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CN106636157A - 一种突变α‑乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用 - Google Patents

一种突变α‑乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用 Download PDF

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CN106636157A
CN106636157A CN201610846374.4A CN201610846374A CN106636157A CN 106636157 A CN106636157 A CN 106636157A CN 201610846374 A CN201610846374 A CN 201610846374A CN 106636157 A CN106636157 A CN 106636157A
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CN
China
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mcac
hamlet
expression vector
mutation
alpha lactalbumin
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Application number
CN201610846374.4A
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张轶博
曾瑞霞
李新
翟伟慧
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Jinzhou Medical University
Original Assignee
Jinzhou Medical University
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明公开了一种突变α‑乳清蛋白表达载体，所述突变α‑乳清蛋白表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该表达载体中将人源α‑乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT、CAG、TCA、AGG和AAC。本发明还公开了一种利用上述突变α‑乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法。该方法解决了现有的通过离子交换层析柱和金属镍螯合柱制备HAMLET的方法中，由于EDTA对NTA金属镍螯合柱清洗作用，增加生产步骤、又增加蛋白质变性、降解的风险，容易导致HAMLET制备失败的问题。建立了一个快速、规模化的HAMLET制备方法。

Description

一种突变α-乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种突变α-乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用。
背景技术
HAMLET(Humanα-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells)是一种以人源α乳清蛋白为主要成分、可导致肿瘤大量死亡的复合物。HAMLET最初在人乳抑菌效应的研究被偶然发现，继而被证实为一种对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的效应分子。在使用不同细胞系的研究中发现HAMLET具有选择性诱导转化细胞、部分胚胎细胞和淋巴细胞发生凋亡的效应，而对成熟的分化细胞没有显著的毒性作用。进一步的研究表明HAMLET具有广谱的抗肿瘤作用，能够杀伤超过40种不同组织来源的肿瘤细胞系。在动物在体模型和临床预试验中，HAMLET对人神经胶质瘤，皮肤乳头状瘤及膀胱癌等均有较好的疗效，且无明显的毒副作用。鉴于HAMLET在肿瘤治疗中的潜在临床应用前景，当前的HAMLET研究开始关注其结构特点，诱导肿瘤细胞死亡的机制以及其规模化生产流程的优化等方面。
目前，HAMLET的结构已经明确，主要由人源α-乳清蛋白(Humanα-Lactalbumin，HLA)与油酸(oleic acid C18：1，OA)按一定比例复合而成。HLA结构研究已经很清楚了，它是由123氨基酸组成的分子量14.2kDa酸性钙结合蛋白，主要有两个结构域：一个大的α-螺旋结构域包含4个α-螺旋(5-11，23-34，86-98和106-110氨基酸)和一个由3个β-折叠组成的结构域(41-43，48-50和55-56氨基酸)。通过钙离子结合环(氨基酸K79，D82，D84，D87和D88)连接这两个结构域，并通过四个二硫键(氨基酸6-12，61-77，73-91和28-111)形成结构稳定的球形蛋白。但是，这种天然状态的HLA只有失去Ca2+后形成熔球态结构的apo-HLA，才能与油酸结合形成HAMLET。二个二硫键(61-77，73-91)的存在对于钙离子结合环的形成和熔球态的α乳清蛋白是形成HAMLET的关键成份。
现有的通过离子交换层析柱和金属镍螯合柱制备HAMLET的方法，原核表达含his标签的rHLA蛋白，经NTA金属镍螯合柱纯化后，再经EDTA去除钙离子得到apo-rHLA，透析后的apo-rHLA在NTA金属镍螯合柱上与水溶性油酸结合，最终形成HAMLET。这种方法中，由于EDTA对NTA金属镍螯合柱清洗作用，增加了突变α-乳清蛋白的生产步骤，又增加了蛋白变性、降解的风险，容易导致HAMLET制备失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变α-乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用，解决了现有的通过离子交换层析柱和金属镍螯合柱制备HAMLET的方法中，由于EDTA对NTA金属镍螯合柱清洗作用，增加了突变α-乳清蛋白的生产步骤，又增加了蛋白质变性、降解的风险，容易导致HAMLET制备失败的问题。
本发明提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体，所述突变α-乳清蛋白表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在pET30a质粒中插入人源α-乳清蛋白的基因片段，构建出pET30a-HLA质粒，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示；
步骤2，pET30a-HLA质粒的突变
步骤2.1，设计用于制备pET30a-HLA表达载体的引物Mu-F1和Mu-R1，并分别对引物Mu-F1和Mu-R1的5’端进行磷酸化修饰；
Mu-F1的序列为：
5’-TCAGTCAAGGAACATCGCTGACATCTCCTGTGAC-3’；
Mu-R1的序列为：
5’-ATGTTCCTTGACTGAGGGACCTGGCTGCTCTTGC-3’；
步骤2.2，采用步骤2.1的引物Mu-F1和Mu-R1，并利用点突变试剂盒将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT、CAG、TCA、AGG和AAC，得到突变后的PCR产物；
步骤2.3，回收突变后的PCR产物，并将突变后的PCR产物进行自身连接反应，回收得到突变α-乳清蛋白表达载体。
本发明还提供了上述突变α-乳清蛋白表达载体在制备HAMLET中的应用。
本发明还提供了利用上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将所述突变α-乳清蛋白表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21中，进行突变α-乳清蛋白的表达，并收集含有突变α-乳清蛋白的BL21菌体沉淀；
步骤(2)，加1×PBS缓冲液重悬BL21菌体沉淀，移入容器中，放在冰上30min，超声破菌直至液体清亮，离心，收集菌体碎片沉淀；
步骤(3)，用GuMCAC-0缓冲液重悬菌体碎片沉淀，室温放置2-4h，然后于4℃，16000-18000g离心30min，收集上清，得到含有突变α-乳清蛋白的溶液，然后进行突变α-乳清蛋白复性，得到复性蛋白溶液；
每升GuMCAC-0缓冲液由以下组分制成：20mmol的Tris-HCl，0.5mol的NaCl，6mol的盐酸胍，100ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至7.9。
步骤(4)，HAMLET的制备
步骤(4.1)，将复性蛋白溶液以10-15ml/h的流速过金属镍螯合柱；
步骤(4.2)，用MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20-30ml/h；
步骤(4.3)，以10-15ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，流速为10-20ml/h，然后静置2-4h，最后用10ml的MCAC-0冲洗金属镍螯合柱；
步骤(4.4)，分段洗脱：分别取10ml下列缓冲液，并依次采用下列缓冲液洗金属镍螯合柱：MCAC-20，MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，且流速均为10-20ml/h，并收集MCAC-100的冲洗液和MCAC-200的冲洗液；
其中，每升MCAC-0由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；
每升MCAC-500由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，0.5mol的咪唑，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；
MCAC-200由MCAC-0和MCAC-500按3∶2的体积比例混合而成；MCAC-100由MCAC-0和MCAC-200按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-80由MCAC-0和MCAC-100按1∶4的体积比例混合而成；MCAC-60由MCAC-0和MCAC-80按3∶4的体积比例混合而成；MCAC-40由MCAC-0和MCAC-80按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-20由MCAC-0和MCAC-40按1∶1的体积比例混合而成；
步骤(4.5)，将MCAC-100的冲洗液或者MCAC-200的冲洗液加入第一透析袋中，然后将第一透析袋置于溶解缓冲液中，4℃透析24-28h，得到HAMLET透析液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液；
步骤(4.6)，将HAMLET透析液真空冷冻干燥，得到HAMLET。
优选的，所述突变α-乳清蛋白复性，具体包括以下步骤：
将含有突变α-乳清蛋白的溶液加入第二透析袋中，然后将透析袋置于4M复性缓冲液中，室温透析24-28h，期间1000rpm磁力搅拌4M复性缓冲液，然后倒出1/2体积的4M复性缓冲液，滴加入不含盐酸胍复性缓冲液，继续室温透析24-28h；
其中，不含盐酸胍复性缓冲液与剩余4M复性缓冲液的体积比例为1∶1；
每升4M复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，1mmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，4mol盐酸胍，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0。
每升不含盐酸胍复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，1mmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0。
将第二透析袋移至500ml溶解缓冲液，4℃透析24-28h，得到复性蛋白溶液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液。
优选的，上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法中，步骤(4.1)中复性蛋白溶液以10ml/h的流速过金属镍螯合柱；
优选的，上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法中，步骤(4.2)的用MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20ml/h。
优选的，上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法中，步骤(4.3)中以10ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，流速为10ml/h，然后静置2h。
优选的，上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法中，步骤(4.4)的流速均为15ml/h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、突变α-乳清蛋白表达载体表达得到的突变HLA(mu-HLA)可形成类似Apo-HLA的结构，直接与油酸结合可形成HAMLET，从而建立一个快速、规模化的HAMLET制备方法；
2、本发明制备出的HAMLET比native-HLA制备的HAMLET(native-HAM)肿瘤细胞杀伤活性更强；
3、本发明制备出的HAMLET可结合更多的OA从而增强其活性。
附图说明
图1为mu-HLA与native-HLA的核苷酸序列比对结果；
图2为mu-HLA与native-HLA的氨基酸序列比对结果；
图3为native-HLA和mu-HLA空间结构的比较分析；
图4为mu-HAM与native-HAM的活性分析；
图5为mu-HAM与native-HAM的肿瘤细胞杀伤活性分析；
图6为不同浓度的mu-HAM和Native-HAM中游离脂肪酸的浓度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体，所述突变α-乳清蛋白表达载体的碱基序列SEQ NO.1所示。
本发明还提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在pET30a质粒中插入人源α-乳清蛋白(HLA)的基因片段，构建出pET30a-HLA质粒，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示，
所述pET30a-HLA质粒具体按照以下步骤构建：
步骤1.1，利用Trizol法提取MCF-7乳腺癌细胞(中国协和医科大学细胞中心)的总RNA，总RNA经反转录后获得MCF-7细胞的cDNA文库。
步骤1.2，以MCF-7细胞的cDNA文库为模板，PCR扩增，获得用于编码人源α-乳清蛋白成熟肽链的核苷酸序列，然后经Nde I和Xhol I双酶切得到人源α-乳清蛋白的基因片段，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示，PCR扩增的引物包括：
F：5’-GGGAATTCcatatgAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTG-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
R：5’-CCGctcgagCAACTTCTCACAAAGCCACTGTTCC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
其中，F和R中的小写字母表示的序列为酶切位点。
步骤1.3，以Nde I和Xhol I双酶切pET30a质粒(购自EMD Biosciences(Novagen))，并将如SEQ ID NO.2所示的人源α-乳清蛋白的基因片段连入经NdeI和XholI双酶切pET30a质粒中，得到pET30a-HLA质粒。该pET30a-HLA质粒含有His融合C端标签，经双酶切鉴定和DNA测序分析证实其序列完全正确。
步骤2，扩增pET30a-HLA质粒，具体包括以下步骤：
步骤2.1，无菌状态下取50μL大肠杆菌感受态细胞DH5α于1.5ml Ep管中，加入1μl的pET30a-HLA质粒，后于冰上放置30min。
步骤2.2，将Ep管置于42℃水浴90s，对Ep管中的溶液进行热刺激。
步骤2.3，迅速将Ep管转移到冰上冷却3-4min。
步骤2.4，向Ep管中加入400μl的LB液体培养基，37℃摇床培养1h，得到复苏菌液，该LB液体培养基中不含卡那霉素。
步骤2.5，制备含有卡那霉素的LB培养基平板，其中LB培养基平板中卡那霉素的浓度为100mg/ml。
步骤2.6，取100μl步骤2.4的复苏菌液转移到步骤2.5的LB培养基平板上，并铺平复苏菌液，于37℃培养12-16h，直至长出单菌落，需要说明的是，为了防止复苏菌液倒流，保证微生物最佳的生长状态，应当待液体吸收后，倒置平皿，然后在于37℃培养。
步骤2.7，无菌挑起2个单菌落于5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养14h，得到含有pET30a-HLA质粒的菌液，其中LB液体培养基中卡那霉素的浓度为100mg/ml。
步骤2.8，将含有pET30a-HLA质粒的菌液用质粒提取试剂盒(OMEGA，plasmid MiniKit I，D6943-01)进行抽提，具体方法见试剂盒说明书，得到扩增后的pET30a-HLA表达载体。
需要说明的是，步骤2主要是为了富集pET30a-HLA质粒，以便于pET30a-HLA质粒的突变，是制备方法的进一步优化，缺少该步骤仍可以制备出突变α-乳清蛋白表达载体。
步骤3，pET30a-HLA质粒的突变
步骤3.1，设计用于制备pET30a-HLA表达载体的引物Mu-F1(如SEQ ID NO.5所示)和Mu-R1(如SEQ ID NO.6所示)，并分别对引物Mu-F1和Mu-R1的5’端进行磷酸化修饰，如表1所示，上述引物Mu-F1和Mu-R1均由宝生物(大连)有限公司合成。
表1 PCR引物
步骤3.2，采用步骤3.1的引物Mu-F1和Mu-R1，利用点突变试剂盒(ThermoScientific Phusion Site-Directed Mutagenesis kit，F-541)将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT(异亮氨酸)、CAG(谷氨酰胺)、TCA(丝氨酸)、AGG(精氨酸)和AAC(天冬酰胺)，得到突变后的PCR产物，具体点突变实验按照点突变试剂盒(Thermo Scientific Phusion Site-DirectedMutagenesis kit，F-541)说明书的步骤进行，具体点突变的PCR反应体系如表2所示和点突变的PCR反应条件如表3所示。
引物Mu-F1和Mu-R1所起的作用是将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入异亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸和天冬酰胺。
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应程序
预变性 循环条件 循环数 延伸 保存
98℃，30sec 98℃，10sec；72℃，30sec；72℃，30sec 25 72℃，10min 4℃
步骤3.3，突变后的PCR产物的检测和回收
取20μl步骤3.2突变后的PCR产物，加3μl TaKaRa DNA上样缓冲液，混匀后点样于用0.5×TBE缓冲液制备的1％琼脂糖凝胶(内含EB)，同时点3μl标准分子量作分子量参照。以5V/cm电压电泳，60min后，取出凝胶，在紫外灯下观察扩增效果。
琼脂糖凝胶中切取含有目的PCR产物的凝胶块，用AxyPrep DNA Gel Extractionkit(03213KE1)回收突变后的PCR产物。
步骤3.4，突变后的PCR产物自身连接反应
将突变后的PCR产物在25℃进行自身连接反应5min，得到连接产物，该连接产物即为突变α-乳清蛋白表达载体。其中连接反应体系如表4所示。
表4 连接反应体系
下面提供一种上述突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)，将所述突变α-乳清蛋白表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21中，进行突变α-乳清蛋白的表达，并收集含有突变α-乳清蛋白的BL21菌体沉淀。
步骤(1.1)，将突变pET30a-HLA表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21中，得到转化菌。
步骤(1.2)，接种转化菌于10ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养10h，其中LB液体培养基中卡那霉素的浓度为10μg/ml，得到培养物。
步骤(1.3)，转接10ml培养物于1L含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震摇培养至OD600＝0.6，培养时间3-4h。
步骤(1.4)，向步骤(1.3)的培养液中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，并使培养液中IPTG的最终浓度为0.2mol/L，于37℃继续培养3h。
步骤(1.5)，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，得到BL21菌体沉淀，该BL21菌体沉淀中含有突变α-乳清蛋白。
步骤(2)，提取BL21菌体沉淀中的突变α-乳清蛋白
步骤(2.1)，加30ml 1×PBS缓冲液重悬BL21菌体沉淀，移入100ml烧杯中，放在冰上30min，超声破菌2-4h，直至液体清亮，于4℃，16000g离心30min，收集菌体碎片沉淀，其中超声破菌的条件为：超声功率350W，每次超声时间为6s，且相邻两次超声间隔时间为9s，超声破菌的总时间为2-4h。
步骤(2.2)，菌体碎片沉淀用20ml洗涤缓冲液洗涤，洗涤3次，每次洗涤后，于4℃，12000g离心30min，收集沉淀，得到细胞碎片，其中每升洗涤缓冲液由以下组分制成：20mmol的Tris、1mmol的EDTA和10ml的Triton X-100，余量为去离子水，pH为8.0。需要说明的是，制备HAMLET过程中，也可以省略步骤(2.2)。
步骤(2.3)，用10ml GuMCAC-0缓冲液重悬细胞碎片，并使细胞碎片完全溶解，室温放置2h，然后于4℃，16000g离心30min，收集上清，得到含有突变α-乳清蛋白的溶液。
其中，每升GuMCAC-0缓冲液由以下组分制成：20mmol的Tris-HCl，0.5mol的NaCl，6mol的盐酸胍，100ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至7.9。
步骤(2.4)，将含有突变α-乳清蛋白的溶液进行突变α-乳清蛋白复性，包括以下步骤：
步骤(2.4.1)，将含有突变α-乳清蛋白的溶液加入第二透析袋中，其中第二透析袋的截留分子量为3KD，然后将第二透析袋置于4M复性缓冲液中，室温透析24h，期间1000rpm磁力搅拌4M复性缓冲液，然后倒出1/2体积的4M复性缓冲液，滴加入不含盐酸胍复性缓冲液，继续室温透析24-28h，其中，不含盐酸胍复性缓冲液与剩余4M复性缓冲液的体积比例为1∶1；
每升4M复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，1mmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，4mol盐酸胍，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0。
每升不含盐酸胍复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，1mmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0。
步骤(2.4.2)，将第二透析袋移至500ml溶解缓冲液，4℃透析24-28h，得到复性蛋白溶液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液。
步骤(3)，HAMLET的制备
步骤(3.1)，将复性蛋白溶液以10ml/h的流速过金属镍螯合柱，所述金属镍螯合柱的制备方法如下：准备一根1.5×20cm(20ml biobad)Ni-NTA柱，加入2.5ml金属镍螯合琼脂糖凝胶，让液体刚好流至柱床的顶部，并依次用下列液体洗柱：相当于3倍柱床体积的去离子水(10ml)；相当于3倍柱床体积的MCAC-0(10ml)；需要说明的是，将复性蛋白溶液以10-15ml/h的流速过金属镍螯合柱。
步骤(3.2)，用10ml MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20ml/h。
步骤(3.3)，以10ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，并且流速为10ml/h，静置2h(优选的静置时间为2h)，用10ml MCAC-0缓冲液洗金属镍螯合柱。
其中，每升油酸溶液按以下方法配制：将30ml的油酸溶解于50ml的乙醇中，再用20mmol/L的Tris-HCl溶液定容至1000ml，最后用5mol/L NaOH溶液调至pH＝8.0，涡旋混匀。
步骤(3.4)，分段洗脱：分别取10ml下列缓冲液，并依次采用下列缓冲液洗金属镍螯合柱，包括：MCAC-20，MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，分别收集MCAC-100的冲洗液和MCAC-200的冲洗液，且流速均为15ml/h。
每升MCAC-0由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8。
每升MCAC-500由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，0.5mol的咪唑，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8。
MCAC-200由MCAC-0和MCAC-500按3∶2的体积比例混合而成；MCAC-100由MCAC-0和MCAC-200按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-80由MCAC-0和MCAC-100按1∶4的体积比例混合而成；MCAC-60由MCAC-0和MCAC-80按3∶4的体积比例混合而成；MCAC-40由MCAC-0和MCAC-80按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-20由MCAC-0和MCAC-40按1∶1的体积比例混合而成。
步骤(3.5)，将MCAC-100的冲洗液或者MCAC-200的冲洗液加入第一透析袋中，其中第一透析袋的截留分子量为3KD，然后将第一透析袋置于500ml的溶解缓冲液中，4℃透析24h，得到HAMLET透析液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液。
需要说明的是，任意选取MCAC-100的冲洗液或者MCAC-200的冲洗液都可以用于制备HAMLET。
步骤(3.7)，将HAMLET透析液-30℃真空冷冻干燥，得到HAMLET。
需要说明的是，本发明中提及的浓HCl均为市售的浓HCl。
HLA与油酸是可以非共价结合的，但是要形成有活性的HAMLET，需要将HLA形成熔球态，即通过需要EDTA或加热等方法去除Ca2+，从而形成Apo-HLA，Apo-HLA再与油酸结合可形成HAMLET。本发明中的突变HLA由于Ca2+结合域的改变，其可直接与油酸结合形成有活性HAMLET。具体表现为：
1、突变α-乳清蛋白表达载体表达得到的突变α-乳清蛋白(mu-HLA)可形成类似Apo-HLA的结构，直接与油酸结合可形成HAMLET。
为了探讨mu-HLA和人源α-乳清蛋白的基因片段(native-HLA)的差异，对mu-HLA与native-HLA的核苷酸序列和氨基酸序列对比，结果分别如图1和图2所示，native-HLA的第73位氨基酸发生了变化，且第71和72位氨基酸之间增加了五个氨基酸序列，形成了mu-HLA。
通过ANS结合实验分析它们的结构：将100μl浓度为0.2mg/ml样品与超过50倍摩尔浓度的疏水染料ANS混合，在37℃避光结合反应1h。与蛋白结合后的ANS可在365nm下被荧光激发，其在400-600nm区间的发射光谱由Spectra Max M2分光光度计记录，并且通过SoftMax 5.2软件处理绘制光谱曲线，结果如图3所示。
图3结果显示mu-HLA比native-HLA的ANS结合活性显著增加，使ANS最大发射波长及其峰值与apo-HLA相似，表明mu-HLA与mu-HLA相比结构更为松散，有类似apo-HLA的结构，其可以暴露出更多的疏水区域，与OA直接结合形成HAMLET。
2、本发明制备出的HAMLET(mu-HAM)比native-HLA制备的HAMLET(native-HAM)肿瘤细胞杀伤活性更强
U87MG神经胶质瘤细胞和小鼠原代神经胶质细胞(PAM)经胰酶消化后，以105个/孔接种于96孔板中，经5％CO2，37℃过夜培养至细胞贴壁，更换无血清的DMEM培养基，孵育30min，分别将1mg/ml mu-HLA、1mg/ml native-HLA、0.2μg/ml OA、0.2mg/ml native-HAM、0.2mg/ml mu-HAM或对照试剂加入各组样品并混匀。1h后加入FBS至终浓度为10％。继续培养24h，加入MTS试剂，于37℃孵育4h，溶解并稀释样本，在波长490nm下检测光度吸收值。
U87MG神经胶质瘤细胞经200μg/ml mu-HAM和200μg/ml native-HAM作用，通过MTS实验检测mu-HAM对U87MG细胞杀伤作用，结果参见图4。结果显示经mu-HAM作用的U87MG细胞的存活率(25％)显著低于mu-HLA，native-HLA以及OA处理组(80-90％)的存活率，同时也显著低于native-HAM作用后的细胞存活率(45％)，表明用mu-HLA制备的mu-HAM比native-HAM的活性强。
同时，由图5可以看出，不同浓度的mu-HAM和native-HAM对U87MG神经胶质瘤细胞的杀伤作用呈现出剂量依赖性(图5中成下降趋势的两条线)，而对小鼠神经胶质原代细胞无明显细胞毒性(图5中变化趋势接近水平的两条线)，表明用mu-HLA制备的mu-HAM和native-HAM具有肿瘤选择性杀伤活性，而mu-HAM在50、100、200、300μg/ml浓度下细胞毒性显著高于native-HAM。
3、本发明制备出的HAMLET可结合更多的OA从而增强其活性
HAMLET的生物学活性与其OA的结合量有密切关系。为了检测蛋白结合的OA含量，100℃加热10min降解蛋白，冷却至室温后，用1ml-20℃冷乙醇沉淀蛋白质。离心后，上清液中加入稀释333倍的20mM Tris-HCl溶液。根据人FFA酶联免疫吸附试剂盒的方法，对不同浓度mu-HAM和Native-HAM进行了检测分析，结果如图6所示。结果显示不同浓度中mu-HAM比Native-HAM的游离脂肪酸浓度高，表明其结合了更多的OA，即本发明的mu-HLA与OA结合率较高，可以增强HAMLET的生物活性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种突变α-乳清蛋白表达载体，其特征在于，所述突变α-乳清蛋白表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种突变α-乳清蛋白表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在pET30a质粒中插入人源α-乳清蛋白的基因片段，构建出pET30a-HLA质粒，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示；
步骤2，pET30a-HLA质粒的突变
步骤2.1，设计用于制备pET30a-HLA表达载体的引物Mu-F1和Mu-R1，并分别对引物Mu-F1和Mu-R1的5’端进行磷酸化修饰；
Mu-F1的序列为：
5’-TCAGTCAAGGAACATCGCTGACATCTCCTGTGAC-3’；
Mu-R1的序列为：
5’-ATGTTCCTTGACTGAGGGACCTGGCTGCTCTTGC-3’；
步骤2.2，采用步骤2.1的引物Mu-F1和Mu-R1，并利用点突变试剂盒将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT、CAG、TCA、AGG和AAC，得到突变后的PCR产物；
步骤2.3，回收突变后的PCR产物，并将突变后的PCR产物进行自身连接反应，回收得到突变α-乳清蛋白表达载体。
3.根据权利要求1所述的突变α-乳清蛋白表达载体在制备HAMLET中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，将所述突变α-乳清蛋白表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21中，进行突变α-乳清蛋白的表达，并收集含有突变α-乳清蛋白的BL21菌体沉淀；
步骤(2)，加1×PBS缓冲液重悬BL21菌体沉淀，移入容器中，放在冰上30min，超声破菌直至液体清亮，离心，收集菌体碎片沉淀；
步骤(3)，用GuMCAC-0缓冲液重悬菌体碎片沉淀，室温放置2-4h，然后于4℃，16000-18000g离心30min，收集上清，得到含有突变α-乳清蛋白的溶液，然后进行突变α-乳清蛋白复性，得到复性蛋白溶液；
每升GuMCAC-0缓冲液由以下组分制成：20mmol的Tris-HCl，0.5mol的NaCl，6mol的盐酸胍，100ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至7.9；
步骤(4)，HAMLET的制备
步骤(4.1)，将复性蛋白溶液以10-15ml/h的流速过金属镍螯合柱；
步骤(4.2)，用MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20-30ml/h；
步骤(4.3)，以10-15ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，流速为10-20ml/h，然后静置2-4h，最后用10ml的MCAC-0冲洗金属镍螯合柱；
步骤(4.4)，分段洗脱：分别取10ml下列缓冲液，并依次采用下列缓冲液洗金属镍螯合柱：MCAC-20，MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，且流速均为10-20ml/h，并收集MCAC-100的冲洗液和MCAC-200的冲洗液；
其中，每升MCAC-0由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；
每升MCAC-500由以下组分制成：8mmol的Na2HPO4，137mmol的NaCl，2mmol的KH2PO4，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，0.5mol的咪唑，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；
MCAC-200由MCAC-0和MCAC-500按3∶2的体积比例混合而成；MCAC-100由MCAC-0和MCAC-200按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-80由MCAC-0和MCAC-100按1∶4的体积比例混合而成；MCAC-60由MCAC-0和MCAC-80按3∶4的体积比例混合而成；MCAC-40由MCAC-0和MCAC-80按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-20由MCAC-0和MCAC-40按1∶1的体积比例混合而成；
步骤(4.5)，将MCAC-100的冲洗液或者MCAC-200的冲洗液加入第一透析袋中，然后将第一透析袋置于溶解缓冲液中，4℃透析24-28h，得到HAMLET透析液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液；
步骤(4.6)，将HAMLET透析液真空冷冻干燥，得到HAMLET。
5.根据权利要求4所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，所述突变α-乳清蛋白复性，具体包括以下步骤：
将含有突变α-乳清蛋白的溶液加入第二透析袋中，然后将透析袋置于4M复性缓冲液中，室温透析24-28h，期间1000rpm磁力搅拌4M复性缓冲液，然后倒出1/2体积的4M复性缓冲液，滴加入不含盐酸胍复性缓冲液，继续室温透析24-28h；
其中，不含盐酸胍复性缓冲液与剩余4M复性缓冲液的体积比例为1∶1；
每升4M复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，1mmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，4mol盐酸胍，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0；
每升不含盐酸胍复性缓冲液由以下组分制成：10mmol的Tris-HCl，lmmol的CaCl2，100mmol的KCl，10mmol的还原型谷胱甘肽，1mmol的氧化型谷胱甘肽，200ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至8.0；
将第二透析袋移至500ml溶解缓冲液，4℃透析24-28h，得到复性蛋白溶液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液。
6.根据权利要求4所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，步骤(4.1)中复性蛋白溶液以10ml/h的流速过金属镍螯合柱。
7.根据权利要求4所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，步骤(4.2)的用MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20ml/h。
8.根据权利要求4所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，步骤(4.3)中以10ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，流速为10ml/h，然后静置2h。
9.根据权利要求4所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，步骤(4.4)的流速均为15ml/h。
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