CN106687143A - 纳米颗粒、制备方法、及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核壳纳米颗粒、用于其生产的方法、以及其用途(特别是作为佐剂)。一般而言，本发明的纳米颗粒包含由生物可降解聚合物组成的固体核以及布置在所述核周围的两亲性分子的壳。

Description

纳米颗粒、制备方法、及其用途

发明背景

技术领域

本发明涉及核壳纳米颗粒、其制备方法及其用途(特别是作为佐剂)。一般而言，本发明的纳米颗粒包含由生物可降解聚合物组成的固体核以及布置在所述核周围的两亲性分子的壳。

背景信息

许多疫苗并不具有足够的免疫原性来引起触发免疫的免疫应答。特别是非活体疫苗在单独施用时显示出低免疫原效力。另外，充当抗原的蛋白质必须要经得起严苛的条件，以保持其组成并由此保持其免疫原效力。使用重组蛋白质比活体的、减毒疫苗要安全，但是却具有较低的免疫原性。因而，需要对于安全但低免疫原性抗原的免疫应答进行增强的物质。

佐剂是当与具体抗原组合使用时，增强和/或调节免疫应答的化合物。许多疫苗的效力依赖于佐剂，因为抗原已更加纯化。

佐剂的应用可具有不同的益处，并且有不同类型的佐剂可用。免疫调节佐剂可诱导占主导地位的Th1或Th2型免疫应答，取决于使用的是何种佐剂。另一类型的佐剂是延长抗原和抗原呈递细胞之间相互作用的物质。此外，佐剂具有抗原呈递系统(靶向抗原呈递细胞如树突状细胞)的潜力。

佐剂的确切作用方式仍未完全清楚，但是有提议认为，对于其中的一些，“贮藏效应(depot effect)”和对炎症的诱导可能是佐剂效用的机制。

有许多不同的佐剂可用或者目前正在开发中。最常用的佐剂是铝盐。它们经FDA批准并且在人类和动物中可安全使用。一般而言，使用氢氧化铝或磷酸铝凝胶，其通过静电相互作用来结合免疫原性物质。由于类凝胶的结构，抗原与免疫系统的细胞可以有延长的相互作用。此外，有提议认为铝盐激活先天免疫应答，其与免疫原性物质组合随后导致适应性免疫。

弗氏佐剂是基于油的佐剂。其已经成功的用于兽医疫苗，但是由于毒性的顾虑依然不可应用于人类。然而弗氏佐剂确实会引起强免疫应答，其也可有助于矿物油在施用后的高炎症效应。

比基于油的佐剂更好的方式是o/w-乳剂。和AS0是o/w-乳剂的实例并且目前用于流感疫苗。和AS03诱导单核细胞和树突状细胞的高度的细胞募集，这可能是佐剂效应的成因。

ISCOM是在皂苷、胆固醇和磷脂的相互作用之后形成的基质。这些开放笼框样结构具有掺合在笼框内的免疫原性物质。作用模式可能是经免疫细胞的靶向。病原体相关的分子模式(PAMP)是可以由宿主免疫系统表达的PAMP受体检测的病毒和细菌分子。Toll样受体(TLR)是PAMP受体的实例并且可在动物和植物的表面(TLR-4)以及细胞质(TLR-7/9)中发现。

充当PAMP的佐剂(也即分别是含有PAMP受体激动剂的佐剂或者激活PAMP受体的佐剂)可以是Toll样受体的配体以及因此起始免疫应答。MPL以及CpG已经被鉴定为Toll样受体激动剂。

佐剂在疫苗中以及针对许多疾病的抗争中发挥重要的作用。然而，仅有很少的佐剂已经被批准用于人类和动物中的用途。

因而，有鉴于新的、免疫原性不佳的抗原，以及作为克服传统使用的佐剂局限性(特别是副作用)的选择，需要新型、安全且有效的佐剂。

发明描述

通过本说明书以及权利要求中表征的实施方案实现了对上述技术问题的解决方案。

因而，本发明在其不同的方面根据权利要求来实施。

本发明是基于这样的出乎意料的发现：包含生物可降解聚合物的固体核的纳米颗粒(包被有两亲性分子的壳)可用作安全且有效的佐剂。

在一方面，本发明因而涉及两亲物包被的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括：

-由生物可降解聚合物组成的固体核，其中任选所述固体核的内部包括溶剂分子，和

-布置在所述固体核上的两亲物壳，

-以及，任选存在的，附着于所述两亲物和/或所述固体核的一或多种抗原。

所述两亲物包被的纳米颗粒，其在下文也称作“本发明的纳米颗粒”，优选具有低于250nm的半径，或者更优选地，具有范围在50-200nm内的大小。

本文所述的生物可降解聚合物特别是合成聚合物，其中所述合成聚合物优选选自以下组：聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸聚乙醇酸共聚物、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(原酸酯)(poly(orthoters))、聚磷腈、聚氨基酸、和生物可降解的聚氨酯，并且其中生物可降解聚合物选自以下组：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(ε-己内酯)PCL、聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)、PEG-PCL-PEG、和特别优选聚原酸酯。

如本文所提及的溶剂分子，优选是选自以下组的溶剂分子：水、有机溶剂、及其组合。

术语“两亲物”，如本文所用，是指包括亲水部分和疏水部分的化合物。具体而言，术语“两亲物”如在本文中用于本发明的方法和组合物中时，包括能够在水成溶剂的存在下形成结构化的相的任何物质。两亲物将具有至少一个极性的、亲水的基团和至少一个非极性的、疏水的基团。具体而言，应理解如本文所用的术语“两亲物”、“两亲性分子”、和“两亲性化合物”是等同的。

优选地，所述两亲物是表面活性剂或PAMP受体激动剂，其中所述PAMP受体激动剂特别是Toll样受体(TLR)激动剂。

根据一个优选的方面，所述两亲物是选自以下组的表面活性剂：非离子的、阴离子的、和阳离子的表面活性剂，并且其中所述两亲物优选是：

-选自以下组的非离子表面活性剂：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪醇、烷芳基聚醚磺酸酯、和磺基琥珀酸钠的二辛酯，或

-选自以下组的阴离子表面活性剂：十二烷基硫酸钠、脂肪酸的钠盐和钾盐、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯十二烷基醚、失水山梨醇倍半油酸酯、三乙醇胺、脂肪酸、和脂肪酸的甘油酯，或

-选自以下组的阳离子表面活性剂：双十二烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、十六烷基三甲基氯化铵、二甲基十二烷基氨基丙烷、和N-十六烷基-N-乙基吗啉鎓乙基硫酸盐。

更优选地，所述两亲物是选自以下的表面活性剂：聚乙烯醇(PVA)、聚山梨醇酯20(Tween 20)、十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

根据另一优选的方面，所述两亲物选自以下组：TLR(Toll样受体)激动剂，并且其中所述两亲物优选选自以下组：TLR1激动剂、TLR2激动剂、和TLR4激动剂。

更优选地，所述两亲物是选自以下组的TLR激动剂：脂多糖(LPS)或其衍生物、脂磷壁酸(LTA)、Pam(3)CysSK(4)((S)-[2,3-5w(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys₄-OH或Pam₃-Cys-Ser-(Lys))、Pam3Cys(S-[2,3-双(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸或三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)、Cadi-05、ODN 1585、酵母聚糖、合成的三酰基化的和二酰基化的脂肽、MALP-2、三棕榈酰化的脂肽、具有2-氨基吡啶融合至五元含氮杂环的化合物、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚IC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、单磷酰基脂质A("MPL")、咪唑并喹啉化合物(例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺)、苯并咪唑衍生物、C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、N7,C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、细菌热休克蛋白质-60(Hsp60)、肽聚糖、鞭毛蛋白质、甘露糖醛酸聚合物、flavolipins、糖醛酸磷壁酸、ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、或其组合。

更优选地，所述两亲物是选自以下组的TLR激动剂：LPS、LPS衍生物、和LTA。

在本发明的背景下，需要特别理解的是，术语“LPS的衍生物“等同于术语“LPS衍生物”。因而，例如，术语“脂多糖(LPS)或其衍生物”特别等同于术语“脂多糖(LPS)或脂多糖(LPS)的衍生物”。

如本文所述，需要特别理解的是，术语“两亲物包被的纳米颗粒”分别等同于术语“用两亲物包被的纳米颗粒”或术语“用两亲性分子包被的纳米颗粒”。优选地，所述两亲物包被的纳米颗粒是用两亲物构成的层(优选单层)包被的纳米颗粒。

术语“布置在所述核上的壳”如本文所用指的是包围所述纳米颗粒的固体核的包被层，特别是单层。术语“两亲物壳”如本文所述特别是指由两亲性分子构成的壳，并且特别是等同于术语“由两亲物构成的壳”。优选地，所述两亲物壳是由两亲物的分子构成的层，特别是单层。

优选地，所述布置在所述固体核上的壳是覆盖所述固体核的壳，并且是由多种两亲性分子的单层(优选闭合单层)形成，而且其中所述单层优选由多种两亲物的分子构成。

所述一或多种抗原，如本文所述，特别选自以下组：PAMP受体激动剂，其中所述PAMP受体激动剂优选为TLR(Toll样受体)激动剂，并且其中所述一或多种抗原优选选自以下组：TLR1激动剂、TLR2激动剂、和TLR4激动剂。

如本文所用，术语"抗原"特别是指能够引发免疫应答的任何分子、部分、或实体。这包括细胞和/或体液免疫应答。取决于所述组合物预期的功能，可以包括一或多种抗原。

特别地，术语“附着的”，如在本发明的背景下所用，优选意指“吸附的”。

更优选地，所述一或多种抗原选自以下组：脂多糖(LPS)或其衍生物、脂磷壁酸(LTA)、Pam(3)CysSK(4)((S)-[2,3-5w(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys₄-OH或Pam₃-Cys-Ser-(Lys))、Pam3Cys(S-[2,3-双(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸或三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)、Cadi-05、ODN1585、酵母聚糖、合成的三酰基化的和二酰基化的脂肽、MALP-2、三棕榈酰化的脂肽、具有2-氨基吡啶融合至五元含氮杂环的化合物、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚IC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、单磷酰基脂质A("MPL")、咪唑并喹啉化合物(例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺)、苯并咪唑衍生物、C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、N7,C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、细菌热休克蛋白质-60(Hsp60)、肽聚糖、鞭毛蛋白质、甘露糖醛酸聚合物、flavolipins、糖醛酸磷壁酸、ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、或其组合。

更优选地，所述一或多种抗原选自以下组：蛋白质和肽，并且其中所述一或多种抗原优选是α-毒素，更优选产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α-毒素或α-类毒素。

最优选地，在本发明的背景下，本文所述的TLR激动剂是TLR4激动剂，特别是选自LPS或其衍生物。

因而，所述两亲物和/或所述一或多种抗原，如本文所述，特别选自以下组：LPS和LPS衍生物，并且其中所述LPS衍生物优选选自以下组：单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)、和吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。

因而，在一个优选的实例中本发明的纳米颗粒是用LPS或其衍生物包被的纳米颗粒(也即分别为LPS包被的纳米颗粒或LPS衍生物包被的纳米颗粒)，并且具有范围在50-200nm的大小，其中所述纳米颗粒包括：

-由PLGA或另一种生物可降解聚合物组成的固体核，其中任选所述固体核的内部包括溶剂分子，和

-布置在所述固体核上的LPS或其衍生物的壳，其中所述LPS的衍生物选自MPL、3D-MPL、和GLA，

-以及，任选存在的，附着于所述两亲物和/或所述固体核的一或多种抗原

所述吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)优选是化学式(I)的化合物：

或其药物可接收的盐，其中：

L₁、L₂、L₃、L₄，L₅和L₆是相同的或不同的并且独立地选自-O-、-NH-和-(CH₂)-；

L₇、L₈、L₉和L₁₀是相同的或不同的并且各自独立地不存在或者是-C(＝O)-；

Y₁是酸官能团；

Y₂和Y₃是相同的或不同的并且各自独立地选自-OH、-SH、和酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆是相同的或不同的并且独立地是C_8-20烷基；和

R₂和R₄是相同的或不同的并且独立地是C_6-20烷基。

具体而言，所述GLA具有上文所示化学式(I)或者是其药物可接收的盐，其中：

Y₁优选为-OP(＝O)(OH)₂；和/或

Y₂、Y₃和Y₄每个优选为-OH；和/或

R₁、R₃、R₅和R₆是相同的或不同的并且独立地是C_8-13烷基；和/或

R₂和R₄是相同的或不同的并且独立地是C_6-11烷基。

更优选地，本文么所提到的GLA是化学式(II)的化合物：

或其药物可接收的盐，其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是C_11-20烷基；和

R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基。

根据一方面，所述GLA具有上文所示化学式(lI)，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C_11-14烷基；以及R²和R⁴是C_12-15烷基。在另外的更具体的方面，所述GLA具有上文所示化学式(lI)，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；以及R²和R⁴是C₁₃烷基。

本文所描述的GLA化合物可以购买或者根据本领域技术人员已知的方法进行制备。因而，分别具有上文所示化学式(I)的GLA、或者具有上文所示化学式(II)的GLA，可以购买或者通过已知的有机合成技术制备，如例如在公开WO 2013119856 A1中所描述的或提到的。

根据另外的方面，提供了制备本发明的纳米颗粒的方法，其中所述包括以下步骤或由以下步骤组成：

(a)将(i)含有生物可降解聚合物的有机溶剂添加至(ii)含有两亲物的水成相，和

(b)将合并的有机溶剂和水成相以足以形成稳定乳剂的能量进行声波处理；和

(c)从所述稳定乳剂蒸发有机溶剂。

并且其中所述方法在下文也称作“本发明的方法”。

优选地，本发明的方法还包括一或多个以下步骤：

-从至少部分剩余的水成相中分离所得的纳米颗粒并优选将所得的纳米颗粒冻干和/或将所得的纳米颗粒保存在不超过7℃的温度；和/或

-将所述一或多种抗原或包含所述一或多种抗原的组合物添加至剩余的水成相和/或所得的纳米颗粒。

在另一方面，本发明还涉及可以通过本发明的方法获得的本发明的纳米颗粒。

优选地，本文所提到的有机溶剂是非极性有机溶剂，其中所述非极性有机溶剂特别是选自以下组：乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、六氟异丙醇、和六氟丙酮倍半水合物。

根据另一方面，本发明还提供了用作佐剂的或用于在对象中刺激免疫应答的方法的本发明的纳米颗粒。应理解如本文所提到的术语“佐剂”，特别是指“免疫调节剂”。此外，分别地，本文所用的术语“佐剂”特别等同于术语“疫苗佐剂”。

术语“对象”如本发明的背景下所用特别涉及人类或非人动物，其中非人动物优选选自以下组：猪、牛、家禽、和宠物。

本发明还提供了本发明的纳米颗粒作为佐剂用于制备疫苗的用途，其中所述疫苗优选包含抗原。

另外，本发明还提供了用于在对象中刺激免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述对象施用包含一或多种本发明纳米颗粒的组合物的步骤。

实施例

1介绍/目标

由重组蛋白质构成的新型疫苗可安全使用，但却常常免疫原性不佳。为了实现足够的免疫应答，佐剂是必要的。对于佐剂的要求取决于用作疫苗的免疫原性物质的类型。虽然需求很大，但是目前仅有几种佐剂可用于人类和动物用途。当前，通常使用铝盐和水包油(o/w)-乳剂作为佐剂。需要新的佐剂用于应对以下挑战：寻找用于疟疾、自身免疫疾病和癌症的疫苗。

开发现代佐剂的创新途径是设计特定的抗原呈递系统。这些颗粒(通常是聚合物，大小范围为微米和纳米颗粒)可用作药物载体系统。此类药物载体可靶向抗原呈递细胞(其对于长效免疫很重要)。

2材料和方法

2.1物质

2.1.1聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)

用于制备纳米颗粒(厂商：Evonik；商标：RG 502H；末端基团：酸；组分：聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)50:50)的聚合物具有等量的乳酸和乙醇酸的组分并且它们在体外大约一至两个月内降解。

PLGA共聚物的玻璃态转变温度在37℃之上并且生物降解是通过酯骨架的非酶水解而发生的。

PLGA是通过乙醇酸和乳酸的两个不同的单体、环状二聚体(1,4-二恶烷-2,5-二酮)的开环共聚而合成的。用于此反应的常用催化剂包括2-乙基己酸锡(II)，烃氧基锡(II)或异丙醇铝。PLGA是FDA批准的赋形剂(药物主文件经FDA登记)，其是生物相容的以及生物可降解的。

2.1.2牛血清白蛋白质(BSA)

BSA购自Sigma Aldrich(Munich，Germany)。BSA由583各氨基酸组成并且具有66.4kDa的分子量。等电点为4.7。BSA被用作模型蛋白质以用于开发不同的微米和纳米颗粒配方。由于其稳定性和低成本，其已经广泛地被用作模型蛋白质以用于制备微米和纳米颗粒。

2.1.3卵清蛋白质(OVA)

OVA得自Sigma Aldrich(Munich，Germany)。OVA具有45kDa的分子量，由386各氨基酸组成，并且具有4.86的等电点)。OVA是禽类蛋清中的主要蛋白质(60-65％)，然而起功能未知。尽管如此，OVA已经在许多疫苗研究中被用作模型蛋白，因为其使用安全并且是经良好表征的免疫原。本文中，我们使用了OVA作为模型蛋白以用于使用纳米颗粒的配方实验，以及作为模型抗原以用于小鼠的体内研究。

2.1.4α-毒素

产气荚膜梭菌是引起气性坏疽的革兰氏阳性厌氧病原体。每个产气荚膜梭菌菌株都具有编码α-毒素的基因。甲醛α-毒素已经在人类中被用作实验疫苗，并且用于绵羊和山羊的类毒素疫苗是商业可购买的。

两种不同的产气荚膜梭菌α-类毒素抗原是由Boehringer Ingelheim(Hannover，Germany)提供。一种抗原是衍生自产气荚膜梭菌细胞培养物的α-类毒素，另一种抗原是大肠杆菌(E.coli)衍生的α-类毒素。所述产气荚膜梭菌衍生的α-类毒素用甲醛失活并用亚硫酸氢钠中和。大肠杆菌表达突变的因而已经失活的α-类毒素。两种抗原都用于纳米颗粒配方实验，因为结果更可能适用于其它重组蛋白。α-毒素具有43kDa的分子量。

2.1.5脂多糖(LPS)

LPS是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分。LPS由三部分组成，疏水脂质(脂质A)、作为亲水核的多糖链、和亲水O-抗原性多糖侧链。LPS通过Toll样受体4(TLR4)刺激先天免疫系统的细胞。

来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)马流产血清型(serotypeabortusequi)的脂多糖(LPS)和异硫氰酸荧光素标记的脂多糖(FITC-LPS)得自SigmaAldrich(Munich，Germany)。LPS被用于配制表面吸附有LPS的PLGA-纳米颗粒(LPS-NP)。这些纳米颗粒在本工作中被用作体内研究中的佐剂。用FITC-LPS取代LPS来对颗粒上吸附的LPS的量进行定量。

2.1.6弗氏佐剂

弗氏佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)购自Sigma Aldrich(Munich，Germany)。CFA是由以下做组成的乳剂：热灭活的并干燥的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、石蜡油和二缩甘露醇单油酸酯作为外部油相。内部水相含有抗原(本情形中为OVA)。IFA由石蜡油和二缩甘露醇单油酸酯组成而缺乏细菌。其也形成具有内部水相(含有抗原)的乳剂。对于本工作中的体内研究III，CFA和IFA被用作佐剂。它们是通过将2.5ml的油相添加至2.5ml水相(含有PBS中的0.01％OVA)来制备的。通过使用Ultra(T 10basic UltraStaufen，Germany)以10000rpm进行4分钟而形成乳剂。通过将一滴乳剂置于PBS表面上来测试所得的浓厚乳剂。该滴乳剂不允许扩散；如果该滴乳剂在PBS表面上扩散了，则该乳剂不稳定且不适宜用于注射。

2.1.7聚乙烯醇(PVA)

聚乙烯醇(PVA)(4-88，Kuraray Europe GmbH，Germany)来自KurarayEurope GmbH。PVA是合成的且水可溶的聚合物。在乙酸乙烯酯聚合成聚乙酸乙烯酯之后，聚乙酸乙烯酯的水解导致PVA。PVA在外部水相被用作稳定剂以用于制备微米和纳米颗粒(经双乳剂方法)。其也用作表面活性剂以用于制备纳米颗粒(经o/w-乳化-蒸发-方法)。

2.1.8聚山梨醇酯20

聚山梨醇酯20(20)购自Carl(Karlsruhe，Germany)。Tween 20是聚氧乙烯失水山梨醇酯，并且具有1225g/mol的分子量。Tween 20是非离子表面活性剂，具有大约0.05mmol/l的临界胶束浓度(CMC)。其用作表面活性剂以用于制备纳米颗粒(经o/w-乳化-蒸发-方法)。

2.1.9十二烷基硫酸钠(SDS)

十二烷基硫酸钠(SDS)得自Sigma Aldrich(Munich，Germany)：SDS是阴离子表面活性剂，具有288g/mol的分子量和8mmol/l的CMC。其用作表面活性剂以用于制备纳米颗粒(经o/w-乳化-蒸发-方法)以及在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质线性化。

2.1.10胆酸钠

胆酸钠购自Sigma Aldrich(Munich，Germany)。胆酸钠是阴离子表面活性剂，具有431g/mol的分子量和大约12mmol/l的CMC。其用作表面活性剂以用于制备纳米颗粒(经o/w-乳化-蒸发-方法)。

2.1.11十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自Carl (Karlsruhe，Germany)。CTAB是阳离子表面活性剂，具有364g/mol的分子量和大约0.9mmol/l的CMC。其用作表面活性剂以用于制备纳米颗粒(经o/w-乳化-蒸发-方法)。

2.1.12二硫苏糖醇(DTT)

二硫苏糖醇(DTT)得自Carl(Karlsruhe，Germany)。其具有154g/mol的分子量。DTT是还原剂。其与SDS组合使用以用于对吸附的蛋白质进行定量。DTT还原蛋白质的二硫键而SDS将蛋白质线性化。此外，SDS引起蛋白质从颗粒表面解吸附，因为其在表面上替代了蛋白质。

2.2水包油-乳化-蒸发方法

生物可降解聚合物，如PLGA，可用于制备聚合的纳米颗粒。为了制备装载了蛋白的纳米颗粒，使用了此前有描述(Vauthier and Bouchemal，2009；Wachsmann andLamprecht，2012)的水包油-乳化-蒸发-方法(图1)。首先形成了水包油乳剂。溶于乙酸乙酯的PLGA(20mg/ml-100mg/ml)作为油相。外部水相含有表面活性剂(表1)。

使用Sonopuls HD 2200声波处理器(Bandelin electronic，Germany)通过超声波将有机相与外部水相乳剂化。继而使用旋转蒸发器在45℃于减压下将所得的o/w-乳剂的有机溶剂去除。水不可溶的PLGA沉淀为纳米颗粒(o/w-NP)。

表1：用于制备装载有蛋白质的聚合纳米颗粒的表面活性剂

2.2.1制备具有吸附的蛋白质的纳米颗粒

将如此前所述(2.2)制备的聚合纳米颗粒，在水平振荡器上(Edmund Bühler，Tübingen，Germany)，以各种浓度(0.1mg/ml–2mg/ml)与蛋白质溶液(BSA、OVA或溶菌酶)温育3小时。在与蛋白质溶液温育前，将与α-毒素温育的纳米颗粒冻干(参见2.3节)。

2.2.2装载LPS的纳米颗粒的制备

通过如上文(参见2.2节)所述的水包油-乳化-蒸发-方法制备了装载LPS的聚合颗粒。溶于乙酸乙酯的PLGA(10mg/ml)作为油相。在外部水相中使用LPS(1mg/ml)而纳米颗粒的制备不需要使用表面活性剂。

2.3纳米颗粒的冻干

为了装载有α-毒素的纳米颗粒的稳定性研究，使用GT2(Steris，Germany)将纳米颗粒冻干。将海藻糖(5％(m/V))添加至纳米颗粒配方作为冷冻保护剂。

2.4分析方法

2.4.1颗粒大小分析

2.4.1.1光子相关光谱法(PCS)

纳米颗粒的颗粒大小和多分散指数(PDI)是使用ZetaPlus粒度仪(BrookhavenInstruments Corporation，UK)以固定的角度90°于25℃来通过光子相关光谱法(PCS)确定的。用水将100μl的纳米颗粒样品在UV-Cuvette macro(Brand GmbH，Germany)中稀释。每个样品一式三份进行了测量。每次测量由5次(每次持续时间1分钟)的运行组成。使用Brookhaven Instruments Particle Sizing Software Version 3.88来进行分析。

2.4.2蛋白质的装载率

使用BCA-测定确定了o/w-NP和w/o/w-NP对模型蛋白质BSA和OVA的装载率。将NP-样品在19000rcf浓缩15分钟，并将上清进行收集以及通过BCA-测定进行测量。因而，对蛋白质含量进行了间接的定量。微米颗粒样品的包封率也间接进行了测量。在所获得的微米颗粒悬液的过滤后，使用BCA-测定研究了过滤物的蛋白质含量。o/w-NP对于α-毒素的装载率如o/w-NP样品对于BSA和OVA那样进行操作。然而，上清并未通过BCA-测定检验，而是通过SDS-PAGE凝胶电泳(参见2.4.2.2)。

2.4.2.1BCA-测定

微米和纳米颗粒样品的蛋白质含量通过BCA-测定(Roti-quant通用测定，CarlGermany)来进行测量。Cu²⁺离子通过蛋白键而被还原为Cu¹⁺离子。BCA-测定的原理是，二喹啉甲酸在碱性环境与亚铜离子(Cu¹⁺)形成深的紫色复合物。将100μl的样品和标准物置于96-孔平板中(PerkinElmer，Waltham，USA)，并与100μl的BCA-测定试剂盒的试剂溶液混合。在37C温育30分钟后，使用平板读数仪(1420Multilabel Counter Victor3V，PerkinElmer，USA)在490nm测量了光吸收。

2.4.2.2SDS-PAGE凝胶电泳

为了对o/w-NP上的α-毒素含量进行定量，进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。SDS-PAGE广泛用于根据其分子量而分离蛋白。将样品与含有SDS的“Laemmli-缓冲液”混合以使蛋白质线性化，以及另外还使每个蛋白质带负电。所述缓冲液还含有甘油以提高样品的密度以及含有溴酚蓝作为追踪染料。进一步使用恒温仪(comfort，Germany)将所述样品加热至95℃达5分钟，并添加2-巯基乙醇以还原二硫键。使用MINI--系统(Bio-Rad Laboratories，USA)来进行SDS-PAGE。自制的分离凝胶具有12％的丙烯酰胺含量而积层凝胶具有4％的丙烯酰胺含量。通过添加过硫酸铵和四甲基乙二胺来起始聚合作用。在将样品加至凝胶后施加电场，其导致带负电的蛋白质迁移至正电极(阳极)。凝胶以20mA运行2h。继而用考马斯亮蓝将凝胶染色8h并在之后用水、甲醇和乙酸漂洗。为了计算蛋白质含量，已知浓度的α-毒素样品被用作标准物。另外使用标记(-Mark Standard，CarlGermany)来评估分离的蛋白的分子量。为了对α-毒素的含量进行定量，将染色的凝胶置于L 300光板(Intas ScienceImaging Instruments GmbH，Germany)上，并用照相系统(IntasScience Imaging Instruments GmbH，Germany)拍照，继而用ImageJ分析系统推进密度计分析。

2.4.3释放测试

体外溶解测试全部都在PBS中进行。用PBS将给定量的干燥微米颗粒样品在锥形瓶中悬浮。将所述锥形瓶在摇摆水浴中(GFL，Burgwedel，Germany)于37℃以80rpm温育。在各个时间取样品用于药物释放的分析。蛋白质含量如上文所述进行确定。纳米颗粒样品的体外溶解测试在Eppendorf杯中进行。将100μl的纳米颗粒悬液与900μl的PBS混合。在各个时间取样品用于药物释放的分析。蛋白质含量如上文所述进行确定。

2.4.4ζ电位

使用ZetaPlus粒度仪(Brookhaven Instruments Corporation，UK)来进行对ζ电位的测量。使用Brookhaven Instruments Zeta Potential Analyzer Software Version3.54来进行该分析。

2.5体内实验

通过使用BALB/c小鼠的动物实验来确定o/w-NP和LPS-NP的免疫应答。使用OVA作为模型蛋白。这是经良好确认的刺激佐剂效应的体内模型。

2.5.1BALB/c小鼠

所述BALB/c小鼠购自Charles River(Sulzfeld，Germany)。所述BALB/小鼠是是白化病的实验室培育品系。所有的实验都在波恩的“Haus für Experimentelle Therapie”(HET)进行。所述小鼠4周龄并且重量25-35g。仅使用雄性小鼠。动物试验在7天的驯化期之后开始。用高压灭菌的标准食物(ssniff，Soest，Germany)和随意饮水来饲养小鼠。3-5只小鼠放在一个笼子里并且每周更换一次笼子。在此研究中使用独立通气笼(IVC)。将笼子保存在具有22℃的温度和150Pa的超压的房间里。相对湿度为大约50-60％。

2.5.2研究概览

使用小鼠模型研究了装载OVA的载体的影响。因此，进行了5个体内研究。测试了纳米颗粒和不同佐剂配方的免疫应答。PLGA颗粒已经显示出它们可以对免疫应答有作用(Gutierro等人，2002a；Waeckerle-Men and Groettrup，2005)。在本工作中，我们研究了不同的佐剂配方以及不同的o/w-NP配方的作用。对于所有试验，动物都免疫两次并取血液样品三次或四次(图2)。

所有的动物实验都起始自标记小鼠。因此，使用了由HET友情提供的耳钳。取决于一个笼子里的小鼠数目，标记了4个小鼠或2个小鼠。

使用23G针头(B.Braun，Melsungen，Germany)在研究日(SD)0和SD 21从颈部进行皮下免疫。将OVA溶液或纳米颗粒配方吸入注射器，并将100μl注射至每个小鼠。对每个小鼠总是更换针头。使用22G针头(B.Braun，Melsingen，Germany)和微红细胞压积管(Brand，Wertheim，Germany)来完成从尾部取血。在将小鼠固定在限制器(restrainer)中时，取大约50-100μl血液并置于Eppendorf杯中。将血液存放在室温大约一小时。继而将其存放在4℃达24小时。之后，使用Hermle Z 233 M-2(HermleLabortechnik，Wehingen，Germany)将其以19000rcf离心15分钟。继而收集大约10-20μl的血清(上清)并存放在-20℃。

在皮下注射后每天监测动物的注射部位三天，继而再每周监测一次。设定了若干中止条件以保证动物痛苦最小化。如果观测到任何以下迹象，则通过安乐死来结束此动物的实验：

a)异常身体姿势

b)丧失机动性

c)可见的炎症

d)体重损失≥20％

2.5.2.1不同佐剂的体内测试

在动物实验中(表2)针对免疫应答测试了不同的佐剂配方。在所有组中OVA浓度为每剂量10μg。具有OVA的PBS作为对照组。第二组含有OVA和CFA用于第一次免疫以及IFA用于第二次免疫。佐剂蛋白质乳剂如上文所述形成(2.1.6)。此组作为阳性对照，因为施用CFA之后小鼠中的强免疫应答是广泛知晓得。第三组和第四组是实验组。在此，我们比较了LPS-NP(组合有CpG)与可溶LPS(组合有CpG)的免疫应答。由于CFA和IFA具有高度毒性和危险性，此组中的小鼠在免疫期间用异氟醚(Abbott，Germany)进行了麻醉。在SD 0、SD 21和SD 35进行取血。

表2：实验组

2.5.2.2小鼠中装载脂多糖的纳米颗粒和装载卵清蛋白质的纳米颗粒

在体内研究中(表3)，测试了不同o/w-NP配方对免疫应答的作用。在所有组中OVA浓度为每剂量10μg，以及在所有组中使用偶合有CpG(每剂量5μg)的LPS-NP(LPS浓度每剂量1μg)作为佐剂。第一组是对照组，含有游离的OVA和佐剂配方。第八组也是对照组，含有游离的OVA而无佐剂配方。其它组是实验组。如上文所述将OVA装载至纳米颗粒上(参见2.2.1)。测试了所得的纳米颗粒配方。组II含有Tween 20(1％)-NP、组III含有PVA(1％)-NP、组IV含有胆酸钠(0.05％)-NP、组V含有SDS(0.01％)-NP、以及组VI含有CTAB(0,05％)-NP。在SD 0、SD 21、和SD 35进行取血。

表3：实验组

2.5.2.4纳米颗粒浓度对小鼠免疫应答的影响

在体内研究中(表4)，研究了纳米颗粒浓度对免疫应答的作用。偶合有LPS-NP(LPS浓度每剂量1μg)和CpG(每剂量5μg)的PBS中的OVA溶液在所有组中都用作佐剂，包括对照组。9个实验组在其配方中都具有相同量的OVA(每剂量10μg)。以不同的浓度测试了CTAB(0,05％)-NP、Tween 20(1％)-NP、和PVA(1％)-NP。如上文所述制备颗粒(参见2.2.1，有稍许改动)。简言之，改变了PLGA的量(100mg/ml和4mg/ml而不是20mg/ml)以及调整了声波处理的时间，以便获得相当的纳米颗粒大小。在SD 0、SD 21、和SD 35进行取血。

表4：实验组

2.5.2.5IgG-ELISA

将体内研究的血液样品留在冰箱(-20℃)中过夜解冻，并继而用来自AlphaDiagnostics(San Antonio，USA)的小鼠抗-卵清蛋白IgG试剂盒进行测量。如手册中所述进行ELISA(Instruction Manual No.M-600-105-OGG)。简言之，在制备“洗涤溶液”以及稀释样品的溶液之后，用“洗涤溶液”洗涤OVA覆盖的96-孔平板。期间，所有的样品经适当稀释(100-500000x)。将100μl的标准物和样品添加至平板并温育60分钟，以将IgG结合至孔上固定的OVA上。在若干洗涤步骤之后，添加100μl的IgG-特异性抗体(缀合有辣根过氧化物酶(HRP))并温育30分钟。所述IgG-特异性抗体结合至IgG。在若干洗涤步骤之后，洗掉过量的游离IgG-特异性抗体(缀合有HRP)。继而添加100μl的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)作为显色底物。HRP与TMB反应成蓝色的产物。TMB被HRP氧化，得到二亚胺。通过添加100μl硫酸(1％)，TMB变黄。继而使用平板读数仪(1420Multilabel Counter Victor3V，PerkinElmer，USA)在450nm测量光吸收。相对于抗-卵清蛋白质的参考校准来计算样品中小鼠IgG的量。结果表示为IgG抗体活性单位(U*ml^-1)。

2.6统计学分析

使用Sigmastat 2.0软件进行统计学分析。通过Kruskal-Wallis评秩方差分析随后用多个Student Newman-Keuls检验来研究统计学差异。数据表示为均值±SD，p<0.05认为是显著。

3结果和讨论

3.1用水包油-乳化-蒸发方法制备的纳米颗粒

如此前所示，通过双乳剂方法制备的纳米颗粒在低于600nm的颗粒大小不包封内部的亲水药物。亲水药物吸附在表面。因而，使用较简单方式制备的纳米颗粒在亲水药物的稳定性方面有益处，因为在应用双乳剂方法时其暴露于剪应力、热以及有机溶剂。

因此，使用水包油-乳化-蒸发方法制备纳米颗粒。继而将“空的”PLGA-NP与亲水药物、BSA、OVA或α-毒素温育。

3.1.1纳米颗粒性质的物理化学表征

3.1.1.1表面活性剂对颗粒大小和多分散性的影响

使用5种不同的表面活性剂来制备PLGA-NP。非离子表面活性剂PVA和Tween 20、阴离子表面活性剂SDS和胆酸钠、以及阳离子表面活性剂CTAB用于制备。由于蛋白质在PLGA-NP的制备之后被吸附，因而预期PLGA-NP经修饰的表面性质(作为不同表面活性剂的结果)，会对装载率有作用。

如预期的那样，更高量的表面活性剂导致PLGA-NP更小的颗粒大小(图3)。在经超声处理乳剂化的过程中，用表面活性剂来稳定乳剂。与较低量的表面活性剂相比，更高量的表面活性剂可以稳定更小的小滴。这最终生成较小的颗粒。

目标是获得100nm–200nm(平均直径)大小范围的纳米颗粒。使用足够量的各自的表面活性剂，这对所有配方都是可能的。对于PVA-NP和Tween 20-NP，使用1％w/v的表面活性剂浓度来获得低于200nm的纳米颗粒，使用0.01％w/v的SDS获得期望颗粒大小反问的SDS-NP，而对于CTAB-NP 0.1％w/v的CTAB是必须的。当使用0.05％w/v的胆酸钠时候，胆酸钠-NP具有154nm±10nm的颗粒大小。

作为另一重要方面，研究了纳米颗粒配方的多分散性。如此前所提到的，高多分散性表示颗粒分布不是单峰态(monomodal)。超过0.05–0.1的多分散指数表明双峰态(bimodal)颗粒大小分布。

多分散指数随着更高量的表面活性剂而提高，并因此增加较小的颗粒(图4)。

接近0.005的多分散性值表明单峰态颗粒大小分布。这仅可在超过300nm的颗粒观察到。更高量的表面活性剂明显足以获得小颗粒，但却不能获得大小范围100nm–200nm的单峰态颗粒大小分布的纳米颗粒。

3.1.1.2纳米颗粒的ζ电位

通过如2.4.4中所述测量ζ电位来对PLGA-NP的表面性质进行表征。所述ζ电位对每种表面活性剂都改变并显示出-7mV--25mV的值(对于非离子和阴离子表面活性剂)(图5)。CTAB-NP具有-4mV至2mV的ζ电位。

3.1.1.3纳米颗粒上吸附的蛋白质的装载率

对于制备的PLGA-NP进一步测试其将蛋白吸附至表面上的潜力(使用OVA或BSA作为模型蛋白)。使用PVA、Tween 20、SDS、胆酸钠、和CTAB的所有配方如2.2.1节所述制备并进行了研究。

OVA显示了对于大小低于200nm的纳米颗粒表面的高装载(图6)。

当使用PVA和Tween 20作为表面活性剂时，对于较小的颗粒吸附在NP表面的OVA的量增加。然而，对于SDS-和胆酸钠-配方却并非如此。特别是对于SDS-NP，装载率降低至0％，意味着以浓度0.1％SDS的浓度没有蛋白质被吸附至表面。虽然在使用0.1％SDS(46nm±2nm)而不是0.01％(202nm±16nm)时，SDS-NP的颗粒大小更小，但是装载率降低。这很可能是因为SDS在PLGA-NP表面上排斥蛋白质。在低浓度的SDS时，OVA能够吸附在表面，但高SDS浓度不行。当使用胆酸钠作为表面活性剂时，可以看到类似的但却不那么激烈的作用。对于用0.05％胆酸钠制备的胆酸钠-NP，可以观测到OVA的最高装载。将胆酸钠浓度提高至0.1％导致更低的装载率，然而差异却并不像SDS-NP那么大。与所有其它经测试的表面活性剂一样，颗粒大小也随着更高的表面活性剂浓度而降低，这在理论上，应当导致装载率的提高，因为更小的颗粒提供更大的可用于吸附的表面。这意味着，表面性质如ζ电位和疏水性具有很高的重要性，因为显然并不是仅由表面积本身负责蛋白吸附。

对于非离子表面活性剂PVA和Tween 20，装载率遵循着更小颗粒可观测到更高装载率的情形。在此，提高表面活性剂浓度生成更小的颗粒(具有更大的表面积)(表5)。当使用非离子表面活性剂PVA和Tween 20时，高量的表面活性剂并不妨碍表面的OVA吸附。二者都表现出相较于阴离子表面活性剂SDS和胆酸钠的优势。

CTAB用作阳离子表面活性剂。出于意料地，OVA在CTAB-NP的表面并不吸附。无论CTAB-NP的大小以及所使用的CTAB的量如何，都不能获得CTAB-NP对OVA的吸附。

表5：用不同的表面活性剂以各种浓度制备的o/w-NP的表面积

此工作中使用的另一模型蛋白是BSA。关于BSA吸附至PLGA-NP表面的装载率结果，类似于使用OVA作为蛋白质时所获得那些结果。对于非离子表面活性剂PVA和Tween 20，装载率随着更大的表面积而提高。PVA-NP确实显示出装载率稍微降低了1％，在此，高量的PVA对于BSA的装载产生负面的影响。对于Tween 20-NP和胆酸钠-NP，更小的纳米颗粒(具有更大的表面积)观测到更高的BSA装载(图7)。

当比较BSA和OVA的装载较时，SDS-NP显示了类似的行为。仅在0.01％的浓度可以观测到BSA的装载。这也可以是SDS在纳米颗粒表面上与BSA竞争的作用，使得BSA在高SDS浓度的吸附成为可能。

BSA装载至CTAB-NP上也可以仅在所使用得最低CTAB浓度观测到。这与OVA的装载(未观测到装载)相比是种改善。于0.01％CTAB时的低装载率再结合于较高的CTAB浓度不可能装载的事实，表明CTAB在纳米颗粒表面与蛋白质竞争，使得不太可能装载蛋白质。

当比较在不同蛋白浓度产生最高蛋白装载的纳米颗粒配方时，可以观测到BSA与OVA相比倾向于更多的吸附至纳米颗粒表面(图8)。然而，这并未在所有配方中都观测到，而只是大部分的纳米颗粒配方。未将CTAB-NP包括在OVA和BSA的比较中，因为未观测到CTAB-NP表面上蛋白质的装载。BSA在PBS中引起比OVA低的表面张力(表9)。因此，可以推定与OVA相比，BSA更多地在表面上累积，这可以解释为何BSA的装载率在大多数的o/w-NP配方上较高。然而，蛋白质的表面活性性质并不是蛋白质吸附至纳米颗粒表面的唯一决定因素，疏水和离子相互作用也影响了蛋白质吸附至纳米颗粒表面。用于制备o/w-NP的表面活性剂引起经修饰的纳米颗粒表面。由此，每种蛋白在纳米颗粒表面的装载率必需对每种o/w-NP配方进行测试，因为o/w-NP表面的表面性质随着每种配方而改变，导致与蛋白质不同强度的粒子和疏水相互作用。

关于释放动力学、稳定性、形态学、细胞相互作用、和体内实验的研究是使用这样的纳米颗粒配方进行的，所述纳米颗粒配方具有相对良好的装载率结合小的颗粒大小(表6)。

表6：用于进一步研究的颗粒配方

3.1.1.4装载蛋白质的纳米颗粒的释放特征

使用不同表面活性剂制备的o/w-纳米颗粒配方的体外释放特征(表6)，显示了与使用双乳剂方法(仅使用PVA)制备的纳米颗粒相似的结果。

在PBS中，o/w-NP在30分钟内显示了即刻的OVA释放(图9)。蛋白质就吸附在表面，使得快速释放成为可能。对于所有的纳米颗粒配方都实现了约100％的释放。因此，用表面活性剂进行表面修饰对释放特征无影响。

释放特征的结果在蛋白质释放超过100％时稍有缺陷。这可以归因于纳米颗粒样品再取样后就直接进行测量。在37℃的温度取样品，纳米颗粒样品相较于标准物的温度提升导致所检测的二喹啉甲酸(当使用BCA-测定确定蛋白质含量时进行测量)吸附的提升。

3.1.1.5装载α-类毒素的纳米颗粒的表征

重组蛋白质在疫苗研究中有很高需求，因为它们与活体的、减毒疫苗相比代表了更安全的选择。前文对于免疫原性的挑战已有讨论(2.1)。在那些挑战之外，重组蛋白质很少具有高纯度，使得配方的开发很困难。残留的宿主细胞杂质如蛋白质和DNA可以与纳米颗粒相互作用而导致聚集。

在本工作中，对于来自大肠杆菌的α-类毒素和来自产气荚膜梭菌的α-类毒素(可用作疫苗针对气性坏疽进行防护)，针对其相容性和对o/w-NP的装载率进行了测试。

当使用模型蛋白质如BSA和OVA时，o/w-NP对于装载率、稳定性和相容性显示了有前景的性质。为了测试o/w-NP是否也适宜用于重组蛋白质的配方，测试了来自大肠杆菌的α-类毒素。此外，还测试了衍生自产气荚膜梭菌的α-类毒素。

PLGA o/w-NP如2.2.1节那样装载α-类毒素。在将蛋白质与o/w-NP温育前，如此前所述将纳米颗粒冻干(2.3)。继而将蛋白质溶液与冻干的纳米颗粒温育3h。在装载实验中以12.5mg/ml的浓度使用PLGA纳米颗粒。

在纳米颗粒配方中，添加来自大肠杆菌的α-类毒素以产生0.065mg/ml的终浓度，以及添加来自产气荚膜梭菌的α-类毒素以产生0.0215mg/ml的浓度。

来自大肠杆菌的α-类毒素较容易与纳米颗粒配制，除了CTAB-NP外所有的配方形成了稳定的纳米颗粒悬液(表7)。纳米颗粒配方和蛋白质的混合后可见的聚集被认为是“不稳定”。

来自产气荚膜梭菌的α-类毒素当与离子o/w-NP混合时不稳定。在来自产气荚膜梭菌的α-类毒素与SDS-NP、胆酸钠-NP、和CTAB-NP温育期间，观测到沉淀。当非离子PVA或Tween 20用于制备o/w-NP时，配方是物理上稳定的。

表7：不同O/W-纳米颗粒配方与来自大肠杆菌的α-类毒素和来自产气荚膜梭菌的α-类毒素的相容性。(+)表示纳米颗粒配方与蛋白质溶液的混合适宜于进一步的测试。(-)表示在混合过程期间发生沉淀(n＝3-4)

蛋白质未经严格纯化，这在SDS-PAGE凝胶中可见(图10)。来自大肠杆菌的α-类毒素具有大约50％的纯度，而来自产气荚膜梭菌的α-类毒素具有大约25％得纯度。由于蛋白质未纯化，BCA-测定对于表面上的类毒素吸附不能给出可靠的结果，因为在应用BCA-测定时测量了蛋白质的总量，该方法并不特异于α-类毒素。因此，使用SDS-PAGE来测量纳米颗粒表面上不同蛋白质的量。使用了间接的方法，如此前提到的(2.4.2)。

必须要注意的是一些o/w-NP配方当与类毒素混合时不稳定。对于一些配方观测到沉淀，这在检验凝胶时很重要，因为应用了间接的方法来测量温育后o/w-NP上清中的蛋白质。在沉淀的情形中，所形成的类毒素与纳米颗粒附聚，而上清并不含有任何类毒素。因此，如果温育勤俭发生沉淀，即使在上清中未检测到蛋白质(这一般意味着100％吸附至纳米颗粒表面)，但类毒素吸附至纳米颗粒表面却并未发生。在此背景下，例如CTAB-NP的上清，根本不含有类毒素(图10)，而这归因于CTAB-NP与蛋白溶液附聚(表7)。因此认为CTAB-NP不适宜于来自大肠杆菌的α-类毒素或来自产气荚膜梭菌的α-类毒素。

用于制备(SDS和胆酸钠)的使用阴离子表面活性剂的o/w-NP，在与来自产气荚膜梭菌的α-类毒素混合时也沉淀。因而，这些配方不适宜于此蛋白质。然而，具有来自大肠杆菌的α-类毒素的配方对于其物理稳定性而言是成功的。在此，上清中蛋白质的量可用于计算类毒素在纳米颗粒表面的装载率。对于o/w-使用非离子表面活性剂(PVA和Tween 20)配方的具有两种类毒素的NP物理上是稳定的，因此上清被用于确定所述o/w-NP表面上的类毒素的量。

用照相系统将SDS-PAGE凝胶可视化，并用ImageJ软件进行密度计分析。在其中将o/w-NP对来自大肠杆菌的α-类毒素的装载进行测试的实验可以容易地进行评估，因为来自疫苗配方的蛋白质清楚地分离，并具有足够高的浓度以在定量测量中充分可见。

用非离子表面活性剂PVA和Tween 20制备的o/w-NP显示了对来自大肠杆菌的α-类毒素最高的装载率，其中装载率分别为94％±6％和96％±1％(表8)。胆酸钠-NP也显示了80％±1％的高装载率，而SDS-NP具有41％±10％的装载率。

表8：o/w-NP对α-类毒素(大肠杆菌)的装载率

对于o/w-NP与来自产气荚膜梭菌的α-类毒素的分析具有挑战性，因为靶向的蛋白质的条带并未清晰可见(图10)。因此，在测试与疫苗配方温育后o/w-NP的上清之外，o/w-NP本身也被测试。在此，用10％SDS和2.3％DTT将经离心的o/w-NP重扩散。该测试并未给出o/w-NP上α-类毒素装载率的定量结果，因为在样品的重扩散后一些附聚依然保留。但是依然可以得到定量的结论，因为很清楚，至少一些部分的来自产气荚膜梭菌的α-类毒素被吸附至o/w-NP的表面(图11)。

当使用非离子表面活性剂PVA和Tween 20用于制备纳米颗粒时，可以实现o/w-NP对两种类毒素的装载。此外，SDS-NP和胆酸钠-NP可用于来自大肠杆菌的α-类毒素，但不用于来自产气荚膜梭菌的α-类毒素。CTAB-NP不适宜，因为无论使用两种类毒素的哪种都会发生沉淀。显然，阳离子纳米颗粒与蛋白质溶液中的化合物相互作用。蛋白质溶液用大肠杆菌或产气荚膜梭菌制备，并且纯度低于50％。纯度这么差的重组蛋白质溶液可含有DNA以及蛋白水解降解产物，其可导致与离子物质聚集。

来自大肠杆菌的α-类毒素的特征类似于BSA和OVA(无论其大小)。其具有43kDa的分子量，OVA具有45kDa的分子量而BSA为66kDa。

蛋白质吸附至PLGA纳米颗粒表面的确切机制并未完全清楚。蛋白质和o/w-NP的相互作用似乎在蛋白吸附至PLGA表面中发挥作用。没有实验测试不能对蛋白质装载率的预测进行计算，因为吸附机制并不清楚。可以陈述的是，用于制备o/w-NP的表面活性剂对于表面上装载的蛋白质的量有作用。不同的o/w-NP配方可导致不同的关于装载率的结果(表8)。蛋白质的性质对于装载率也很重要，因为当使用相同的o/w-NP配方时，不同的蛋白质导致不同的装载率(图8)。

3.1.1.6可能的吸附机制的研究

为了研究蛋白质-纳米颗粒的相互作用，进行了若干实验。不同蛋白质在具有不同表面活性剂的纳米颗粒表面的装载率在上文已有描述。另外，研究了表面积对于蛋白装载的影响。另一方面，是蛋白质聚集在纳米颗粒表面的能力，其对于蛋白装载至纳米颗粒表面是至关重要的。这意味着蛋白质必需是具有表面活性的。因此，测量了蛋白质溶液的界面张力，以研究表面张力对蛋白质吸附至纳米颗粒表面的影响。

测试了表面活性剂和蛋白质的表面张力。如预期的那样，表面张力随着表面活性剂和蛋白质浓度的增加而降低(表9和表12)。蛋白具有在界面聚集的能力，因为它们具有亲水和亲脂性质。作为比较，BSA比OVA更具有表面活性。模型蛋白在界面聚集的能力可以是为何其吸附至纳米颗粒上的原因之一。

表9：蛋白质溶液的表面张力(均值±SD；n＝3)

蛋白质和纳米颗粒之间的确切物理化学相互作用依然并未完全清楚。简单的离子相互作用并不是纳米颗粒-蛋白质复合物的推动力，因为蛋白质在高于其等电点的条件下显示出吸附至阴离子表面上，意味着蛋白质本身也是带负电的。如果离子相互作用负责纳米颗粒-蛋白质相互作用，那么带负电的蛋白质将不能吸附至SDS-NP或胆酸钠-NP。已经讨论了疏水相互作用负责PLGA-蛋白质复合物。无法预测蛋白对给定的纳米颗粒配方的吸附是多高，因而现在必需将每种蛋白单独对每种纳米颗粒配方进行测试。在体内施用纳米颗粒之前，必需慎重考虑蛋白质吸附至纳米颗粒表面的事实，因为血液中的蛋白质可与纳米颗粒相互作用。

还有，当表面修饰负责与细胞的相互作用(例如着去至细胞中)时，使用细胞培养中的纳米颗粒的实验必需重新考虑。体内条件要复杂的多，且蛋白质吸附至纳米颗粒表面上可以改变其性质，并由此改变其与细胞的相互作用。无蛋白质培养基或者甚至是PBS作为培养基因而不应当用于纳米颗粒细胞培养实验，因为结果很可能不适用于体内条件。

3.1.1.7纳米颗粒的稳定性

对于o/w-NP就其稳定性进行了测试，以确定是否必须要为进一步的实验产生新鲜样品或者o/w-NP在延长的时间段是否足够稳定。

将o/w-NP配方存放在不同的温度，且作为纳米颗粒悬液或者作为冻干的纳米颗粒。当保存在4℃纳米颗粒悬液时，所有样品对于其颗粒大小性质在4周都是稳定的(表10)。然而，纳米颗粒悬液当保存在-20℃或20℃时不稳定。出乎意料地，纳米颗粒悬液在保存于-20℃之后通过简单的晃动并不能完全重扩散，因为聚集清晰可见。通过超声处理5分钟可将纳米颗粒悬液重扩散。然而，这对于保存之前的原始纳米颗粒悬液并不必要。

超声处理可对蛋白质有害，因此对于具体的纳米颗粒配方应当避免，因为温和处理条件是开发这些纳米颗粒的主要推动。这就是为何当保存在-20℃时，样品列为不稳定。

冻干的纳米颗粒在于4℃保存4周是稳定的并且容易再扩散，除了CTAB-NP之外。在冻干之前，以5％的浓度将海藻糖添加至纳米颗粒悬液作为冷冻保护剂。

表10：o/w-纳米颗粒储存4周的稳定性；样品于-20℃、4℃或20℃保存为纳米颗粒悬液或者于4℃保存为冻干的纳米颗粒。(-)表示样品未重扩散或者出现了聚集

3.1.1.8装载脂多糖的纳米颗粒的表征

关于用不同表面活性剂的纳米颗粒(表面吸附有蛋白质)的发现显示了制备装载蛋白质的、聚合纳米颗粒的简单方法。由此方法衍生，通过使用乳剂化-蒸发方法制备了LPS-NP。开发了LPS-NP以用作佐剂配方，来与抗原组合应用。在此，在乳剂化-蒸发方法期间，将LPS添加至水相，技术上作为表面活性剂，导致聚合纳米颗粒(表面吸附有LPS)。目前对于LPS-NP作为疫苗佐剂的潜力进行了研究。在本工作中，使用了LPS-NP的新制剂。

通过简单的乳剂化-蒸发方法制备了LPS-NP，并且活性成分LPS也作为表面活性剂，从而不需要另外的表面活性剂。所得的LPS-NP具有1mg/ml的LPS浓度和2.5mg/ml的PLGA浓度。因为LPS的定量测量一般很复杂，因而应用了间接的方法来对纳米颗粒上LPS的量进行定量。FITC-标记的LPS用于制备LPS-NP，之后将纳米颗粒离心并测试上清的FITC-LPS含量。据观测，几乎70％的LPS结合至纳米颗粒(表11)。所制备的LPS-NP具有平均直径约200nm的颗粒大小。期望此颗粒大小，因为该大小范围的LPS-NP在此前的研究中于小鼠中显示了改善的免疫应答。随后L2配方作为佐剂配方在小鼠研究中与CpG组合使用，由于LPS和CpG是PAMP，且因而是诱导树突状细胞成熟和T-淋巴细胞激活的TLR-4受体激动剂。

表11:LPS-NP的颗粒大小和装载率(均值±SD；n＝3)

3.1.2体内研究

在本工作中显示出蛋白质吸附至o/w-NP表面的能力。纳米颗粒的表面经修饰(取决于所使用的表面活性剂)。对不同的配方进行了表征，其中关于其对蛋白质的装载率以及其被细胞摄取的能力。LPS-NP已经显示出提高免疫应答的潜力，因而，对于在本工作中用乳剂化-蒸发方法制备的LPS-NP，测试了其影响免疫应答的能力。

为了研究o/w-配方的佐剂作用，进行了体内研究。检验了IgG滴度来对免疫后的免疫应答进行了定量。OVA用作模型抗原，因为其已经证明在小鼠中是用于免疫研究的适宜抗原，并且使用特异于抗-OVA IgG的ELISA试剂盒测试了IgG浓度。在研究日0、研究日20和研究日35取了血液样品。第一个血液样品仅用于对照(如果在免疫开始前并未评估抗体滴度)。在第20天，预期低IgG抗体滴度，但是无法做出关于适应性免疫应答的结论，因为免疫效应主要是先天免疫系统的结果。对于适应性免疫应答进行评估的关键在于低35天的IgG-滴度。在第二次疫苗接种后，B细胞释放IgG，而浓度在延长的时间段内很缓慢地降低。

3.1.2.1不同佐剂的体内测试

在体内研究中测试了不同的佐剂配方。CFA/IFA是引发很高抗体滴度的熟知佐剂，但是由于毒性问题却并不用于人类或农畜。由于使用此佐剂非常危险，在免疫前用异氟醚将小鼠麻醉。CFA/IFA用作阳性对照组。测试组是LPS-NP与CpG以及溶液中的LPS与CpG。PBS与OVA用作另一对照组，来看看测试组在施用后是否再小鼠中的免疫应答方面显示出有益的影响。

IgG抗体应答的图示显示出免疫研究的典型过程(图12)。所有配方在第一次免疫前IgG滴度都为0U/ml，意味着小鼠在研究之前并不具有任何抗OVA IgG。在SD 20第二次免疫之前，任何组的IgG滴度不高于5×106。这对于免疫研究也是典型的，其中免疫在三周之外。再第一次免疫之后，IgG在两周后开始增进，但是之后发生IgG的快速降低。在第二次免疫后，即刻存在高IgG浓度，其在长时间段内很缓慢降低(取决于免疫应答的强度)。

CFA/IFA配方显示了最高的免疫应答(图12)。与其它组的差异是显著的。另外，LPS-NP组对于抗体应答而言显著优于LPS和PBS组。图13显示出研究日35之后每个小鼠的血清IgG-滴度。

在此，显示出LPS-NP引起了比LPS溶液显著更高的抗体应答，意味着TLR-4激动剂LPS被树突状细胞和巨噬细胞摄取以激发强免疫应答。LPS是导致树突状细胞成熟且随后导致T-淋巴细胞激活的一类PAMP。

可以得到的结论是，相较于溶液中的LPS，LPS-NP更有利。LPS-NP以及溶液中LPS组的免疫应答当然也是CpG的结果，但是由于其在两组都存在，组之间的差异可归因于纳米颗粒的使用。纳米颗粒能够进入细胞内，TLR位于细胞表面以及在细胞内的内体处。应用LPS-NP是有利的，因为LPS并不仅仅在细胞表面上TLR处，还在细胞内部内体上(在纳米颗粒被细胞更好的摄取之后)完成其激动剂性质。

3.1.2.2小鼠中装载脂多糖的纳米颗粒和装载卵清蛋白质的纳米颗粒

进行下一体内研究来测试不同的装载OVA的o/w-配方增强免疫应答的能力(相较于具有OVA的LPS-NP)。由于OVA位于o/w-NP的表面上，其快速释放并且可以即刻被免疫系统的细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)所识别。由于其吸附至纳米颗粒上，OVA甚至可以更好地被细胞摄取(相较于单独的OVA)。

必需注意的是，不同o/w-NP配方的装载率不同。由于未进行洗涤步骤，所有配方在一个纳米颗粒悬液中都具有相同的OVA量，但是装载至o/w-NP上的OVA与溶液中OVA的比例是不同的，例对于CTAB-NP未观测到装载。

所有经注射的o/w-NP配方还含有与对照组相同浓度的LPS-NP和CpG。

如此前的体内研究中已经显示的，抗体应答的时间图示具有典型的进程(图14)。

在小鼠中施用后CTAB-NP显示了最高的免疫应答(图15)。抗体应答相较于其它组显著更高。装载了OVA的Tween 20-NP和装载了OVA的PVA-NP引发显著更高的免疫应答(相较于对照组的PBS无另外的LPS)，但是与具有LPS-NP的对照组相比差异并不显著。阴离子o/w-NP配方并未激发比PBS对照组更高的免疫应答。

对于SDS-NP，可以推定SDS将蛋白质线性化，因而降低其免疫原性性质。预期其它配方将会产生显著更高的免疫应答，因为PVA-NP、Tween 20-NP、和胆酸钠-NP被良好摄取至巨噬细胞内再结合这些o/w-NP配方的高装载率。非离子o/w-NP的装载相对较高(71％-83％)。在细胞培养研究中已经显示出，细胞可以摄取非离子o/w-NP并且它们位于细胞内部。然而，关于其在小鼠中抗体应答的显著作用则并未观测到。可以假定细胞摄取以及蛋白质递送至免疫系统的细胞内并不是此处的作用模式，但是纳米颗粒的毒性性质发挥了重要作用。

CTAB-NP的高免疫应答可由其毒性特征来解释。如此前所述，CTAB-NP和Tween-NP在使用RAW 264.7细胞的细胞培养模型中显示了最高的毒性。那两种配方在小鼠中免疫后显示了最高的抗体应答。Tween-NP显示了对OVA的良好装载，但是CTAB-NP却完全没有装载OVA。因此，OVA经纳米颗粒增强的细胞摄取作用并不是高免疫应答的原因。更可能的是，由于其毒性潜力，免疫系统的细胞被释放至注射部位，使得OVA更可能被处理。这是类似于其它佐剂的作用模式，其中细胞摄取并不是首要考虑。许多佐剂诱导炎症，例如CFA/IFA和铝，由此激活适应性免疫系统，并随后导致适应性免疫(结合免疫原)。因此，通过纳米颗粒对先天免疫系统的激活可以是造成与对照组相比更高免疫应答的原因。

3.1.2.3纳米颗粒浓度在小鼠中对免疫应答的影响

在此前的体内研究中观测到，CTAB-NP在小鼠中免疫后对免疫应答具有显著的影响(与LPS-NP和OVA相结合)。非离子o/w-NP配方也引发高疫应答，但是并未获得统计学差异。阴离子o/w-配方显示了最小的抗体应答；因此进行了没有这些阴离子o/w-NP配方的进一步测试。

在此，应当确定纳米颗粒浓度的影响。如此前的研究中那样，所有的配方都含有与对照组相同浓度的LPS-NP和CpG。改变了PLGA-NP的浓度，但是表面活性剂含量对每种o/w-NP配方保持一样。免疫应答的差异因而可归因于纳米颗粒，而不是溶液中“游离的”表面活性剂。

如此前的体内研究中已经显示的那样，抗体应答的时间图示具有典型的进程(图16)。

当在SD 35比较IgG滴度时，可以清楚地看到纳米颗粒的剂量对于免疫应答有作用(图17)。

分组II-IV(对每种o/w-NP配方有2mg/m的纳米颗粒浓度)具有最小的IgG滴度，随后是10mg/ml的配方，而50mg/ml纳米颗粒的配方激发最高的免疫应答。

当在不同浓度彼此比较CTAB-NP时，可以观测到，当使用最高的纳米颗粒浓度(50mg/ml)时，存在与其它所使用浓度(10mg/ml和2mg/ml)以及与对照组之间的统计学差异(图18)。如此前研究中已经见到的，CTAB-NP配方(10mg/ml)也引发比对照组更高的抗体应答。此前研究的结果因此可以得到确认。

这清楚地意味着纳米颗粒的浓度在小鼠中对抗体应答有影响。如早先所讨论的，炎症作用可能是用CTAB-NP免疫后免疫应答的起因。因此，较高的纳米颗粒浓度有较高的免疫应答是可以理解的。

CTAB-NP的炎症作用在50mg/ml的浓度可见，因为5只小鼠中的4只在注射部位具有轻微炎症。在颈褶处免疫两周后，免疫在颈部依然可见。这表明在免疫期间发生了强炎症，使得如此高浓度的CTAB-NP不适宜用作佐剂，因为安全性和耐受性对于佐剂最重要。一方面引发很强抗体应答、而另一方面又具有毒性且高炎症性的佐剂并不适宜用于亲本应用(parental application)。此种的实例有CFA/IFA，当用CFA/IFA施用疫苗时，可以获得高抗体滴度，但是由于毒性问题CFA/IFA仅用于研究和开发。

PVA-NP显示了与其它o/w-NP配方类似的行为，因为在SD 35随着纳米颗粒浓度的提高IgG滴度提高(图19)。具有最高纳米颗粒浓度的PVA-NP(50mg/ml)在SD 35激发了比对照组显著更高的抗体应答。由其它浓度的PVA-NP引起的滴度也高于对照组，但是未观测到统计学显著的差异。此前研究的结果由此可以得到确认。

用于此免疫研究的任何浓度的PVA-NP都未见到注射部位的炎症，使得PVA-NP在最高的浓度比CTAB-NP有更好的耐受性，但是需要注意的是CTAB-NP在50mg/ml激发了比PVA-NP高得多的免疫应答。

Tween 20-NP显示了与其它o/w-NP配方类似的行为，因为在SD 35随着纳米颗粒浓度的提高IgG滴度提高(图20)。Tween-N在50mg/ml的浓度激发比LPS-NP(对照组)显著更高的免疫应答。在Tween 20-NP的其它浓度，未观测到与对照组相比显著的差异，即使将Tween20-NP与对照组相比时可见免疫应答的稍许提高。此前研究的结果由此可以得到确认。

Tween 20-NP与也是非离子PVA-NP一样，并未在注射部位诱导任何可见的炎症，意味着它们在安全性和耐受性方面优于CTAB-NP。

体内研究反映出对应用不同佐剂后免疫应答强度的洞悉。

对不同佐剂配方的测试反映出LPS-NP结合CpGare优于溶液中的LPS结合CpG。对此特别有兴趣，因为TLR-4激动剂代表了引发强免疫应答以获得适应性免疫的有趣的方式。LPS本身毒性太强以至于不能用于人类，但是类似的TLR-4激动剂已经在临床试验中进行着测试。用纳米颗粒制备TLR-4激动剂在佐剂效应方面可以是有益的，因为LPS-NP现实了与溶液中LPS相比改善的免疫应答。此外，发现CFA/IFA显示了比LPS-NP显著更高的抗体应答，但是测试CFA/IFA配方就是为了有阳性对照。由于毒性问题CFA/IFA被放弃，虽然用CFA/IFA可以产生很高的抗体应答。

用五种不同的o/w-NP配方进行的实验反映出，CTAB-NP引发最高的抗体应答。对此特别出乎意料，因为此前观测到没有OVA被吸附至CTAB-NP的表面，意味着将纳米颗粒摄取至细胞内并非是此处的作用模式。此外，CTAB-NP在用RAW 264.7细胞进行的细胞培养实验中显示了具有最低的细胞摄取率。相较于用CTAB-NP进行药物靶向，由于炎症而对免疫系统的激活似乎更像是造成高免疫应答的原因。此假说得到以下事实的支持：抗体应答随着CTAB-NP浓度的更高而提高，且在最高纳米颗粒浓度的CTAB-NP注射的部位可见炎症。

非离子o/w-NP配方的抗体应答与对照组相比也有稍许提高。非离子o/w-NP配方与对照组相比并未改变免疫应答(10mg/ml的纳米颗粒)。非离子o/w-NP配方抗体应答的显著差异仅在最高的纳米颗粒浓度观测到，表明剂量依赖性的炎症效应可能也是此处的作用模式。即使是低剂量的纳米颗粒配方，也观测到类似于高剂量纳米颗粒配方的高装载率，这导致了这样的推定：不是装载率，而应是纳米颗粒剂量决定了免疫应答。

据报道，纳米颗粒和微米颗粒(缀合有抗原)显示出比可溶抗原更强的免疫应答。在这些研究中，观察到大小依赖的作用，因为小于10μm的颗粒显示了显著更高的免疫应答。50–200nm大小范围的纳米颗粒引发比较大或较小颗粒更强的免疫应答。此前也曾研究过，树突状细胞能够将PLGA-NP内化。

然而，在那些研究中使用的纳米颗粒是通过双-乳剂方法制备的，并且推定抗原被包封在纳米颗粒内。在本工作中，我们现实了蛋白质并不位于纳米颗粒内部，而是吸附在颗粒表面。这并不与其他研究的发现相冲突，但是作用的模式必需重新考量，因为纳米颗粒对包封的抗原的吞噬作用曾被认为对于刺激免疫系统是很关键的。

装载了LPS的纳米颗粒(组合有抗原)显示了促炎症作用，其最终导致在小鼠研究中免疫应答的提高(Demento等人，2009)。在Demento等人的研究中，也假定抗原包封在纳米颗粒载体中会更好地内化至树突状细胞中。

然而，对于CTAB-NP观测到了本工作中最强的免疫应答，其并不具有吸附在颗粒表面的OVA。OVA溶于纳米颗粒悬液，表明用纳米颗粒摄取至细胞内对于强抗体应答并不重要。另外，可以假定CTAB-NP由于其毒性表面性质而激活免疫系统。

已经在体内测试了纳米颗粒作为疫苗佐剂的潜力，并在相较于可溶抗原具有显著更高免疫应答方面证明成功(Demento等人，2009)。然而，依然没有对于纳米颗粒作为疫苗佐剂作用模式的详尽理解。

将会需要进一步的测试来研究此工作中制备的o/w-NP的确切作用模式。非离子o/w-NP对于其佐剂能力而言，仅在50mg/ml的纳米颗粒浓度是种改善。CTAB-NP在较低浓度显示出佐剂效应，但是那些纳米颗粒由于潜在毒性而很可能不适宜用于疫苗接种。当使用CTAB-NP时，在本工作中进行的小鼠研究中的注射部位可见到炎症。

PLGA纳米颗粒已经显示出在小鼠中作为佐剂提高免疫应答。然而，需要进一步的研究，来确定纳米载体对于替代佐剂系统是否是改善，因为PLGA-NP很昂贵并且施用后的毒性作用可能超过益处。

4总结和结论

活体的、减毒疫苗是由不具有毒力但却有能力增殖的病毒或细菌构成。因此，因为微生物的增殖性质使得疫苗的分布遍布机体，而可以产生强免疫应答。疫苗的突变可以引起微生物恢复毒力。因此，基于安全性问题，更期望失活的、非活体疫苗。然而，失活的疫苗很少诱导足够强的免疫应答以实现适应性免疫。这就是为何佐剂对于成功的疫苗接种很关键。

本工作的目标是开发装载蛋白质的纳米颗粒作为亲本载体系统，用于递送抗原，特别是，具有巨大潜力成为佐剂的聚合载体系统。

纳米颗粒与病原体具有类似的大小，使得对它们用于抗原递送具有特别的兴趣。此外，纳米尺度的药物递送系统可以增强活性化合物穿过吸收屏障的转运，导致在树突状细胞和巨噬细胞内高量的抗原。

使用简化的方法来获得装载蛋白质的纳米颗粒。使用乳剂化-蒸发方法随后温育过程来制备颗粒，其中疏水药物(在此情形中为OVA或BSA)，被吸附至纳米颗粒表面。所获得的PLGA-NP用不同的表面活性剂制备，产生具有修饰的表面性质的纳米颗粒。使用了非离子表面活性剂Tween 20和PVA、阴离子表面活性剂SDS和胆酸钠、以及阳离子表面活性剂CTAB。对于颗粒大小、对OVA和BSA的装载、以及其释放特征而对颗粒进行了表征。对于所有配方都观测到了一小时内的快速释放。在大多数情况中，BSA以比OVA高的速率吸附至纳米颗粒上，吸附如何发生的确切作用模式依然未知。

还测量了五种不同纳米颗粒配方吸附产气荚膜梭菌α-类毒素的潜力。测试了两种不同的α-类毒素。一种是用福尔马林失活的来自产气荚膜梭菌的α-类毒素，而另一种是在经遗传学改造的大肠杆菌中表达的。使用SDS-PAGE，可以观测到两种蛋白质都不纯，导致与阳离子CTAB-NP聚集。阴离子SDS-NP和胆酸钠-NP与来自产气荚膜梭菌的α-类毒素不相容。PVA-NP和Tween 20-NP在与蛋白的相容性方面显示了令人满意的行为。此外，据发现大部分的α-类毒素吸附在非粒子纳米颗粒的表面。

蛋白质吸附至纳米颗粒的确切机制是许多研究的目标，但是还未有完全的解释。据相信蛋白质将其本身安排成围绕纳米颗粒的“蛋白质冠冕(protein corona)”。疏水相互作用似乎是蛋白质吸附至纳米颗粒期间的决定力量。

在用BALB/c小鼠进行的免疫研究中，确定了应用不同的装载OVA的纳米颗粒配方之后的免疫应答。CTAB-NP显示了与其它配方相比显著更高的抗体应答。这很出乎意料，因为OVA并不位于CTAB-NP的表面，而是就溶解在纳米颗粒悬液中。因此用CTAB-NP提升进入细胞内的转运则不太可能。第二高的抗体应答是由Tween 20-NP引发的，其表明这两种配方的毒性可能是高抗体应答的原因。当研究纳米颗粒配方不同浓度的影响时，反映出在最高的CTAB-NP浓度，于注射部位可见严重的炎症。这表明发生了明确的炎症，导致免疫系统的细胞如树突状细胞和巨噬细胞的累积，起对于适应性免疫很关键。

开发的另一佐剂配方是LPS-NP。LPS是TLR-4激动剂并因此是种有趣的物质，因为它们激活并辅助树突状细胞的成熟。使用乳剂化-蒸发方法来制备LPS-NP。经确定几乎70％的LPS结合至纳米颗粒上。使用体内研究，研究了LPS-NP的佐剂潜力。可以得到的结论是，LPS-NP当与CpG组合时，对于抗体应答而言比溶液中的LPS和CpG显著更加有益。这些发现对于新型佐剂的开发而言是令人感兴趣的，因为系的TLR-配体可以与纳米颗粒组合使用来改善其佐剂性质。

5缩写列表

℃ 摄氏度

API 活性药物成分

BCA 二喹啉甲酸

BSA 牛血清白蛋白质

CFA 完全弗氏佐剂

CLSM 共聚焦激光扫描显微镜

CTAB 十六烷基三甲基溴化铵

Da/kDa 道尔顿/千道尔顿

DMEM Dulbecco改良Eagle培养基

DMSO 二甲亚砜

DTT 二硫苏糖醇

e.g. 拉丁文：exempli gratia (为了示例)

EE 包封率

ELISA 酶联免疫吸附测定

et al 拉丁文：et alii (以及其它)

FDA 食品和药物管理局

FE-SEM 场发射扫描电子显微镜

Fig. 图

FITC 异硫氰酸荧光素

g 重力加速度

G 尺度

h 小时

IFA 弗氏不完全佐剂

IgG 免疫球蛋白质G

kV 千伏

LPS 脂多糖

min 分钟

MTT 溴化噻唑蓝四氮唑

n 数目，例如样品的数目

NP 纳米颗粒

o/w 水包油

OVA 卵清蛋白质

PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAMP 病原体相关的分子模式

PCS 光子相关光谱法

PDI 多分散指数

PLGA 聚乳酸-共-乙醇酸

PVA 聚乙烯醇

rcf 相对离心力

rpm 每分钟转数

s 秒

s.c. 皮下的

SD 标准偏差

SDS 十二烷基硫酸钠

SEM 扫描电子显微镜

STIKO 德语： Impfkommission des Robert Koch-Instituts

TLR Toll样受体

w/o 油包水

w/o/w 水包油包水

6附图列表

图1：使用水包油乳化蒸发方法制备纳米颗粒的示意图。

图2：用BALB/c小鼠进行的体内研究的研究概览。

图3：表面活性剂浓度对o/w-纳米颗粒颗粒大小(平均直径±SD，n＝3)的影响。

图4：表面活性剂浓度对o/w-纳米颗粒多分散性(均值±SD，n＝3)的影响。

图5：表面活性剂浓度对o/w-纳米颗粒ζ电位(均值±SD，n＝2)的影响。

图6:O/W-纳米颗粒(10mg/ml)用0.1mg/ml卵清蛋白质的装载率(均值±SD，n＝3)。

图7：O/W-纳米颗粒(10mg/ml)用0.1mg/ml BSA的装载率(均值±SD，n＝3)。

图8:蛋白质浓度对于(a)PVA(1％)-纳米颗粒、(b)Tween 20(1％)-纳米颗粒、(c)胆酸钠(0.05％)-纳米颗粒、和(d)SDS(0.01％)-纳米颗粒上装载率的影响(均值±SD，n＝3)。

图9：o/w-NP在PBS中于37℃的体外OVA释放(均值±SD；n＝3)。

图10：用考马斯亮蓝染色后的SDS-PAGE凝胶，o/w-NP配方在与类毒素和类毒素标准物温育后的上清；a)α-类毒素(大肠杆菌)：1)标记2)PVA-NP 3)Tween 20-NP 4)胆酸钠-NP 5)SDS-NP 6)CTAB-NP 7)α-类毒素(大肠杆菌)0.065mg/ml 8)α-类毒素(大肠杆菌)0.049mg/ml 9)α-类毒素(大肠杆菌)0.0325mg/ml 10)α-类毒素(大肠杆菌)0.016mg/ml；b)α-类毒素(产气荚膜梭菌)：1)PVA-NP 2)Tween 20-NP 3)胆酸钠-NP 4)SDS-NP 5)CTAB-NP6)标记7)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0054mg/ml 8)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0108mg/ml9)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0161mg/ml 10)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0215mg/ml。

图11：用考马斯亮蓝染色后的SDS-PAGE凝胶，o/w-NP配方在与类毒素、重扩散的o/w-NP(具有SDS和DTT)、以及α-类毒素(产气荚膜梭菌)的标准物温育后的上清：1)标记2)PVA-NP上清3)PVA-NP上清4)PVA-NP重扩散的(4x)5)PVA-NP重扩散的(1x)6)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0215mg/ml 7)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0161mg/ml 8)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0108mg/ml 9)α-类毒素(产气荚膜梭菌)0.0054mg/ml。

图12：免疫后小鼠的血清IgG-滴度(均值±SD，n＝5-6；*p<0.05(相较于PBS和LBS+CpG)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

图13：在第35研究日后每只小鼠的血清IgG-滴度(n＝5-6)。

图14：小鼠免疫后的血清IgG-滴度(均值±SD；n＝5-6)。

图15：在SD35免疫后小鼠的血清IgG-滴度(均值±SD；n＝5–6；*p<0.05(相较于I,$)p<0.05(相较于VII)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

图16：免疫后小鼠的血清IgG-滴度(均值±SD，n＝4-5)。

图17：在第35研究日免疫后小鼠的血清IgG-滴度(均值±SD，n＝4-5；*p<0.05(相较于LPS-NP)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

图18：在第35研究日免疫后小鼠的血清IgG-滴度，CTAB-NP为不同浓度(均值±SD，n＝4-5；*p<0.05(相较于LPS-NP)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

图19：在第35研究日免疫后小鼠的血清IgG-滴度，PVA-NP为不同浓度(均值±SD，n＝5；*p<0.05(相较于LPS-NP)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

图20：在第35研究日免疫后小鼠的血清IgG-滴度，Tween 20-NP为不同浓度(均值±SD，n＝5；*p<0.05(相较于LPS-NP)，Kruskal-Wallis单向评秩方差分析随后是Student-Newman-Keuls检验)。

8附录

8.1物质

表12：本研究中使用的物质列表

9参考文献

Demento,S.L.,Eisenbarth,S.C.,Foellmer,H.G.,Platt,C.,Caplan,M.J.,MarkSaltzman,W.,Mellman,I.,Ledizet,M.,Fikrig,E.,Flavell,R.A.,Fahmy,T.M.,2009.Inflammasome-activating nanoparticles as modular systems for optimizingvaccine efficacy.Vaccine 27,3013-3021.

Gutierro,I.,Hernandez,R.M.,Igartua,M.,Gascon,A.R.,Pedraz,J.L.,2002a.Influence of dose and immunization route on the serum Ig G antibodyresponse to BSA loaded PLGA microspheres.Vaccine 20,2181-2190.

Vauthier,C.,Bouchemal,K.,2009.Methods for the Preparation andManufacture of Polymeric Nanoparticles.Pharm Res 26,1025-1058.

Wachsmann,P.,Lamprecht,A.,2012.Polymeric nanoparticles for theselective therapy of inflammatory bowel disease.Methods Enzymol 508,377-397.

Waeckerle-Men,Y.,Groettrup,M.,2005.PLGA microspheres for improvedantigen delivery to dendritic cells as cellular vaccines.Adv Drug Deliv Rev57,475-482。

Claims (18)

1.两亲物包被的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括：

-由生物可降解聚合物组成的固体核，其中任选所述固体核的内部包括溶剂分子，和

-布置在所述固体核上的两亲物壳，

-以及，任选存在的，附着于所述两亲物和/或所述固体核的一或多种抗原。

2.权利要求1的两亲物包被的纳米颗粒，其具有低于250nm的直径或者优选具有范围在50-200nm的大小。

3.权利要求1或2的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物是合成聚合物，并且其中所述合成聚合物优选选自以下组中：聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸聚乙醇酸共聚物、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚氨基酸、和生物可降解的聚氨酯。

4.权利要求1-3任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物选自以下组中：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(ε-己内酯)PCL、聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)、PEG-PCL-PEG、和聚原酸酯。

5.权利要求1-4任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物是表面活性剂或TLR(Toll样受体)激动剂。

6.权利要求5的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物是选自以下组中的表面活性剂：非离子、阴离子、和阳离子表面活性剂，并且其中所述两亲物优选为：

-选自以下组的非离子表面活性剂：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪醇、烷芳基聚醚磺酸酯、和磺基琥珀酸钠的二辛酯，或

-选自以下组中的阴离子表面活性剂：十二烷基硫酸钠、脂肪酸的钠盐和钾盐、聚氧基硬脂酸酯、聚氧乙烯十二烷基醚、失水山梨醇倍半油酸酯、三乙醇胺、脂肪酸、和脂肪酸的甘油酯，或

-选自以下组中的阳离子表面活性剂：双十二烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、十六烷基三甲基氯化铵、二甲基十二烷基氨基丙烷、和N-十六烷基-N-乙基吗啉鎓乙基硫酸盐。

7.权利要求1-6任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物是选自以下组中的表面活性剂：聚乙烯醇(PVA)、聚山梨醇酯20(Tween 20)、十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

8.权利要求1-5任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物和/或所述一或多种抗原选自以下组中：TLR(Toll样受体)激动剂，并且其中所述两亲物和/或所述一或多种抗原优选选自以下组：TLR1激动剂、TLR2激动剂、和TLR4激动剂。

9.权利要求8的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述TLR激动剂选自以下组：脂多糖(LPS)或其衍生物、脂磷壁酸(LTA)、Pam(3)CysSK(4)((S)-[2,3-5w(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys₄-OH或Pam₃-Cys-Ser-(Lys))、Pam3Cys(S-[2,3-双(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸或三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)、Cadi-05、ODN 1585、酵母聚糖、合成的三酰基化的和二酰基化的脂肽、MALP-2、三棕榈酰化的脂肽、具有2-氨基吡啶融合至五元含氮杂环的化合物、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚IC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、单磷酰基脂质A("MPL")、咪唑并喹啉化合物(例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺)、苯并咪唑衍生物、C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、N7,C8-取代的鸟嘌呤核糖核苷酸、细菌热休克蛋白质-60(Hsp60)、肽聚糖、鞭毛蛋白质、甘露糖醛酸聚合物、flavolipins、糖醛酸磷壁酸、ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、或其组合。

10.权利要求1-5、8、和9任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物是选自以下组中的TLR激动剂：LPS或其衍生物、和LTA，和/或其中所述一或多种抗原选自以下组：蛋白质和肽，并且其中所述一或多种抗原优选是α-毒素，更优选产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)α-毒素或α-类毒素。

11.权利要求1-10任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述两亲物和/或所述一或多种抗原是选自LPS或其衍生物的TLR4激动剂，并且其中所述LPS的衍生物优选选自以下组：单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)、和吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。

12.权利要求11的两亲物包被的纳米颗粒，其中所述吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)是化学式(I)的化合物：

或其药物可接收的盐，其中：

L₁、L₂、L₃、L₄、L₅和L₆是相同的或不同的并且独立地选自-O-、-NH-和-(CH₂)-；

L₇、L₈、L₉和L₁₀是相同的或不同的并且各自独立地不存在或者是-C(＝O)-；

Y₁是酸官能团并且优选为-OP(＝O)(OH)₂；

Y₂和Y₃是相同的或不同的并且各自独立地选自-OH、-SH、和酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆是相同的或不同的并且独立地是C_8-20烷基；和

R₂和R₄是相同的或不同的并且独立地是C_6-20烷基，

并且其中

Y₂、Y₃和Y₄每个优选为-OH；和/或

R₁、R₃、R₅和R₆是相同的或不同的，并且优选地，独立地是C_8-13烷基；和/或

R₂和R₄是相同的或不同的，并且优选地，独立地是C_6-11烷基。

13.权利要求1-12任一项的两亲物包被的纳米颗粒，其可通过包含以下步骤或由以下步骤组成的方法获得：

(a)将(i)含有生物可降解聚合物的有机溶剂添加至(ii)含有两亲物的水成相，和

(b)将合并的有机溶剂和水成相以足以形成稳定乳剂的能量进行声波处理；和

(c)从所述稳定乳剂蒸发有机溶剂；

(d)以及，任选地，从至少部分剩余的水成相中分离所得的纳米颗粒，并优选将所得的纳米颗粒冻干，和/或将所得的纳米颗粒保存在不超过7℃的温度；

(e)以及，任选地，将所述一或多种抗原或包含所述一或多种抗原的组合物添加至剩余的水成相和/或所得的纳米颗粒。

14.用于制备权利要求1-13任一项的两亲物包被的纳米颗粒的方法，其中所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：

(a)将(i)含有生物可降解聚合物的有机溶剂添加至(ii)含有两亲物的水成相，和

(b)将合并的有机溶剂和水成相以足以形成稳定乳剂的能量进行声波处理；和

(c)从所述稳定乳剂蒸发有机溶剂；

(d)以及，任选地，从至少部分剩余的水成相中分离所得的纳米颗粒，并优选将所得的纳米颗粒冻干，和/或将所得的纳米颗粒保存在不超过7℃的温度；

(e)以及，任选地，将所述一或多种抗原或包含所述一或多种抗原的组合物添加至剩余的水成相和/或所得的纳米颗粒。

15.权利要求13的两亲物包被的纳米颗粒或权利要求14的方法，其中所述有机溶剂是非极性有机溶剂，并且其中所述非极性有机溶剂优选选自以下组中：乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、六氟异丙醇、和六氟丙酮倍半水合物。

16.权利要求1-13任一项的两亲物包被的纳米颗粒，

用作免疫调节剂，特别是用作佐剂，

或者用于在对象中刺激免疫应答的方法。

17.权利要求1-13任一项的两亲物包被的纳米颗粒作为佐剂用于制备疫苗的用途，其中所述疫苗优选包含抗原。

18.用于在对象中刺激免疫应答的方法，包括向所述对象施用包含权利要求1-13任一项的一种或多种纳米颗粒的组合物。