧光显微镜下观察，观察结果见图3。

由图3可知，间充质干细胞表达间质细胞标记α-SMA和N-cadherin，不表达上皮细胞标记CK18，E-cadherin。说明采用本发明的方法培养制备的间充质干细胞是典型的间质细胞。

4、免疫化学荧光检测细胞分化能力

通过免疫化学荧光方法对实施例1中第4次重复培养的原代间充质干细胞(即实施例1中通过本发明的方法制备的优化组织块经第4次重复培养得到的原代间充质干细胞)传代培养至P3代的细胞进行分化能力(包括间充质干细胞的成脂肪分化、成骨分化和成软骨分化)的检测，具体如下：

4.1诱导间充质干细胞成脂肪分化

4.1.1诱导分化

将上述的P3代间充质干细胞进行诱导分化，具体方法为：以1.0×10⁴个/孔种于24孔板，培养24h后，将细胞分为2组，一组为诱导分化组，将培养基更换为脂肪诱导培养基，另一组为对照组，采用的培养基为DMEM-HG(即DMEM高糖培养基)+10％FBS，进行继续培养，其中，脂肪诱导培养基的成份为：DMEM-HG培养基(即DMEM高糖培养基)、10％FBS，10^-6M地塞米松(DEX)、0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、60微摩尔/升消炎痛和5微克/ml胰岛素，每三天换液一次，共诱导2周。

4.1.2鉴定

通过油红O染色鉴定脂肪分化，具体方法如下：将6ml 0.5％油红O和4ml蒸馏水，静置8min，滤纸过滤。将诱导细胞去掉培养基，PBS洗一次，加入4％多聚甲醛固定30min。用蒸馏水洗3次，油红O染色20min，蒸馏水再洗3次，镜下观察，细胞形态如图4中的成脂分化图所示，诱导组出现明显的脂滴，油红O染色呈阳性；而对照组无脂滴，油红O染色呈阳性，说明细胞具有强的向脂肪细胞分化的能力。

4.2诱导间充质干细胞成骨分化

4.2.1诱导分化

将上述的P3代间充质干细胞以5.0×10³个/孔种于24孔板，培养24h后，将细胞分为2组，一组为诱导分化组，将培养基更换为成骨诱导培养基，另一组为对照组，采用的培养基为DMEM-HG+10％FBS，进行继续培养，其中，成骨诱导培养基的成份为：高糖DMEM培养基、10％FBS、10^-7M地塞米松(DEX)、50mM维生素C和10微摩尔/升β-磷酸甘油，每三天换液，共诱导5周。

4.2.2鉴定

通过茜素红染色和硝酸银染色两种方法分别鉴定间充质干细胞的成骨分化情况，具体方法如下：

(1)茜素红染色

将经成骨诱导2-3周的间充质干细胞移除培养基，1×PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定30min，然后，将固定后的细胞用1×PBS洗2次，利用Alizarin Red染色5min，然后1×PBS洗3次，光镜下观察拍照，细胞形态如图4中的成骨分化茜素红染色图所示，诱导分化组茜素红染色呈阳性；而对照组呈阴性，说明细胞具有强的向成骨细胞分化的能力。

(2)硝酸银染色

成骨诱导4～5周后，细胞去掉培养基后，PBS洗一遍，加入4％多聚甲醛固定20min，去离子水洗3次，每次5min，加入5％AgNO₃水溶液，于强光下反应1h，去离子水彻底清洗，5％Na₂S₂O₃.5H₂O水溶液处理1min，以去除多余的银，充分水洗。光镜下观察拍照，细胞形态如图4中的成骨分化硝酸银染色图所示。诱导分化组经染色能够看到明显的骨结节，而对照组呈阴性，说明细胞具有强的向成骨细胞分化的能力。

4.3诱导间充质干细胞成软骨分化

4.3.1诱导分化

将上述的P3代间充质干细胞以3.0×10⁵个铺于15ml塑料尖底试管，220g低速离心8min，使细胞形成微团，将细胞分为2组，一组为诱导分化组，将培养基更换为软骨诱导培养基，另一组为对照组，采用的培养基为DMEM-HG(即DMEM高糖培养基)+10％FBS，进行继续培养，其中，软骨诱导培养基的成份为：高糖DMEM、2×10^-7M地塞米松(DEX)、50微克/ml维生素C，1×ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂)(I2521)、10mM丙酮酸钠、1×P/S(即青霉素/链霉素)、50微克/ml脯氨酸和10ng/ml TGF-β3，每4天换液，共诱导5周。

4.3.2鉴定

需要说明的是，MSC形成的微团不能进行正常培养，只有经诱导液培养的微团才可以一直保持微团形态。诱导完毕后，将经诱导的细胞进行石蜡包埋和切片。石蜡切片经二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇1min，95％乙醇1min，85％乙醇1min，75％乙醇1min，自来水洗2min，蒸馏水洗2min，脱蜡后经HE(苏木素-伊红染色)和阿尔辛蓝染色鉴定软骨特异性蛋白聚糖，显微镜下进行观察，细胞形态如图4中的成软骨分化图所示，“对照组”未经诱导细胞的阿尔辛蓝染色呈阴性，而成软骨分化的细胞经阿尔辛兰染色能够明显看到软骨特异性蛋白聚糖呈阳性，说明细胞具有强的向软骨细胞分化的能力。

其中，HE是形态学观察，说明诱导后的组织中仍是完整的细胞结构。而阿尔辛蓝是针对软骨特异性蛋白聚糖的特异染色，完全能够说明分化后的细胞具有软骨细胞的特性。

上述对获得的间充质干细胞进行分化及分化鉴定的结果，表明通过本发明的方法获得的间充质干细胞分化能力强，具有向脂肪、成骨和软骨方向分化的特性。

5、细胞核型分析

将实施例1中第4次重复培养的原代间充质干细胞((即实施例1中通过本发明的方法获得的优化组织块经第4次重复培养得到的P0代间充质干细胞))进行传代培养，根据细胞的状态，每3天传代一次，待细胞培养到15代时，对细胞进行染色体核型分析，结果如图5所示，G-带核型分析未见异常，与正常核型完全一致，为男性正常核型。

综上所述，本发明的间充质干细胞制备方法效果显著，可获得大量的MSCs，而且简单易行，成本低，安全性好，对于开发MSC在临床上的各种应用具有很高的价值。

实施例3脐带间充质干细胞干预对快速脑老化鼠认知功能障碍的实验研究

1.材料

1.1研究对象

快速老化小鼠SAMP820只(雄性)。

1.2人脐带间充质干细胞是通过实施例1所述的方法得到的。

1.3实验仪器及设备

Morris水迷宫(Morris water maze)的组成：水迷宫由圆形水池、平台和记录系统三部分组成。水池直径150cm，高50cm，随意将水池分为四个象限(东北、东南、西南和西北象限)。每天实验开始，水池注水30cm深，并加入1斤奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在21℃±1℃左右。水池四周存在丰富的空间参照物(门、灯、桌椅、摄像头及实验者等)，且位置保持不变，以供小鼠定为平台。圆柱形平台直径6cm，高29cm，置于任一象限中央，平面没于水面下1cm。摄像头置于水池中央的上方1.5m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间、初始角度及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。

2.方法

2.1动物分组

小鼠随机分为对照组(注射生理盐水)、MSC治疗组，每组10只，MSC的给药剂量为5×10⁶hUC-MSCs/只,腹腔注射。模型组及空白对照组给予等体积的生理盐水。10周后进行行为学测试。

2.2行为学测试

主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分

定位航行试验

历时5天，每天将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中1次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)。

空间探索试验

是在定位航行试验后去除平台，随机选取一个入水点后，将小鼠依次从该入水点放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察小鼠对原平台的记忆。

2.3数据处理

所有数据用均数±标准差(x±S)，表示，定位航行实验所获得的数据采用重复测量数据的双因素方差分析(two-way ANOVA)。在空间探索实验样本间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验水准定位P＜0.05为差异有显著性。结果如图6所示。

图6.A是水迷宫实验中小鼠的逃避轨迹；图6.B是定位航行实验中第3、4、5天小鼠逃避潜伏期；图6.C空间探索实验中第6天，小鼠穿台次数。由图6可以看出，加入MSC治疗，从第三天开始收集数据进行分析，可发现在数据收集的第3、4、5天后的小鼠的逃避潜伏期相比PBS注射组有明显缩短的趋势，MSC治疗小组小鼠的逃避轨迹有着明显的径向性和目的性。在空间探索实验中也可以看到，治疗组小鼠的穿台次数增。以上结果表明，MSC确实有改善模型小鼠空间记忆的作用。

实施例4脐带间充质干细胞干预对快速脑老化鼠中阿尔茨海默病相关分子标记物影响的研究1.材料

1.1研究对象

快速老化小鼠SAMP812只(雄性)。

1.2人脐带间充质干细胞是通过实施例1所述的方法得到的。

2.方法

2.1标本准备：

2.1.1用于免疫组化取材：最后1次Morris水迷宫测试24h后，小鼠用1％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管至主动脉，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水，至肝脏变白改灌注液为4％多聚甲醛，灌注时间约30min，见小鼠尾巴、四肢僵硬视为满意；灌注完毕后断头取脑，投入4％多聚甲醛溶液中过夜，脱水后，石蜡包埋。

2.1.2提取大脑皮层和海马蛋白：最后1次Morris水迷宫测试24h后，小鼠用1％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管至主动脉，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水，至肝脏变白后断头取脑。参照小鼠脑立体定位图谱分离海马和大脑皮层。分别至于EP管中，每管加入500微升Ripa+1％PI置于4℃裂解过夜。然后3000转/离心20分钟，吸取上清并用分光光度仪测量浓度，置于-80℃保存。

2.2检测

2.2.1免疫组化：取小鼠大脑石蜡标本，以4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2min×3次。再加蒸馏水新鲜配置0.5％H₂O₂，室温30min以灭活内源性过氧化氢酶。双氧水洗2min×3次。滴加正常山羊血清，室温20min。甩去多余液体，不洗。分别滴加一抗BACE(1∶800)，一抗GSK-3β(1∶800)，一抗P-tau(1∶800)，以PBS代替一抗作阴性对照，37℃下孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)37℃30min。PBS洗2min×3次。滴加SABC，20～37℃20min。PBS洗5min×4次。DAB显色。蒸馏水反复洗涤。脱水，透明，封片。标本于显微镜下观察结果。

2.2.2蛋白免疫印迹：取海马区的蛋白，进行电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育之后进行显影。

结果如图7所示，

图7.A是鼠海马区和大脑皮层内的P-Tau表达；图7.B是鼠海马区和大脑皮层内的GSK-3β表达；图7.C是鼠海马区内的BACE的表达；图7.D是蛋白免疫印迹结果，鼠海马区内的APP和P-tau蛋白表达。由图7可以看出，经MSC治疗的快速脑老化小鼠中与Aβ形成老年斑相关的BACE1限速酶，引起Aβ聚集的GSK-3β都下降明显，引起神经元纤维缠结的P-tau蛋白也在经过MSC治疗的快速脑老化小鼠中出现了下降，而蛋白免疫印迹的结果也显示只用PBS治疗的快速脑老化小鼠的APP蛋白表达相比MSC治疗小鼠组增加，而经MSC治疗的快速脑老化小鼠中P-tau蛋白的下调，表明MSC的治疗一定程度上可以缓解引起阿尔茨海默病最主要的两个病理特征。

实验例5脐带间充质干细胞干预提高快速脑老化鼠中海马和皮层的神经干细胞关键标志表达

1.材料

1.1研究对象

快速老化小鼠SAMP820只(雄性)。

1.2人脐带间充质干细胞是通过实施例1所述的方法得到的。

2.方法

2.1标本准备：

2.2检测方法

2.2.1免疫组化：取小鼠海马区石蜡标本，以4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2min×3次。再加蒸馏水新鲜配置0.5％H₂O₂，室温30min以灭活内源性过氧化氢酶。双氧水洗2min×3次。滴加正常山羊血清，室温20min。甩去多余液体，不洗。滴加一抗Nestin(1∶800)，以PBS代替一抗作阴性对照，37℃下孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)37℃30min。PBS洗2min×3次。滴加SABC，20～37℃20min。PBS洗5min×4次。DAB显色。蒸馏水反复洗涤。脱水，透明，封片。标本于显微镜下观察结果。

2.2.2蛋白免疫印迹：取海马区或者是大脑皮层的蛋白，进行电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育之后进行显影。

结果如图8所示，图8.A显示对比治疗对照组，MSC治疗组在海马区和大脑皮层内Nestin阳性细胞数目增多，细胞密集，胞体肥大，伸出长短不一、粗细各异的突起；

图8.B显示对比治疗对照组，MSC治疗组促进海马区和大脑皮层内Nestin阳性的神经干细胞的增殖，可见细胞呈卵圆形、三角形或梭形，胞浆呈棕黄色，胞核为蓝色；

图8.C显示蛋白免疫印迹结果，相比治疗对照组，MSC治疗可提高海马区及大脑皮层的Nestin蛋白表达

综上，由图8可以看出，经MSC治疗的快速脑老化小鼠的大脑皮层与海马区中Nestin阳性细胞数目增多，细胞密集，而对大脑皮层与海马区的蛋白免疫印迹结果也显示nestin蛋白的上调，表明MSC的治疗一定程度上可以促进诱导神经干细胞的激活。

传统方法获得脐带间充质干细胞主要存在的问题有：首先，数量受到很大限制，因为传统方法所获细胞得率较低，同时间充质干细胞本身存在代数的限制(一般为3-5代用于临床治疗)，这使得干细胞在实际应用过程中其数量成为首要解决的问题。其次，质量问题，因为传统方法获得的细胞纯度和均一性仍然存在不足，也会影响其干性的维持；再加上数量不足而不能满足每次治疗所需的细胞数从而导致治疗的效果不明显甚至没有效果，例如，为了确保每次输注足够数量的细胞，经常发生同一个体输注不同来源的脐带间充质干细胞产品，产品之间的均一性和稳定性不能保证，这样会直接影响治疗效果的稳定和评估，输注不同个体来源的脐带间充质干细胞也增加了很多未知的治疗隐患。另外，传统方法所获得的细胞由于上述问题也会增加更多经济负担。而通过我们的方法获得的脐带间充质干细胞是针对应用的临床级脐带间充质干细胞，其突出特点是细胞的产率高，与传统方法相比至少提高8-10倍，更重要的是，细胞活性高，纯度高，分化能力强，稳定性和均一性大大提高，也就是说，数量和质量的提高对于临床需求是最重要的。另外，利用优化的方法本身也能大大降低成本和经济负担。因此，通过我们的方法所获得的脐带间充质干细胞对于临床应用较传统方法相比具有非常明显的优势。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种制备临床治疗用间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

(a)无内皮细胞爬出；

(b)有间充质干细胞爬出；

(c)间充质干细胞最快爬出。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有间充质干细胞的组织块来源于脐带组织。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有间充质干细胞的组织块是通过下列步骤获得的：

剔除脐带组织的脐动脉和脐静脉；以及

从所述脐带组织中分离华尔通氏胶，

其中，所述华尔通氏胶构成所述含有间充质干细胞的组织块。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后，进一步包括：

(3)将所述优化组织块在第三培养皿中进行培养，5-7天后可获得从所述优化组织块爬出的P0代间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，重复步骤(3)至少一次，优选2～5次，

任选地，收集步骤(1)～(3)中所获得的P0代间充质干细胞进行传代培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述传代培养采用无血清培养基，

任选地，所述传代培养采用无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染，

任选地，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，所述传代的时间间隔为2-4天，并且将所得到的P3～P5代间充质干细胞作为临床治疗用间充质干细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)～(3)中采用无血清培养基对组织块进行培养，

任选地，所述培养基为无血清培养基(Sciencell)，无任何动物源蛋白和动物源病原物的污染。

8.一种间充干细胞，所述间充质干细胞是通过权利要求1-8任一项所述的方法获得的。

9.权利要求8所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗组织损伤。

10.权利要求8所述的间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。