CN106676074A - 一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，包括以下步骤：将获得单细胞状态的人肝癌细胞，加入培养基中，制成细胞悬液；将细胞悬液滴加到多孔纤维素支架上，待细胞悬液渗入到多孔纤维素支架内部，置于细胞培养箱中培养贴附，然后再加入培养基置于细胞培养箱中培养数日，得到三维培养细胞；通过使用Western Blot、定量PCR、流式细胞术和IHC检测三维培养细胞中的肝癌干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化和（或）显微镜观察，检测转化的肝癌干细胞。本发明还公开了肝癌干细胞及其应用。本发明获得的肝癌干细胞具有耐药性。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤学和干细胞学研究领域，具体涉及一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法。
背景技术
肝癌是一种终末期肝病，病情凶险，病死率高达80％，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。我国是肝病高发国家，目前有各类肝病患者1亿余人，全球每年新发100例肝癌中，有55例是中国人。有研究认为肿瘤干细胞的存在是恶性肿瘤发生的重要原因。肝癌干细胞能够抵抗癌症治疗药物，抵御化疗辐射，增加术后的肿瘤复发和转移几率。综上，如何开发出合适的细胞培养和筛选方法以有效分离筛选出肝癌干细胞，从而用以肝癌发病机制，药物及免疫治疗等方面的研究是本发明所要解决的主要问题。
既往的研究表明，EpCAM、OCT4、CD44和CD133是肝癌干细胞最基本的分子标志物，与肝癌细胞侵袭，转移等活动密切相关。因此，如何开发以肝癌干细胞为靶点的抗肿瘤药物是治疗肝癌的重要契机。然而，由于肝癌干细胞在肝癌组织中的分布比例很低，因此如何体外培养肝癌干细胞，成为了肝癌干细胞技术发展亟待解决的问题。
近年来，三维细胞培养技术日渐成熟。三维培养技术是指将具有三维结构的载体与细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体支架的立体空间中迁移、生长，构成具有三维结构特征的细胞-载体复合物。目前，三维细胞培养技术在肿瘤生物学，软骨和骨组织，循环系统和心脏，神经系统等领域都得到了广泛应用，扩大了生物医学研究的广度和深度。
传统的二维细胞培养系统由于细胞在体外培养条件下生长逐渐丧失了原有的性状，往往和生物体内情况不相符，而动物实验受到体内外多种复杂因素共同影响，难以研究单一因素调控机制。三维细胞培养技术则介于二维细胞培养与动物实验之间的一种新型技术，能够最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供了一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法。
本发明的另一目的是提供了诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法获得的肝癌干细胞。
本发明的另一目的是提供了肝癌干细胞在抗肿瘤药物的体外筛选或肿瘤细胞体外药敏实验中的应用。
技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，包括以下步骤：
1)将获得单细胞状态的人肝癌细胞，加入培养基中，制成细胞悬液；
2)将细胞悬液滴加到多孔纤维素支架上，待细胞悬液渗入到多孔纤维素支架内部，置于细胞培养箱中培养贴附后再加入培养基，再置于细胞培养箱中培养数日，得到三维培养细胞；
3)使用Western Blot、RT-PCR、流式细胞术和IHC，测定三维培养细胞中的肝肿瘤干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化，并使用显微镜观察方法检测转化所得肝癌干细胞。
其中，上述多孔纤维素支架以纤维素为主要材料，或以纤维素为主辅以其它生物相容性较好的各种生物材料。
其中，上述纤维素材料可为甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙甲基纤维素及纤维素醚酯类材料。
其中，上述多孔纤维素支架可用溶液浇注/粒子沥滤法制备，亦可用熔融沉积法、3D打印技术及立体光刻法等制备所得。
其中，上述多孔纤维素支架为互通多孔的海绵状载体，孔径为50～500μm。
其中，上述多孔纤维素支架的孔径优选为50-200μm。该孔径分布均匀，细胞易于进入孔中，并为生长为细胞微球提供空间。
其中，上述多孔纤维素支架刚度为5～100kPa。
其中，上述多孔纤维素支架刚度优选为5～30kPa。
其中，上述肝癌细胞为HepG2、HUH7、PLC/PRF/5或其它类型肝癌细胞。
其中，上述培养基为肝癌细胞系培养时所用相应培养基或不含血清的肿瘤干细胞培养基。
其中，上述培养条件为温度35-39℃，氧气含量3％-21％，二氧化碳5％。
本发明的内容还包括采用上述的方法转化得到的肝癌干细胞。
本发明的内容还包括将上述的肝癌干细胞在抗肿瘤药物的体外筛选或肿瘤细胞体外药敏实验中的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明采用多孔纤维素支架对人肝癌细胞进行三维培养，直接获得肝癌干细胞微球，所得微球细胞含大量EpCAM，OCT4，CD44和CD133阳性细胞，明显具有肝癌干细胞的特性。
2、本发明的诱导方法操作简便，无需对细胞进行复杂的预处理，不会对细胞造成附加的物理化学压力，细胞处于正常生理状态。
3、本发明的诱导分化方法能最大程度的诱导肝癌细胞转化为肝癌干细胞，为肝癌的诊断和治疗提供新的思路。本发明方法得率高，时效快，且可不使用商品化干细胞培养产品，降低价格成本。
4、本发明的诱导转化方法中使用多孔纤维素支架，可以为细胞提供三维生长环境，模拟体内的微环境。
5、本发明获得的肝癌干细胞对5-FU及顺铂具有很好的耐药特性，可用于抗肿瘤药物药敏测试。
附图说明
图1 Western Blot技术检测二维和三维培养的HepG2、HUH7、PLC/PRF/5细胞中EpCAM，OCT4，CD44和CD133的蛋白表达水平；
图2 Real time-PCR技术检测二维和三维培养的HepG2、HUH7细胞中EpCAM和OCT4mRNA表达水平；
图3 IHC技术检测二维和三维培养的HepG2和HUH7细胞中EpCAM和CD44表达水平；
图4流式细胞术检测二维和三维培养的HepG2细胞中CD44和CD133的表达水平；
图5流式细胞术检测二维和三维培养的PLC/PRF/5细胞中CD44和CD133的表达水平；
图6显微镜在明场条件下观察实施例1的二维和三维培养的HepG2和HUH7细胞。
图7二维和三维培养的肝癌细胞PLC/PRF/5细胞的耐药实验；
图8二维和三维培养的肝癌细胞HepG2细胞的耐药实验。
具体实施方式
下面对本发明作更进一步的说明。
实施例1：一种诱导肝脏肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化的方法
1)将生长状态良好，处于对数生长期的肝癌细胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，获得单细胞状态的人肝癌细胞，去除含胰酶的消化液后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，制成细胞悬液；
2)将适量细胞悬液平铺于细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2，20％氧气含量，细胞培养箱培养7天，作为二维培养细胞对照。隔天更换DMEM完全培养基；其中，所述DMEM完全培养基为添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
3)将60μl细胞悬液(细胞密度为105个/ml)滴加在多孔纤维素支架上，置于37℃，5％CO2，20％氧气，细胞培养箱中4小时贴附后加入DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2，20％氧气，培养箱培养7天，得三维培养细胞。隔天更换培养基。该多孔纤维素支架的纤维素主要为甲基纤维素，孔径为50μm，刚度为15kPa；
4)分别收集二维和三维培养得到的细胞，使用Western Blot，RT-PCR，流式细胞术和IHC等方法，测定二维或三维培养条件下，肝癌细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化，并以显微镜观察三维培养细胞表征变化。
实施例2一种诱导肝脏肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化的方法
1)将生长状态良好，处于对数生长期的肝癌细胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，获得单细胞状态的人肝癌细胞，去除含胰酶的消化液后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，制成细胞悬液；
2)将适量细胞悬液平铺于细胞培养皿中，置于35℃，5％CO2，5％氧气，细胞培养箱培养7天，作为二维细胞培养对照。隔天更换所述DMEM完全培养基；其中，所述DMEM完全培养基为添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
3)将60μl细胞悬液(细胞密度为105个/ml)滴加在多孔纤维素支架上(置于37℃，5％CO2，21％氧气细胞培养箱中4小时贴附后加入DMEM完全培养基，置于35℃，5％CO2，5％氧气培养箱中培养7天，得三维培养细胞。隔天更换DMEM完全培养基。该多孔纤维素支架的纤维素主要为羟丙基纤维素，孔径为100μm，刚度为30kPa；
4)分别收集二维和三维培养得到的细胞，使用Western Blot，RT-PCR，流式细胞术和IHC等方法，测定二维或三维培养条件下，肝癌干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化，并以显微镜观察三维培养细胞表征变化。
实施例3一种诱导肝脏肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化的方法
1)将生长状态良好，处于对数生长期的肝癌细胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，获得单细胞状态的人肝癌细胞，去除含胰酶的消化液后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，制成细胞悬液；
2)将适量细胞悬液平铺于细胞培养皿中，置于35℃，5％CO2，10％氧气，细胞培养箱培养7天，作为二维细胞培养对照。隔天更换无血清肿瘤干细胞培养基；
3)将60μl细胞悬液(细胞密度为105个/ml)滴加在多孔纤维素支架上(置于37℃，5％CO2，21％氧气细胞培养箱中4小时贴附后加入无血清肿瘤干细胞培养基，置于35℃，5％CO2，10％氧气培养箱中培养7天，得三维培养细胞。隔天更换无血清肿瘤干细胞培养基。该多孔纤维素支架的纤维素主要为羟丙甲基纤维素，孔径为500μm，刚度为100kPa；
4)分别收集二维和三维培养得到的细胞，使用Western Blot，RT-PCR，流式细胞术和IHC等方法，测定二维或三维培养条件下，肝癌干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化，并以显微镜观察三维培养细胞表征变化。
实施例4
1)将生长状态良好，处于对数生长期的肝癌细胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，获得单细胞状态的人肝癌细胞，去除含胰酶的消化液后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，制成细胞悬液；
2)将适量细胞悬液平铺于细胞培养皿中，置于39℃，5％CO2，10％氧气，细胞培养箱培养7天，作为二维细胞培养对照。隔天更换无血清肿瘤干细胞培养基；
3)将60μl细胞悬液(细胞密度为105个/ml)滴加在多孔纤维素支架上(置于39℃，5％CO2，21％氧气细胞培养箱中4小时贴附后加入无血清肿瘤干细胞培养基，置于39℃，5％CO2，10％氧气培养箱中培养7天，得三维培养细胞。隔天更换无血清肿瘤干细胞培养基。该多孔纤维素支架的纤维素主要为纤维素醚酯，孔径为500μm，刚度为100kPa；
4)分别收集二维和三维培养得到的细胞，使用Western Blot，RT-PCR，流式细胞术和IHC等方法，测定二维或三维培养条件下，肝癌干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化。并以显微镜观察三维培养细胞表征变化。
实验例1 Western Blot技术检测
1.1总蛋白的提取
将实施例1获得的二维和三维细胞用胰蛋白酶消化后，于冷PBS中洗涤2遍，各加入200μl冰预冷裂解缓冲液，混匀后冰浴30min，每隔5min震荡10s，充分裂解。离心25min。将上清分装，存于-20度备用。
1.2 BCA法蛋白浓度的测定
1.2.1根据样品的数量，按50体积BCA试剂A加入1体积的BCA试剂B，配置适量BCA工作液，然后用枪头充分混匀。
1.2.2完全溶解蛋白标准品，取10μl蛋白标准品稀释至100μl，使其终浓度为0.5mg/ml。
1.2.3将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl，依次加到96孔板的标准品孔中，用标准品稀释液补足到每孔20μl。
1.2.4加10μl待测样品到96孔板的样品孔中，用标准品稀释液到20μl。
1.2.5各孔加入200μl的BCA工作液，37度孵育30min。
1.2.6测定样品和标准品在520nm波长的光密度值。根据蛋白标准品的浓度标准曲线，计算出各组样品的蛋白浓度。
1.3 SDS-PAGE电泳
1.3.1将15μl调整为相同浓度的蛋白裂解液加入5μl的SDS上样缓冲液混匀，取干净的Bio-Rad 1.5cm玻璃板，按说明书在制胶架上装好。
1.3.3按下表配制10％的分离胶：
1.3.4小心用枪头将分离胶注入玻璃板间隙中，大约在占三分之二玻璃板高度处停止，之后在上面加入几毫升双蒸水，目的是阻止空气对凝胶聚合的抑制作用。
1.3.5分离胶聚合完成之后，倒掉胶上面覆盖的双蒸水，用滤纸尽量吸净残存的液体，小心不要碰到分离胶。
1.3.6按下表配制5％浓缩胶，并注入分离胶的上端，小心插入与玻璃板厚度相适应的样品梳子，避免产生气泡。
1.3.2浓缩层胶聚合后，小心拔去样品梳子，然后加入1xTris-Gly的电泳缓冲液，检查是否有泄漏。
1.3.8吸取适量样品上清加入样品孔中，在样品旁的孔中加入预染的蛋白Marker，未添加样品上清的孔中，加入1xSDS上样缓冲液保持胶面平衡。
1.3.9打开电源，电压开始设置为80V，当蛋白样品进入分离胶后，电压可提高到120V。参照预染Marker的位置，待目的条带进入凝胶最佳分离区(大约凝胶的2/3)时，停止电泳。
1.4转膜
1.4.1预先将转膜液4度预冷。
1.4.2砸托盘上打开转移盒，靠近阴极侧的内面铺上已经用转膜缓冲液浸湿的有孔维垫，其上放三层浸有转膜缓冲液的滤纸，注意排净气泡。
1.4.3小心撬开玻璃板，将胶放置含有转膜液的托盘内，将含有目的条带的分离胶切下，用转膜液浸泡后置于滤纸上。
1.4.4在凝胶上铺上经甲醇和转膜液浸湿的PVDF膜，胶和膜之间不能有气泡。
1.4.5在PVDF膜上再放两层浸过转膜液的Whatman滤纸，注意排净气泡。
1.4.6放上第二块海绵垫，关闭转印夹，放入转移槽中，槽中灌满转膜液。
1.4.7打开电源，100V，60min；
1.4.8转膜结束后，取出PVDF膜并作好标记，用TBST洗膜10min*3次。
1.5封闭、抗原抗体反应
1.5.1封闭：将PVDF膜放入平皿中，加入含5％脱脂奶粉的封闭液，摇床震荡1.5-2h。
1.5.2封闭结束后，用TBST洗膜10min*3次。
1.5.3将膜放入含一抗的平皿中，4度摇床震荡孵育过夜。
1.5.4第二天取出，吸弃一抗，TBST洗10min*3次。
1.5.5用5％脱脂奶粉封闭液稀释二抗，室温摇床震荡反应1-2h。
1.5.6二抗反应结束后，回收二抗。然后用TBST洗膜5-10min*3.
1.6显色
1.6.1将ECL化学发光试剂盒中的A、B两种液体按1：1等体积混合，配制成工作液备用。
1.6.2将PVDF膜从TBST中取出，甩掉多余的液体，将含有蛋白质的膜正面朝上，放在保鲜膜，滴加适量工作液，用保鲜膜覆盖，放置显影夹内，关闭显影夹。
1.6.3进入暗室显影，将感光胶片放在显影夹中，根据蛋白条带强度调整曝光时间，然后将胶片依次放入显影液、定影液中，使胶片显影和定影。
通过采用上述常规的Western Blot技术在实施例1的二维和三维培养的HepG2、HUH7、PLC细胞中检测了EpCAM，OCT4，CD44和CD133的蛋白表达水平。由图1可知，三维培养条件下，各细胞中EpCAM，OCT4，CD44和CD133的蛋白表达水平均有升高。具体表现为三维培养时，各分子的Western Blot条带灰度值高于二维培养条件。
实验例2 RT-PCR技术检测
1、RNA提取
1.1向实施例1获得的二维和三维培养条件下得到的细胞弃去培养上清加入1ml预冷的TRIzol，用1ml枪头反复吹打至无颗粒透明装溶液即为裂解的细胞液；
1.2将上述充分裂解的细胞液转移至1.5ml离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
1.3加入氯仿(每使用1ml TRIzol加0.2ml氯仿)，盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s，溶液呈乳白状，无分层现象，室温静置3min；
1.4 12,000g，4℃离心15min；
1.5取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相；
1.6小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相体积约为所用Trizol试剂的60％；
1.7向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12,000g，4℃离心10min；
1.8小心去除上清，缓慢沿管壁加入1ml 70％的乙醇(用DEPC处理过的水配制)，轻轻混匀；
1.9 12,000g，4℃离心10min；
1.10小心吸尽上清，室温干燥沉淀5min左右，适量而定(不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解)，加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。
2、RNA浓度和纯度的测定
2.1取5μL RNA样品到595μL 1×TE Buffer中，测定样品在260nm和280nm的吸收值确定；
2.2 RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL(比色皿光径1cm)，OD260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
3、cDNA第一链合成(10μL体系)：
3.1反应体系
轻弹管底将溶液混合，6 000rpm短暂离心。
3.2混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
3.3取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4 Real time-PCR实验
4.1按照一定的顺序，一个样本基因做2个复孔；
4.2往0.1ml PCR管，依次加入如下组份：
4.3 PCR扩增程序
制备好的样品上机测试，根据检测基因不同设置不同反应条件。该条件均为常规PCR实验条件。使用Realtime-PCR技术，在实施例1的二维和三维培养的HepG2、HUH7细胞中检测了EpCAM，和OCT4mRNA表达水平。在三维培养的细胞中，EpCAM和OCT4的表达量明显升高。在HepG2细胞中EPCAM mRNA表达水平增加24倍，OCT4的mRNA表达水平增加74倍。在HUH7细胞中，OCT4的mRNA表达水平增加24倍(图2)。
实验例3 IHC技术检测
1.将细胞爬片固定样品或三维培养切片样品进行石蜡切片后置于70℃烘箱中，烘片2小时，过梯度酒精脱蜡，用PBS冲洗三次，每次3min。
2.取一定量pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3min。
3.每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3min。
4.每张切片滴加1滴免疫组化非特异性染色阻断剂，室温下孵育10min。
5.除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体(稀释倍数为1：500)，4度孵育过夜。
6.PBS冲洗3×5min。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20min。PBS冲洗3×3min。
7.除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30min。PBS冲洗3×5min。
8.除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察10min。
9.苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
使用IHC技术，在实施例1的二维和三维培养的HepG2和HUH7细胞中检测了EpCAM和CD44表达水平。在三维培养的细胞中，EpCAM和CD44的表达量明显升高(图3)。二维培养的细胞中，EpCAM和CD44表达量极低，几乎无法在染色切片中观察到，三维培养的细胞中，目的染色分子阳性率显著升高。
实验例4流式细胞术检测
1.将HepG2和PLC/PRF/5细胞分别进行二维及三维培养，在与实施例1相同培养条件下培养相同时间。
2.胰酶消化收集细胞，并用1mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。对于三维培养的细胞，胰酶消化后将多孔甲基纤维素支架机械分离，使得细胞团散落入消化液中，并过滤掉支架碎片，得到三维培养细胞。
3. 1200rpm离心5min，去除上清，加5mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到1.5mL离心管中。
4.按照1:500加入1UL一抗，置于垂直混合液上室温孵育1小时。
5. 1200rpm，小型离心机离心5min，去除上清，加1mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS中。
6.将荧光二抗按照1:800比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。
7. 1200rpm离心5min，去除上清，加1mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2mL PBS中。
8.用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在流式细胞仪上分析。
使用流式细胞术，在实施例1制备的二维和三维培养的HepG2和PLC/PRF/5细胞中检测了CD44和CD133的表达水平。采集细胞量为1万个细胞。二维培养和三维培养的细胞样本均设置了单染二抗的阴性对照，以及单染CD44和单染CD133的组别，在统一实验条件和检测参数的前提下，排除假阳性结果后，从流式检测的阳性百分比中可见三维培养的各组细胞中，CD44和CD133表达量明显升高(图4～图5)。
实验例5
使用显微镜在明场条件下观察实施例1的二维和三维培养的HepG2和HUH7细胞。由图6可见，二维培养的细胞贴附在培养皿底部，形态舒展，而三维培养的细胞则悬浮于培养液中成团生长，表现为多个细胞聚集在一起，成为微细胞球。
实验例6
1.96孔板中三维培养的PLC/PRF/5细胞和HepG2细胞的肝癌干细胞和二维培养的肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2细胞在培养第4天加入5-FU或顺铂后培养72小时；对照(control)为不加入相应抗肿瘤药物的三维培养的肝癌干细胞和二维培养的肝癌细胞；
2.上述二维及三维培养细胞培养第7天，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS<pH＝7.4>配)20μl；
2.继续孵育4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解；
3.比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果；
4.根据检测所得吸光度值，计算不同处理条件下细胞活力(cell viability)。
以此进行二维培养的肝癌细胞和三维培养的肝癌干细胞耐药实验，由图7和图8可知，该三维培养的肝癌干细胞的耐药性远远高于二维培养细胞。
由以上结果实验例1～6显示，使用三维培养技术能够将肝癌细胞转化为肝癌干细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将获得单细胞状态的人肝癌细胞，加入培养基中，制成细胞悬液；
2）将细胞悬液滴加到多孔纤维素支架上，待细胞悬液渗入到多孔纤维素支架内部，置于细胞培养箱中培养贴附后再加入培养基，再置于细胞培养箱中培养数日，得到三维培养细胞；
3）使用Western Blot、RT-PCR、流式细胞术和IHC判断三维培养细胞中的肝癌干细胞标志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表达情况的变化以及通过显微镜观察方法检测转化所得肝癌干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述多孔纤维素支架以纤维素为主要材料，或以纤维素为主辅以其它生物相容性较好的各种生物材料。
3.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述多孔纤维素支架为互通多孔的海绵状载体，内部孔径为50~500μm。
4.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述多孔纤维素支架刚度为5~100kPa。
5.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2、HUH7、PLC/PRF/5或其它类型肝癌细胞。
6.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述培养基为肝癌细胞系培养时所用相应培养基或不含血清的肿瘤干细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述培养温度为35-39℃。
8.根据权利要求1所述的一种诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化的方法，其特征在于，所述培养条件为氧气含量3%-21%、二氧化碳含量5%。
9.权利要求1~8任一项所述的方法转化得到的肝癌干细胞。
10.权利要求9所述的肝癌干细胞在抗肿瘤药物的体外筛选或肿瘤细胞体外药敏实验中的应用。
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