CN106687586A - 具有木聚糖酶活性并具有对含木糖多糖的高转化率的多肽 - Google Patents

Abstract

本申请提供了具有木聚糖酶活性的新型多肽和编码这些多肽的各自的核酸序列以及包含这些核酸序列的载体和由这些载体转化的宿主细胞。此外，本发明提供了产生这些多肽的方法和包含本发明多肽的组合物。

Description

具有木聚糖酶活性并具有对含木糖多糖的高转化率的多肽

本申请提供了具有木聚糖酶活性的新型多肽和编码这些多肽的对应核酸序列，以及包含这些核酸序列的载体和由这些载体转化的宿主细胞。此外，本发明提供了生产这些多肽的方法和包含本发明多肽的组合物。

半纤维素，特别是含木聚糖的多糖，是用于生产单糖的有价值的来源，该单糖可以被转化为生物燃料、工业平台化学品、消费品、食品和饲料添加剂。由于这种材料的非均一化学结构，其降解需要一系列物理化学和/或酶处理步骤。非常需要能够有效地、完全地或选择性地水解含戊糖多糖的方法。

来自生物质的戊糖的重要来源是木聚糖。木聚糖构成约15至25重量％的木素纤维素生物质和至多70重量％的其它原料例如燕麦。木聚糖代表植物细胞壁的主要成分之一，并且构成农业废产品例如小麦秸秆、玉米秸秆、玉米穗轴和棉花种子的主要部分。木聚糖由通过β-1-4糖苷键连接的木糖单体亚单元组成，为与多种其它组分例如阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、甲基葡糖醛酸和乙酰基的复杂聚合物形式。在谷物中，木聚糖通常含有α-1,2-和/或α-1,3-连接的L-阿拉伯呋喃糖苷的侧链。这些经取代的木聚糖通常被称为阿拉伯木聚糖。用葡萄糖取代的木聚糖被称为葡糖木聚糖。还存在这些木聚糖的混合形式。

木聚糖酶(β-1,3-木聚糖木糖水解酶或β-1,4-木聚糖木糖水解酶；E.C.3.2.1.8)是解聚木聚糖、阿拉伯木聚糖和/或其它含木糖多糖的木聚糖分解酶。内切木聚糖酶(例如内切-β-1,4-木聚糖酶)水解木聚糖、阿拉伯木聚糖和/或其它含木糖多糖中的内部β-糖苷键，以产生较小分子量的木糖寡聚体或木糖单体。

目前木聚糖酶的主要工业应用是，例如，在纸浆和造纸工业中改善纸浆的可漂白性，以及在食品工业中产生木糖作为甜味剂木糖醇的基础。此外，木聚糖酶可用于含有谷物(例如大麦、小麦、玉米、黑麦、黑小麦或燕麦)或富含木聚糖、阿拉伯木聚糖和/或葡糖木聚糖的谷物副产物的食品和饲料组合物中。向动物饲料或烘焙产品中添加木聚糖酶改善植物细胞壁的分解，这分别导致植物营养物的更好利用和/或延长的面包新鲜度。在饲料组合物中，木聚糖酶添加导致改善的动物生长速率和饲料转化率。此外，含有木聚糖的饲料组合物的粘度可以通过木聚糖酶降低，导致更好的可接受性和吸附。

尽管已知的真菌和细菌木聚糖酶的数量相对较高，但既能够用于预期目的并且工业上适用(并由此获得商业利润)的木聚糖酶的数量仍然有限。这主要是由于特定的物理工艺条件，例如高温和特定的pH条件，以及缺乏底物和/或产物选择性及对特定木聚糖酶的相容性，导致低转化率。这些缺点限制了木聚糖酶的使用。

由于生物质如多种来源的含纤维素和含木素纤维素的生物质向有价值产物的转化越来越重要，因此对能够进行有效的和可用于工业转化的木聚糖酶的需求越来越大。在EP 2 336 152中公开了具有增强的热稳定性的高效木聚糖酶。但是，为了进一步提高产物产生和纯化的效率，必须进行进一步的改进。

因此，本发明的发明人给自己设定了开发新型木聚糖酶的任务，所述新型木聚糖酶由于高转化率(对顽抗性底物如含木糖的多糖也具有高转化率)而能够有效地生产产物。此外，高的底物相容性和与其他酶的协同相互作用的能力应该导致进一步的过程增强和进一步的成本降低。最后，木聚糖酶还应显示高的温度和pH稳定性。

本发明的发明人现已惊奇地发现，该任务可以通过具有木聚糖酶活性且具有对含木糖多糖的高转化率的多肽实现，其中所述多肽包含与SEQ ID No：2具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。

术语“木聚糖酶活性”是指能够催化β-1,3-木糖苷键或β-1,4-木糖苷键的水解并释放较小分子量的木糖寡聚体或木糖单体的所有多肽。术语“木聚糖酶”在本文中被定义为β-1,3-木聚糖木糖水解酶或β-1,4-木聚糖木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。

术语“含木糖多糖”是指含有木糖寡聚体例如木三糖、木五糖、木己糖或木糖聚合物例如木聚糖或半纤维素的任何底物。含木糖多糖的实例是小麦秆、木材、谷秆和/或谷壳、玉米秸秆、甘蔗渣、燕麦壳、柳枝稷、纤维素、原纸浆(从纸浆和纸张生产获得)及其混合物，以及木素纤维素植物材料。

氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名是根据IUPAC的建议进行的。通常，氨基酸根据单字母代码在本文件中命名。

术语“含木糖多糖的高转化率”是指在使中性汽爆小麦秸秆在pH 5和50℃下经该肽处理24小时时，将某些底物的至少60重量％(优选至少70重量％，更优选至少75重量％，甚至更优选至少80重量％，特别优选至少85重量％，最优选至少90重量％)的含木糖多糖转化为木糖和/或含木糖的寡糖和葡萄糖的能力。

在另一个优选的实施方案中，在使中性汽爆小麦秸秆在pH 5和50℃下经根据本发明的多肽处理24小时时，所述肽将含木糖多糖转化为木糖和/或含木糖寡糖以及葡萄糖单体，其重量比为至少5:1，优选7:1，并且最优选10:1。

根据本发明的多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少75％序列同一性，优选至少77％、进一步优选至少80％、特别优选至少85％、甚至更优选至少90％、还优选至少95％、进一步优选至少98％、最优选至少99％的序列同一性。

根据本发明的多肽优选包含在分泌入上清液期间被切割掉的信号肽。

根据本发明的多肽优选包含多于250个氨基酸的多肽链。更优选地，多肽链的长度为290-500个氨基酸，甚至更优选320-400个氨基酸。最优选地，多肽包含379至390个氨基酸残基。

根据本发明的多肽优选具有大于30kD的分子量。更优选地，尺寸在32kD和45kD之间，甚至更优选在34.5kD和42.5kD之间。最优选地，多肽具有40kD和42kD之间的大小。特别合适的大小是未修饰的多肽分子的41.9KD。

此外，特别优选地，多肽的氨基酸序列具有如SEQ ID No：2或SEQ ID No：4所定义的序列，其中1至30个氨基酸残基被置换、缺失或插入(全部也称为“突变”)。

特别优选的是SEQ ID NO：2的蛋白质的变体。“蛋白质变体”是其氨基酸序列在一个或多个位置上与该亲本蛋白质不同的多肽，其中所述不同可以是一个氨基酸被另一个氨基酸置换，单个氨基酸或几个氨基酸的缺失，或另外的氨基酸或氨基酸段插入亲本序列。根据定义，亲本多肽的变体与其他多肽通过使用ClustalW算法(Larkin M.A.,BlackshieldsG.,Brown N.P.,Chenna R.,McGettigan P.A.,McWilliam H.,Valentin F.,WallaceI.M.,Wilm A.,Lopez R.,Thompson J.D.,Gibson T.J.and Higgins D.G.(2007)ClustalWand ClustalX version 2.Bioinformatics 2007 23(21):2947-2948)比较序列同一性(比对)时是不同的。产生这样的蛋白质变体的方法包括随机诱变或定点诱变，位点饱和诱变，基于PCR的片段装配，DNA改组，体外或体内同源重组，以及基因合成方法。

单氨基酸的交换或置换这样描述：先指出原始氨基酸的单字母代码、然后是其位置编号和替换氨基酸的单字母代码，即在第1位的谷氨酰胺变为该位置的亮氨酸被描述为“Q1L”。对于序列中单个位置的缺失，替换氨基酸的符号被三字母缩写“del”替代，因此第3位的谷氨酰胺的缺失将被称为“Q3del”。插入的另外的氨基酸延用之前位置的编号，之后用按照字母表顺序的小写字母表示它们相对于插入点的距离。因此，在第3位后插入两个色氨酸被称为“3aW，3bW”。非翻译密码子TAA、TGA和TAG在核酸序列中的引入在氨基酸序列中表示为“*”，因此在氨基酸序列的第4位引入终止密码子被称为“T4*”。

多重突变由加号或斜杠或逗号分隔。例如，在第20位和第21位的分别用丙氨酸和谷氨酸替换甘氨酸和丝氨酸的两个突变分别表示为“V20G+S21T”或“V20G/S21T”“V20G,S21T”。

当给定位置的氨基酸残基被两个或更多个其他氨基酸残基置换时，这些残基通过逗号或斜杠分开。例如，用甘氨酸或谷氨酸置换第30位的丙氨酸表示为“V20G,E”或“V20G/E”或“V20G,V20E”。

当在本文中鉴定出适合于突变的位置而没有建议任何特定突变时，应当理解，任何氨基酸残基均可以替代该位置中存在的氨基酸残基。因此，例如，当提及第20位的缬氨酸突变但未指定时，应当理解，该丙氨酸可以缺失或被任何其他氨基酸残基(即R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任何一个)置换。

术语“相似突变”或例如“相似置换”是指本领域技术人员认为与第一突变类似的氨基酸突变。本文中相似的意思是具有相似化学特性的氨基酸。如果，例如，在特定位置的突变导致非脂肪族氨基酸残基(例如Ser)被脂族氨基酸残基(例如Leu)置换，则在相同位置用不同的脂族氨基酸(例如Ile或Val)置换被称为相似突变。其它氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、pK值和本领域已知的其它氨基酸特征。因此，相似突变可以包括置换，例如碱性的置换碱性的，酸性的置换酸性的，极性的置换极性的，等等。由此得到的氨基酸集合由于结构原因可能是保守的。这些集合可以以维恩(Venn)图的形式描述。可以根据例如以下氨基酸分组进行相似置换：疏水性：F W Y H K M I L V A G；芳香族：F W Y H；脂肪族：I L V；极性：W Y H K R E D C S T N；带电荷：H K R E D；带正电荷：H K R；带负电荷：E D。

作为用于描述蛋白质变体的氨基酸编号和指称蛋白质变体的惯例，SEQ ID NO：4给出的亲本蛋白质序列中，氨基酸序列QAQTWG中的第一个谷氨酰胺(Q)被称为位置编号1或Q1或谷氨酰胺1。所有氨基酸的编号将根据其在SEQ ID No：2中给出的亲本序列中相对于该位置编号1的位置。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了新的多肽FfXyn1(SEQ ID No：2)。此外，特别优选的实施方案包括包含相应成熟蛋白的多肽mFfXyn1(SEQ ID No：4)以及具有N末端信号肽的融合体，例如SEQ ID No：4的编码核酸和SEQ ID No：5。

本发明还提供了本发明的多肽与其他蛋白质序列的融合蛋白。这样的序列可以代表催化活性蛋白，结合蛋白，影响细胞表达方面的蛋白或影响融合靶蛋白的化学、催化、生物或物理性质的序列，或者没有特别效果。融合体还包括仅含部分靶序列的那些，其中该部分有助于融合蛋白的酶活性。在具有催化活性蛋白质的融合体中，特别感兴趣的是具有选自碳水化合物修饰酶的蛋白质的那些。在具有结合蛋白的融合体中，特别感兴趣的是由来自碳水化合物修饰酶的结合模块制备的那些。众所周知，这种融合体可以有益地影响融合部分的酶学和物理性质，特别是靶蛋白的酶学和物理性质。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，根据本发明的多肽与对半纤维素中存在的木聚糖或其它聚合糖具有特定亲和力的碳水化合物结合模块融合。

在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，根据本发明的多肽的融合伴侣选自来自第13、15、22、31、35、36或37类的碳水化合物结合模块(CBM)序列(CAZy数据库；CantarelBL，Coutinho PM，Rancurel C，Bernard T，Lombard V，Henrissat B(2009)TheCarbohydrate-Active Enzymes database(CAZy)：a expert resource forGlycogenomics.Nucleic Acids Res 37：D233-238[PMID：18838391])。

根据本发明的多肽的进一步优选的CBM融合伴侣选自第13类，是浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(Blast登录号AAC26525.1)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Af293(Blast登录号EAL91233.1)的木聚糖结合模块。

根据本发明的多肽的进一步优选的融合伴侣是褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)(Blast登录号AAZ55678.1)和船蛆杆菌(Teredinibacter turnerae)T7901(Blast登录号ACS93528.1)的CBM。

来自第22类的根据本发明的多肽的另外优选的CBM融合伴侣是类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)(Blast登录号CAA07173.1)、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)(Blast登录号AAC43719.1)或Xylanimicrobium pachnodae(Blast登录号AAD54768.1)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)(Blast登录号CAA90745.1)或热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor sp.)Rt69B.1(Blast登录号AAB95326.1)的木聚糖结合模块。

选自第36类的根据本发明的多肽的另一优选CBM融合伴侣是Clostridiumphytofermentans ISDg(Blast登录号ABX42059.1)的木聚糖结合模块。

选自第37类的根据本发明的多肽的进一步优选的CBM融合伴侣是白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)8(Blast登录号AAT48119.1)的木聚糖结合模块。

根据本发明的多肽的进一步优选的CBM融合伴侣是里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶1(Blast登录号XP_006969224)的第1类纤维素结合模块。

根据本发明的多肽的特征还在于具有高的热加工稳定性。优选地，根据本发明的多肽在50mM磷酸缓冲液中于50℃中孵育4小时后保持其木聚糖酶活性的至少80％，更优选大于85％，甚至更优选至少90％，特别是至少95％，最优选至少99％。

根据本发明的多肽在升高的温度下的活性通过在以下条件下在多个温度下测量木聚糖水解一定量的时间来确定：pH5、2％w/w干重底物浓度、1重量/重量％干重的酶:木聚糖比(E/S)。

根据本发明的多肽优选在40至77℃的温度范围内显示最佳木聚糖酶活性。最优选地，根据本发明的多肽在45至70℃、最优选50至65℃的温度范围内显示木聚糖酶活性。在本文中，术语“最佳木聚糖酶活性”应理解为当在pH 5下将该酶与木聚糖一起孵育30分钟时导致还原糖末端最高释放的温度。

根据本发明的多肽的特征还在于宽的pH活性谱。在一个优选的实施方案中，根据本发明的多肽在5.0-5.5、更优选4.0-6.0、最优选3.5-8.5的pH范围里具有活性。术语“在pH下具有活性”应理解为在50℃下将该酶与木聚糖一起孵育30分钟时，与最大pH活性相比，在测量pH下具有最小10％的剩余活性。

根据本发明的多肽的特征还在于具有高的蛋白酶稳定性。在一个优选的实施方案中，根据本发明的多肽在pH为7.8以及50℃的温度下经胰蛋白酶处理1小时后保持其木聚糖酶活性的至少80％，优选至少85％，特别优选至少90％，最优选至少95％。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的多肽在pH为3且温度为37℃下经胃蛋白酶处理2小时后保持其木聚糖酶活性的至少80％，优选至少85％，特别优选至少90％，最优选至少95％。

根据本发明的多肽的特征还在于在多种微生物中具有高表达和高分泌速率，特别是来自真菌和/或酵母宿主的分泌。更优选地，将与编码该多肽的核酸功能连接的启动子引入合适的表达宿主中，之后根据本发明的多肽以超过100mg/l的水平、优选超过500mg/l的水平、特别优选超过750mg/l的水平、甚至更优选以1g/l的水平、最优选以1.25g/l的水平表达和分泌到上清液中。本申请中公开的启动子是优选的。

合适的表达宿主优选酵母，更优选酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、小扁豆属(Komagataella)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)的酵母；特别地选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂耶氏酵母(Yarrowina lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、Komagataella pastoris和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

另一种合适的表达宿主是细菌。特别合适的表达宿主是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)，植物克雷伯菌(Klebsiella planticola)和大肠杆菌(Escherichia coli)。

另一种合适的表达宿主是真菌，选自青霉属(Penicillium)，木霉属(Trichoderma)，肉座菌属(Hypocrea)，曲霉属(Aspergillus)，鸡油菌属(Cantharellu)，牛肝菌属(Boletos)，伞菌属(Agraicus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，平革菌属(Phanerochaete)，毁丝霉属(Myceliophthora)，毛壳菌属(Chaetomium)，腐质霉属(Humicola)，金孢子菌属(Chrysosporium)，篮状菌属(Talaromyces)和脉孢菌属(Neurospora)。特别合适的表达宿主是黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，Chrysosporiumlucknowense，绿色木霉(Trichoderma viridae)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，Hypocaea pseudokonigii和埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)。

测定培养物上清液中分泌的蛋白和/或酶的表达能力即产量的方法是本领域技术人员已知的。

本发明还提供了编码根据本发明的多肽的核酸，所述多肽具有与SEQ ID No：1、No：3、No：5或No：6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，提供编码下述多肽的核酸，所述多肽具有与原始形式和成熟形式(SEQ ID NO:3)的SEQ ID NO:1(编码FfXyn1)以及与用于增强丝状真菌如里氏木霉(SEQ ID NO：5)和酵母如酿酒酵母(SEQID NO：6)中的异源生产的信号肽的融合体至少75％序列同一性，优选至少80％，进一步优选至少85％，特别优选至少90％，甚至更优选至少92％，还优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性。

在另一个优选的实施方案中，编码根据本发明的多肽的核酸具有如SEQ ID No：1、No：3、No：5或No：6所定义的序列，其中1至30个核酸被置换，缺失或插入(全部称为“突变”)。特别优选木聚糖酶的氨基酸序列、蛋白质结构和/或活性中心的编码区内的突变。

术语“突变”包括任何种类的核苷酸序列修饰，包括插入、缺失、点突变、倒位或其组合。关于氨基酸序列修饰和突变的定义相应地适用。

本发明还提供了包含本发明的核酸的载体。关于本发明的核酸序列的定义相应地适用。

游离地维持的载体的实例是细菌质粒、酵母质粒、基于着丝粒的线性DNA、病毒来源的构建体如SV40、噬菌体DNA、基于真菌ARS的DNA载体、杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病以及衍生自质粒和噬菌体或病毒DNA的组合的载体。

根据本发明的合适的表达载体可以包含一种或多种可翻译地偶联至本发明核酸的遗传元件，其代表启动子序列、转录起始位点、用于翻译起始的元件以及用于蛋白质输出的功能元件。

本发明的载体可以编码包括多于一种木聚糖酶的多于一种多肽，或者可以编码包含根据本发明的木聚糖酶的融合多肽。

根据本发明的载体可以游离地维持在宿主细胞中或整合到宿主的染色体中。

本发明还提供了用根据本发明的载体转化的宿主细胞。根据本发明的宿主细胞可以用于重组蛋白质生产或用于将含木糖的底物代谢转化成优选的代谢物。

根据本发明的重组宿主细胞优选选自细菌，酵母或真菌细胞。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自由以下组成的组：埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，假单胞菌属(Pseudomonas)，乳杆菌属(Lactobacillus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)；酿酒酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，假丝酵母属(Candida)，耶氏酵母属(Yarrowia)，Komagataella，毕赤酵母属(Pichia)，汉逊酵母属(Hansenula)，青霉属(Penicillium)，木霉属(Trichoderma)，肉座菌属(Hypocrea)，曲菌属(Aspergillus)，鸡油菌属(Cantharellu)，伞菌属(Agraicus)，牛肝菌属(Boletos)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，平革菌属(Phanerochaete)，毁丝霉属(Myceliophthora)，毛壳菌属(Chaetomium)，腐质霉属(Humicola)，金孢子菌属(Chrysosporium)，篮状菌属(Talaromyces)和脉孢菌属(Neurospora)。

优选地，宿主细胞选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)，植物克雷伯菌(Klebsiella planticola)，大肠杆菌(Escherichia coli)，变青链霉菌(Streptomyces lividans)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，解脂耶氏酵母(Yarrowina lipolytica)，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)，Komagataella pastoris，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，里氏木霉(Trichoderma reesei)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile)。

根据本发明的重组宿主细胞可以包含一个或多个根据本发明的载体。

本发明的另一方面包括允许在体内或体外表达根据本发明的多肽、特别是FfXyn1蛋白的表达盒。

表达盒优选包含编码本发明的多肽的基因(优选FfXyn1基因)的编码序列上游的启动子区，参与翻译起始复合物形成的位点，任选的调节序列元件例如阻遏物的结合或增强子位点和任选的转录终止序列。启动子可以含有允许结合编码序列或功能性mRNA转录所需的蛋白质因子的序列。此外，启动子的序列在给定的生理或化学条件下可以影响转录的有效性。启动子可包括紧邻编码区或位于更远区域中的元件作为增强子。启动子可以是原核、真核、原生或病毒来源的或天然合成的。优选的启动子包括β半乳糖苷酶(lacZ)基因的细菌启动子、色氨酸操纵子启动子(trp)，四环素抗性基因启动子(tet)，araBAD启动子，病毒衍生的启动子T7、T3、PL或PR。优选的用于在酵母中表达的启动子包括甘油醛磷酸脱氢酶(GAP)启动子，己糖激酶启动子，醇脱氢酶ADE2启动子，GAL1，GAL10，TEF，和甲基营养型酵母的甲醇代谢途径的启动子如AOXI、MOXI或FMDH，以及铜诱导的CUP1启动子。优选的用于在丝状真菌中表达的启动子包括来自纤维素分解酶如CBHI、CBHII、或EGI或II、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、磷酸甘油酸激酶(pgk)的那些启动子和糖酵解途径的基因的任何启动子。

编码根据本发明的多肽的基因的表达水平可以通过调整引入宿主细胞中的基因的拷贝数来增加，优选导致多于单个拷贝的基因。为了优化基因的表达，可以调节启动子，这要么通过随着添加化学诱导剂而进行的诱导，要么通过调节物理参数实现。可诱导系统的实例包括四环素阻遏系统，Lac阻遏系统或温度诱导型PL启动子。或者，通过在培养物中达到合适的生理状态来去阻遏启动子可以是有用的策略(PhoA、Trp、Adh2、Fmdh、CBHI的启动子)。在其他情况下，使用强的稳定启动子可能是优选的(GAP、TEF)。

信号肽序列的翻译偶联可用于将根据本发明表达的多肽导向细胞室，细胞器或从宿主细胞中输出。信号序列是本领域熟知的。实例是来自OmpA、OmpT、PelB、PhoA、葡聚糖酶或β-内酰胺酶的周质靶向的前导序列。用于蛋白质分泌的信号肽可以在天然分泌的碳水化合物修饰酶中发现，即来自纤维二糖水解酶I或II、内切葡聚糖酶、amyE的编码序列的前导序列，或酿酒酵母(S.cerevisiae)Mfa或鸡卵溶菌酶的信号肽。

表达盒可以置于根据本发明的载体或载体构建体中，其可以游离地保持在宿主细胞中或整合到宿主的染色体中。已知载体的实例是细菌质粒、酵母质粒、基于着丝粒的线性DNA、来源于病毒如SV40的构建体、噬菌体DNA、杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒的衍生物以及衍生自质粒和噬菌体或病毒DNA的载体。表达盒的整合可以通过同源重组、转座或通过应用病毒整合系统来实现。另外，使用游离保持的构建体作为将表达盒拷贝整合入染色体DNA的基础是可能的。最后，导致表达盒在宿主细胞中复制的任何系统都适合作为载体或载体构建体。

在本发明的一个实施方案中，经转移的DNA包含编码酶的另外的开放阅读框，其中该另外的阅读框可以物理连接在连续DNA链中或作为单独DNA链的混合物。在一个优选的实施方案中，这些额外的开放阅读框功能连接到启动子元件或调节DNA元件本身，从而导致这些额外的开放阅读框在转化的宿主细胞中单独地或共调节地表达。在一个优选的实施方案中，该额外的开放阅读框包含选自编码以下酶的至少一个序列：内切木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、内切纤维素酶、外切纤维素酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、肌醇六磷酸酶、多糖单加氧酶或阿拉伯糖酶。

将表达盒构建体引入宿主细胞的优选方法包括转化、转染、缀合和/或杂交。转化可以通过经由电穿孔、原生质体融合、脂质转染、弹道轰击、基于乙酸锂、氯化钙、PEG或氯化锰的化学转化的DNA转移来实现。其他策略包括应用病毒颗粒。另一种选择是应用天然感受态生物体作为宿主细胞。

进一步增加所表达蛋白质的产量的方法包括参与以下事件的辅助蛋白的共表达：蛋白的翻译、运输，蛋白质(例如伴侣蛋白hsp70家族蛋白质，蛋白质二硫键异构酶)的折叠，或多肽(Kex-蛋白酶，Ste-蛋白酶)的正确加工和有助于蛋白质的细胞产生的其它事件。

在用本发明的载体转化宿主菌株并生长至合适的细胞密度后，通过温度变化或化学诱导来诱导所选的诱导型启动子，并培养细胞以产生重组酶。优选地，根据本发明的多肽与指导重组蛋白从宿主细胞分泌的信号肽一起产生。然后通过离心或过滤除去细胞，并保留含有多肽的上清液。

本发明还提供了制备根据本发明的多肽的方法，包括以下步骤：

a)获得已经用包含本发明中定义的核酸的载体转化的宿主细胞；

b)在多肽表达的条件下培养宿主细胞；和

c)回收多肽。

本申请中的所有定义，特别是关于多肽、宿主细胞、载体和核酸的定义，相应地适用。

根据本领域技术人员熟知的方法和条件进行本发明的宿主细胞的培养。优选地，宿主细胞可以在来自农业废物和/或残留物流的培养基上培养。农业废物和残留物从农业和林业中获得和回收，并包括由于物理、化学、经济或政治原因不能转化为主要产品的部分收获物。这种培养基质的实例是小麦秸杆、甘蔗渣、甘蔗叶、甜菜浆、低质量纸浆、废纸、锯屑或来自木材厂的其它残留物。在一个特别优选的实施方案中，培养基质在培养之前已经本发明的蛋白质处理，或者可选地被分成两个流，而不用于培养的另一个流用至少本发明的蛋白质处理。在一个特别优选的实施方案中，在用至少本发明的蛋白质处理培养基质期间，转化的宿主细胞的诱导剂从培养基质释放出来。这样的诱导剂的实例是木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和包含这样的糖部分的低聚物。

根据本发明的多肽的回收根据本领域技术人员熟知的方法和条件进行。在一个优选的实施方案中，酶从上清液中回收并纯化，方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析的方法。在特别优选的实施方案中可以使用蛋白质重折叠步骤。

在一个优选的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，并且木聚糖酶蛋白被表达，该木聚糖酶蛋白具有如SEQ ID No：2或No：4所定义的序列，其中——在特别优选的实施方案中——1至30个氨基酸残基被置换，删除或插入。在一个特别优选的实施方案中，木聚糖酶配备有亲和标签，例如6x-His TAG。

本发明还提供了包含根据本发明的多肽的组合物。组合物优选含有根据本发明的多肽的0.01至50重量％(指组合物的总蛋白质含量)、进一步优选含有根据本发明的多肽的1至35重量％，特别优选5至20重量％，最优选8至12.5重量％。

在一个优选的实施方案中，组合物还包含至少一种纤维素酶。所述至少一种纤维素酶优选选自从相应的分泌纤维素酶的微生物培养物获得的纤维素酶混合物。在一个优选的实施方案中，用于此目的的微生物培养物选自以下微生物的培养物：里氏木霉(Trichoderma reesei)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)，绿色木霉(Trichoderma viride)，疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)，柄篮状菌(Talaromyces stripitatus)，Humicula grisaea，嗜热毛壳菌(Chaethomium thermophilum)，Humicola inculens，热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)，嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)，Caldicellulosiruptor owenensis，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，黑曲霉(Aspergillus niger)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)及其混合物。

在另一优选实施方案中，组合物包含一种或多种选自以下的酶活性：纤维素酶、GH61吡喃糖单加氧酶(也称为“GH61蛋白”)、内切木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶和阿拉伯糖酶。

在一个特别优选的实施方案中，将本发明的组合物包含在在纤维素酶混合物中，通过这种特定添加，纤维素酶混合物对纤维素、木聚糖和其它半纤维素材料的水解性能方面得到增强。在一个最优选的实施方案中，纤维素混合物进一步包含在纤维素酶混合物中的比活性水平方面水平增加5％或更多的选自GH61蛋白、木糖苷酶和β-葡糖苷酶的一种或者多种活性。

特别优选的组合物包含如前定义的根据本发明的多肽、至少一种如前定义的纤维素酶以及至少一种内切葡聚糖酶IV，其中特别优选根据本发明的多肽和该内切葡聚糖酶IV的比例是5％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定的)多肽比40％内切葡聚糖酶IV，优选8％多肽比25％内切葡聚糖酶IV，其中百分比涉及优选由纤维素酶组成的组合物的蛋白质总量。还优选包含相同量的多肽和该内切葡聚糖酶IV。

在另一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物包含如前定义的根据本发明的多肽、至少一种纤维素酶、以及至少一种木糖苷酶和/或至少一种GH61蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含30-99％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)、优选40-90％、更优选50-80％的纤维素酶，1-70％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)、优选5-50％、甚至更优选10-30％、最优选15-20％的根据本发明的多肽，以及1至25％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)、优选5至20％、最优选10至15％的木糖苷酶和/或GH61蛋白。

本发明还提供了根据本发明的多肽和根据本发明的组合物用于木素纤维素生物质的酶降解的用途。

本发明还涉及根据本发明的多肽在由复杂底物如“含木糖的多糖”生产生物燃料、纸浆、纸和纤维素纤维、平台化学品以及食品和饲料产品的方法中的用途。

实施例和附图

在下文中，通过实施例和附图描述本发明。这些实施例和附图仅仅是为了说明的目的，并且在任何方面都不限制本发明和权利要求的范围。

实施例1：温度最佳值和pH范围

对纯化的tFfXyn1多肽SEQ ID NO：7的亲和力的表征针对pH进行，测定在pH 4至7之间的最佳活性以及在40至65℃的温度刚下温育一段预温育时间的残余活性。在2mg/ml的底物浓度下，用对硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷(pNP-X)作为底物测定活性水平。50℃，孵育1小时。残余活性在pH 5下在进行温度预温育步骤后进行。为了测定最佳pH，使用表1中所示的缓冲液。通过在405nm处的吸光度测量来测定对硝基苯酚的释放。使用Bradford与BSA标准品进行蛋白质定量。将2mg/ml纯化的tFfXyn1溶液在各自的应用缓冲液中稀释。

表1：用于pH最佳值测定的缓冲液组成

pH	mM
			4	100	乳酸
4.5	100	乙酸盐
			5	100	乙酸盐
5.5	100	乙酸盐
			6	100	MES缓冲液
6.5	100	磷酸盐
			7	100	磷酸盐

纯化的tFfXyn1多肽在pH 4至6显示出优异的活性，在pH 5具有最大值，并且在50至65℃显示出优异的活性，在58℃具有最大值。结果示于图1A和B。

实施例2：不同的木聚糖酶多肽对中性秸秆的比较性能

使用100％和80％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)比例的SCFMX0375(具有增加的β-葡萄糖苷酶水平的里氏木霉)纤维素酶载量对汽爆小麦秸秆进行水解反应(中性条件)，用于在50℃和pH5持续24小时的参考。

用tFfXyn1(SEQ ID NO：7)多肽替换20％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)纤维素酶导致葡萄糖和木糖产量的增加，而用相同量的来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)(TlXyn1_GH11；SEQ ID NO：8)和里氏木霉(TrXyn2_GH11SEQID NO：10，TrXyn1_GH11SEQ ID NO：9，TrXyn4_GH30SEQ ID NO：11)的不同木聚糖酶不会导致水解反应的这种剧烈改善。

重复前述80％的反应并补充20％(重量％/重量％，在Bradford与BSA之后测定)的tFfXyn1多肽。在50℃和pH5的条件下糖化24小时后测定糖化度，随后在HPLC上进行糖定量。可以看出，tFfXyn1的剂量导致最高的总糖释放。结果示于图2。

实施例3：在GH61蛋白存在下tFfXyn1对中性秸秆的性能

tFfXyn1(SEQ ID NO：7)与TrEGIV_GH61(里氏木霉EGIV SEQ ID NO：14)的协同作用通过加入不同比例(在Bradford与BSA之后确定的酶的重量/干物质底物)的纯化的tfFxyn1和TrEGIV_GH61，其作为25％(重量/重量，在Bradford与BSA之后测定)的一份加入SCFMX0375进行测试。8％(重量/重量，Bradford与BSA后测定)tFfXyn1的局部最大值被证明从预处理(中性汽爆)小麦秸秆中释放最大量的葡萄糖，此时应用0.5％酶与底物比率(在Bradford与BSA之后测定的酶重量/干物质底物)，并且在50℃和pH5下对中性汽爆小麦秸秆进行糖化，持续24小时。结果示于图3。

实施例4：在β葡糖苷酶(TeBgl_GH3SEQ ID NO：13)和内切葡聚糖酶(TrEGIV_GH61SEQ ID NO：14)存在下tFfXyn1对中性秸秆的性能

评估在tFfXyn1和SCFMX375的存在下，增加水平的β葡糖苷酶TeBgl_GH3SEQ IDNO：13的活性对来自中性汽爆小麦秸秆的葡萄糖和木糖产量的影响。发现增加水平的β-葡萄糖苷酶在tFfXyn1和TrEGIV_GH61存在下进一步改善来自样品的葡萄糖的酶促释放。在50℃和pH5下进行糖化，持续24小时。结果示于图4。

实施例5：tFfXyn1与木糖苷酶的共同作用

评价在tFfXyn1和SCFMX375存在下，增加水平的来自里氏木霉的木糖苷酶(Trxyl_GH3SEQ ID NO：12)活性对来自中性汽爆小麦秸秆的葡萄糖和木糖产量的影响。在50℃和pH5下进行糖化，持续24小时。结果示于图5。

附图简介

图1A显示纯化的tFfXyn1的pH稳定性。

图1B显示了纯化的tFfXyn1的温度稳定性。

图2显示了采用SCFMX0375纤维素和tFfXyn1的组合相比于与其它木聚糖酶组合而言使得中性汽爆小麦秸秆的糖化反应的葡萄糖和木糖产量增加。

图3显示了在从木素纤维素底物释放葡萄糖方面tFfXyn1和GH61蛋白之间的协同作用

图4显示TeBgl_GH3β-葡糖苷酶与tFfXyn1对于单体糖从木素纤维素底物释放的协同作用

图5显示在tFfXyn1存在下，加入木糖苷酶显著增加木糖产量

序列表描述：

SEQ ID NO：1DNA序列，FfXyn1木聚糖酶

SEQ ID NO：2蛋白质序列，具有信号肽的FfXyn1木聚糖酶

SEQ ID NO：3DNA序列，mFfXyn1木聚糖酶

SEQ ID NO：4蛋白质序列，mFfXyn1木聚糖酶成熟蛋白

SEQ ID NO：5人工DNA序列，编码具有里氏木霉CBHI信号肽和C-末端6x-His-TAG的tFfXyn1木聚糖酶成熟蛋白融合体

SEQ ID NO：6人工DNA序列，其编码具有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MFα信号肽和C末端6x-His-TAG的yFfXyn1木聚糖酶成熟蛋白融合体

SEQ ID NO：7蛋白质序列，与里氏木霉CBHI信号肽和C末端6x-HIS-TAG的tFfXyn1木聚糖酶成熟蛋白融合体

SEQ ID NO：8蛋白质序列，TlXyn1_GH11疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)木聚糖酶成熟蛋白

SEQ ID NO：9蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TrXyn1_GH11里氏木霉木聚糖酶1成熟蛋白

SEQ ID NO：10蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TrXyn2_GH11里氏木霉木聚糖酶2成熟蛋白

SEQ ID NO：11蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TrXyn4_GH30里氏木霉木聚糖酶4成熟蛋白

SEQ ID NO：12蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TrXyl_GH3里氏木霉木糖苷酶成熟蛋白

SEQ ID NO：13蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TeBgl_GH3埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)β葡糖苷酶成熟蛋白

SEQ ID NO：14蛋白质序列，具有6xHis-TAG的TrEGIV_GH61里氏木霉内切葡聚糖酶4成熟蛋白。

Claims (15)

1.多肽，其具有木聚糖酶活性且具有对含木糖多糖的高转化率，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No：2具有至少75％序列同一性。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID No：2或SEQ IDNo：4定义，其中1至30个氨基酸残基被置换，缺失或插入。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中在pH5和50℃持续24小时的条件下所述多肽将中性汽爆小麦秸秆中至少60重量％的含木糖多糖转化为木糖和/或含木糖寡糖、以及葡萄糖。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中在将中性汽爆小麦秸秆在pH5和50℃下经所述多肽处理24小时时，所述木素纤维素生物质至木糖和/或含木糖寡糖以及葡萄糖的转化率的重量比为至少5:1。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中在pH 8和50℃下的残留木聚糖酶活性高于在pH 8和50℃下的最大活性的10％。

6.一种核酸，其编码具有与SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5或SEQ ID No：6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

7.载体，其包含权利要求6的核酸。

8.宿主细胞，其用权利要求7的载体转化。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞来源于由以下组成的组：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、青霉菌(Penicillium sp.)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile)。

10.根据权利要求8或9的宿主细胞，其能够过表达一种或多种选自下组的活性：GH61吡喃糖单加氧酶活性、木糖苷酶活性、木聚糖酶活性和β-葡糖苷酶活性。

11.一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：

a)获得已经用包含权利要求6中定义的核酸的载体转化的宿主细胞；

b)在所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；和

c)回收所述多肽。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞，并且所述多肽具有SEQID No：2或SEQ ID No：4所定义的序列，其中1至30个氨基酸残基被置换、删除或插入。

13.组合物，包含权利要求1至5中任一项的多肽。

14.根据权利要求13的组合物，其还包含选自下组的一种或者多种活性：纤维素酶、GH61蛋白、内切木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、β-葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶和阿拉伯糖酶。

15.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽或根据权利要求13或14所述的组合物用于木素纤维素生物质的酶促降解的用途。