CN106636076A - 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 - Google Patents
一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106636076A CN106636076A CN201510708704.9A CN201510708704A CN106636076A CN 106636076 A CN106636076 A CN 106636076A CN 201510708704 A CN201510708704 A CN 201510708704A CN 106636076 A CN106636076 A CN 106636076A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polymerase
- nucleic acid
- acid molecule
- stranded nucleic
- stranded
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。所述单链核酸分子，包括茎环结构区和单链区；所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；所述第一配对区和第二配对区互补配对；所述单链环区为（dM）a，M为A、T、C、G或U，a为正整数；所述单链区为（dN）b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C、G或U，b为正整数。本发明还提供了基于上述单链核酸分子的聚合酶活性测定方法及试剂盒，可通过荧光检测的方法实现对酶促反应的实时检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，步骤更为简单，且提高了聚合酶活性检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。
背景技术
聚合酶作为一种重要的工具酶，广泛应用于基因测序、载体制备及基因克隆等一系列重要的分子生物学技术之中。目前，市场上常见的DNA聚合酶活性单位定义如下：以浓度为0.75 mM的被激活的小牛胸腺DNA为模板，在反应条件为72℃，1×反应缓冲液（包含200 mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM MgSO4、100 mM KCl、100 mM (NH4)2SO4、1% Triton X-100、1 mg/mL
nuclease-free BSA），0.4 MBq/mL [3H]-dTTP下反应30 min，能催化10 nmol的dNTP聚合生成多核苷酸片段的酶量为1单位酶活，即1U。相应的，市场上常见的聚合酶活性测定方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳。但是，因为同位素存在辐射，对人体有害，在使用过程中对实验室的要求很高，实验过程中的所有试剂、耗材等均需专门处理，否则会污染环境。一般实验室、公司和研究机构均不具备进行同位素标记法实验的条件。此外，这种方法是一种活性终点测定法，无法实时监测酶促反应进程，测定的可靠性较差；测定的活性线性范围较窄，只有1个数量级，操作也比较复杂费时；基于该方法的试剂盒成本高，使用后需经特殊处理才能不污染环境。
因此需要一种不依赖于同位素标记的聚合酶活性测定方法及试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单链核酸分子以及基于该核酸分子的聚合酶活性测定方法及试剂盒，旨在解决现有技术中聚合酶活性测定对环境压力大，成本高的问题。
为了实现发明目的，本发明提供了一种单链核酸分子，包括茎环结构区和单链区；
所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；
所述第一配对区和第二配对区互补配对；
所述单链环区为（dM）a，M为A、T、C或G，a为正整数；
所述单链区为（dN）b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C或G，b为正整数。
优选的，所述（dN）b中含嘧啶的碱基占总碱基数的40%-60%。
优选的，所述单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b。
更优选的，所述单链区为（dT）b或（dC）b。
优选的，所述单链区环区为（dA）a、（dT）a、（dC）a、（dG）a或（U）a。
优选的，所述第一配对区在5-15bp之间。
优选的，所述a在3-20之间。
优选的，所述b在15-150之间。
优选的，所述单链核酸分子上含有淬灭基团。
优选的，所述淬灭基团位于第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
更优选的，所述淬灭基团位于第一配对区或第二配对区。
优选的，所述淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。
更优选的，所述淬灭基团为MGB或BHQ。
为了更好地实现发明目的，本发明提出一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
A、制备PCR反应体系，所述反应体系包括待测聚合酶、单链核酸分子、双链DNA染料、dNTP和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；
B、进行PCR反应，并通过荧光检测装置检测反应过程中的荧光强度；
所述单链核酸分子，包括茎环结构区和单链区；
所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；
所述第一配对区和第二配对区互补配对；
所述单链环区为（dM）a，M为A、T、C、G或U，a为正整数；
所述单链区为（dN）b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C、G或U，b为正整数。
优选的，所述（dN）b中含嘧啶的碱基占总碱基数的40%-60%。
优选的，所述单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b。
更优选的，所述单链区为（dT）b或（dC）b。
优选的，所述单链区环区为（dA）a、（dT）a、（dC）a、（dG）a或（U）a。
优选的，所述第一配对区在5-15bp之间。
优选的，所述a在3-20之间。
优选的，所述b在15-150之间。
优选的，所述单链核酸分子上含有淬灭基团。
优选的，所述淬灭基团位于第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
更优选的，所述淬灭基团位于第一配对区或第二配对区。
优选的，所述淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。
更优选的，所述淬灭基团为MGB或BHQ。
优选的，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。
更优选的，所述双链DNA染料为Eva Green。
优选的，所述待测聚合酶为Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶。
优选的，所述反应体系还包括所述待测聚合酶的抗体，所述待测聚合酶的抗体能够抑制所述待测聚合酶的低温聚合酶活性。
优选的，还包括以下步骤：
C、根据步骤B的结果获得荧光值对时间的双链核酸分子增长曲线，进而获得待测聚合酶的反应初速度，并以待测聚合酶的反应初速度来表示待测聚合酶的活性。
更优选的，还包括以下步骤:
D、配置一系列浓度的第一核酸分子，加入所述双链DNA染料，进而测定不同第一核酸分子浓度条件下对应的荧光强度，进而获得荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线；
E、根据荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线，将步骤C所得待测聚合酶的反应初速度，换算成按单位时间内生成的第一核酸分子的量表示的聚合酶活性；
所述步骤D与步骤A、B、C没有先后关系；
所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
更优选的，还包括以下步骤：
F、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至C，得标准聚合酶的反应初速度；
G、根据标准聚合酶和待测聚合酶反应初速度的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
更优选的，还包括以下步骤：
H、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至E，得标准聚合酶的聚合酶活性；
I、根据标准聚合酶和待测聚合酶的聚合酶活性的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
为了更好的实现本发明的目的，本发明提出一种聚合酶活性测定试剂盒，包括上述任一种单链核酸分子。
优选的，所述所述（dN）b中含嘧啶的碱基占总碱基数的40%-60%。
优选的，所述单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b。
更优选的，所述单链区为（dT）b或（dC）b。
优选的，所述单链区环区为（dA）a、（dT）a、（dC）a、（dG）a或（U）a。
优选的，所述第一配对区在5-15bp之间。
优选的，所述a在3-20之间。
优选的，所述b在15-150之间。
优选的，所述单链核酸分子上含有淬灭基团。
优选的，所述淬灭基团位于第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
更优选的，所述淬灭基团位于第一配对区或第二配对区。
优选的，所述淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。
更优选的，所述淬灭基团为MGB或BHQ。
优选的，还包括双链DNA染料、dNTP和适宜所述聚合酶发挥活性的缓冲液。
优选的，所述dNTP为dTTP、dATP、dGTP或dCTP。
优选的，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。
优选的，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶。
优选的，所述试剂盒还包括所述聚合酶的抗体，所述聚合酶的抗体能够抑制所述聚合酶的低温聚合酶活性。
优选的，还包括第一核酸分子，所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
更优选的，所述第一核酸分子的茎环结构区上含有淬灭基团。
由上可知，本发明独特设计的单链核酸分子，在聚合酶活性测定过程中既是模板又是引物，避免了因为单独添加引物量不当导致的聚合酶活性测定不准确的技术问题；同时，本发明的聚合酶活性测定方法和试剂盒采用荧光检测的方法实现了对酶促反应的实时检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，步骤更为简单，且提高了聚合酶活性检测的准确性。
附图说明
图1是本发明第一典型实施例中单链核酸分子的结构示意图。
图2是本发明第二典型实施例的原理图。
图3是本发明第一具体实施例的反应进程曲线图。
图4是本发明第二具体实施例的反应进程曲线图。
图5是本发明一具体实施例的反应进程曲线图。
图6是本发明第三具体实施例的反应进程曲线图。
图7是本发明第三具体实施例中对反应进程曲线的起始位点作切线后的图。
图8是本发明第三具体实施例的Taq DNA聚合酶使用浓度与初速度关系图。
图9是本发明第五具体实施例中的第一核酸分子浓度对荧光强度的标准曲线图。
图10是本发明第六具体实施例中不同双链DNA染料的反应进程曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一典型实施例，如图1所示，一种单链核酸分子，包括茎环结构区1和单链区2；
所述茎环结构区1位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区11、单链环区12和第二配对区13；
所述第一配对区11和第二配对区13完全互补配对；
所述单链环区12为（dM）a，M为A、T、C、G或U，a为正整数；即，单链环区的核苷酸为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸或尿嘧啶核糖核苷酸；
所述单链区2为（dN）b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C、G或U，b为正整数；即，单链区的核苷酸为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸或尿嘧啶核糖核苷酸。
在聚合酶活性测定过程（PCR扩增）中，因为要保证底物足够丰富，因此常常需要在反应体系中添加过量的模板和引物，尤其是引物，以保证每个模板在退火后均结合有引物，并能被聚合酶延伸；而引物的过量添加，既提高了成本，又会在采用荧光检测的方法测定聚合酶活性时，显著提高本底值，导致聚合酶活性测定不够准确。本实施例的单链核酸分子，在聚合酶活性测定过程中既是模板又是引物，既简化了实验步骤，又降低了实验成本，提高了聚合酶活性检测的准确性。
针对单链区的碱基的组成，本发明并无特殊限制，以下将通过数个较佳方案进行进一步的说明。
在本发明的第一实施例中，所述（dN）b中含嘧啶的碱基占总碱基数的40%-60%。本实施例中，单链区含嘧啶和嘌呤的碱基比例与自然界中大多数生物的核酸分子中的比例一致，通过本实施中的单链核酸分子测定的聚合酶活性更能反映聚合酶在大多数工作条件下的活性。
优选的，所述（dN）b中含嘧啶和嘌呤的碱基均匀分布。本方案能够进一步提高通过本实施中的单链核酸分子测定的聚合酶活性的真实性。
在本发明的第二实施例中，所述单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b。在应用至通过荧光检测的方法测定聚合酶活性的前提下，与第一实施例相比，第二实施例中的单链核酸分子能使酶促反应的线性更好，荧光值更高，不同酶浓度的区分度更好，准确性更高。
更优选的，所述单链区为（dT）b或（dC）b。在应用至通过荧光检测的方法测定聚合酶活性的前提下，与所述单链区为（dA）b或（dG）b的方案相比，本方案中的单链核酸分子能使酶促反应的线性更好，不同酶浓度的区分度更好，准确性更高。
针对单链区的长度，需要说明的是，本发明并无特殊限制，只要其能满足进行聚合酶活性测定所需的长度即可。当单链区的长度过短，例如在15bp以下时，聚合酶能够延伸的长度较短，可能导致活性测定不准确；而当单链区的长度过长时，所述单链核酸分子的合成成本较高。因此，当所述b在15-150之间时，能够同时避免上述两个问题。更优选的，所述b在20-100之间。
此外，优选的，所述单链区自身以及单链区之间不形成二级结构，这样可避免因为单链区自身或单链区之间形成二级结构，从而影响聚合酶活性的测定。
针对单链环区的碱基组成，需要说明的是，所述单链环区自身不能互补配对即可。
优选的，所述单链环区为（dA）a、（dT）a、（dC）a、（dG）a或（U）a。本方案中，单链环区为连续的寡聚核苷酸，不存在自身互不配对的问题，设计简单，易合成。
针对单链环区的碱基长度，需要说明的是，本发明并无特殊的限制。
优选的，所述单链环区的长度在3-20bp之间。本方案中，单链环区既不会影响第一配对区和第二配对区的互补配对，又不会因为单链环区的长度过长而增加设计难度。
更优选的，所述a在3-5之间；即单链环区的长度在3-5bp之间。本方案进一步缩短了所述单链分子的整体碱基数，可有效降低合成成本。
针对第一配对区和第二配对区组成的互补配对区，需要说明的是，第一配对区和第二配对区互补配对，使得第二配对区的3’端在聚合酶的作用下能够以单链区为模板进行延伸，从而使得本发明的单链核酸分子能够在聚合酶活性测定过程中既是模板又是引物，在简化实验步骤的同时降低了实验成本，还提高了聚合酶活性检测的准确性。
优选的，所述第一配对区的碱基数大于等于5bp。本方案同时保证了所述单链核酸分子茎环区的结构稳定性以及聚合酶在互补配对区的稳定结合。
更优选的，所述第一配对区在5-15bp之间。本方案避免了因为第一配对区、第二配对区长度过长导致的所述单链核酸分子合成难度大，合成成本高的技术问题。
更优选的，所述第一配对区在6-10bp之间。本方案与上一方案相比能够进一步减少所述单链核酸分子的整体碱基数，可有效降低合成成本。
需要说明的是，所述第一配对区和第二配对区优选完全互补配对；当然，第一配对区和第二配对区如果不是完全互补配对，也能用于聚合酶活性检测，只要不互补配对的区域不在第二配对区3’端的倒数三个碱基内；不过这种方案，会影响聚合酶与所述单链核酸分子的结合并降低聚合酶催化的延伸效率，降低聚合酶活性检测的准确性。
优选的，所述单链核酸分子上含有淬灭基团。所述淬灭基团能够淬灭双链DNA染料与核酸分子双链区结合后产生的荧光。
优选的，所述淬灭基团位于第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
本方案的单链核酸分子在进行聚合酶活性测定时，能够淬灭所述单链核酸分子的茎环结构区结合的双链DNA染料产生的荧光，降低本底值，从而提高聚合酶活性检测的准确性。
更优选的，所述淬灭基团位于第一配对区或第二配对区。
与上一方案相比，本方案的单链核酸分子在进行聚合酶活性测定时，能够进一步避免淬灭基团对结合在所述单链区形成的双链上的双链DNA染料产生的荧光的干扰，提高聚合酶活性检测的准确性。
优选的，所述淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ；更优选的，所述淬灭基团为MGB或BHQ。
MGB作为淬灭基团可以将Tm值提高10℃左右，这样就可以减少第一配对区、第二配对区的碱基数，进而减少整个单链核酸分子的碱基数，从而使其成本更为低廉；同时，MGB与TAMARA相比，MGB作为淬灭基团与DNA双链荧光染料的结合时，空间位置更接近，淬灭效果更好，本底更低，使得检测结果更为准确。
另外，因为BHQ本身不产生荧光，而TAMRA本身会产生荧光，所以淬灭基团BHQ比TAMRA效果要好，荧光背景低，检测结果更为准确。
本发明提出第二典型实施例，一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
A、制备PCR反应体系，所述反应体系包括待测聚合酶、单链核酸分子、双链DNA染料、dNTP和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；
B、进行PCR反应，并通过荧光检测装置检测反应过程中的荧光强度；
所述单链核酸分子为第一典型实施例中的任一种单链核酸分子。
如图2所示，本方案利用第一典型实施例中的单链核酸分子同时作为PCR反应中的模板和引物，在待测聚合酶的作用下发生延伸反应，形成双链结构，然后双链DNA染料结合至双链结构发出荧光，并被荧光检测装置检测到，通过记录反应过程中荧光强度的变化值，即可根据荧光强度的变化获得待测聚合酶的活性。
需要说明的是，本方案是一种不依赖于同位素标记的聚合酶活性测定方法，能够实现对酶促反应的实时检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，步骤也更为简单，同时还解决了因为单独添加引物的量不当而导致的聚合酶活性测定不准确的技术问题，提高了聚合酶活性检测的准确性。
步骤A中所述待测聚合酶，既可以DNA聚合酶也可以逆转录酶；也可以是依赖DNA的聚合酶或依赖RNA的聚合酶；也可以是嗜热DNA聚合酶或嗜温DNA聚合酶；还可以是α、β、γ、δ或ε家族DNA聚合酶。本发明的方案尤其适用于Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和phi29 DNA聚合酶的聚合酶活性检测。
当所述待测聚合酶为逆转录酶时，将所述单链核酸分子的单链区中的T均用U代替即可。
对于步骤A中的双链DNA染料，需要说明的是，其只要对双链核酸分子具有特异性结合能力，并在与双链DNA分子结合之后能够产生荧光即可。
优选的，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。本方案中，Eva Green、Sybr Green I和PicoGreen均是市场上最为常见的双链DNA染料，有利于本方案的推广应用。
目前市面上常见的聚合酶大都是嗜热聚合酶，最适反应温度一般都在72℃，但是这些聚合酶在室温及其以下温度往往都还会有聚合酶活性，为了避免聚合酶低温聚合酶活性对聚合酶活性测定的影响，常用的方法是在冰上配制PCR反应液，通过低温来限制聚合酶冷启动活性，并在配制完成后立即将其置于已经预热好的PCR仪中进行PCR反应，但是这种方法并不能完全抑制聚合酶冷启动活性。为了彻底解决聚合酶的低温聚合酶活性对聚合酶活性测定的影响，本发明提出一实施方案，步骤A所述反应体系还包括所述待测聚合酶的抗体，所述待测聚合酶的抗体能够抑制所述待测聚合酶的低温聚合酶活性。例如，当待测聚合酶为Taq DNA聚合酶时，所述反应体系中还加入了Taq DNA聚合酶抗体，用于抑制Taq DNA聚合酶的低温聚合酶活性，使得Taq DNA聚合酶的聚合酶活性检测结果更为准确。
对于聚合酶的活性，需要说明的是，其可通过多种方式来表示。在本发明的第三实施例中，所述方法还包括以下步骤：
C、根据步骤B的结果获得荧光值对时间的双链核酸分子增长曲线，进而获得待测聚合酶的反应初速度，并以待测聚合酶的反应初速度来表示待测聚合酶的活性。
需要说明的是，所述反应初速度是指在酶促反应的最初阶段底物转化为产物的速度，最初阶段是指底物消耗量在5%以内的反应阶段。根据实际检测过程中的情况，所述最初反应阶段可进行相应调整，例如，最初阶段是指酶促反应发生的那一瞬间，或酶促反应发生的第1s，或对产物进行检测时，第一次记录产物的相应信号时。因此，所述反应初速度的定义可进行相应调整，为直接或间接反映底物消耗量在5%以内的反应阶段底物转换为产物的速度。
在第三实施例的基础上，本发明提出第四实施例，所述方法还包括以下步骤：
D、配置一系列浓度的第一核酸分子，加入所述双链DNA染料，进而测定不同第一核酸分子浓度条件下对应的荧光强度，进而获得荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线；
E、根据荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线，将步骤C所得待测聚合酶的反应初速度，换算成按单位时间内生成的第一核酸分子的量表示的聚合酶活性；
所述步骤D与步骤A、B、C没有先后关系；
所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
需要说明的是，本方案相对上一方案，其对聚合酶活性的表述更为直观；所述第一核酸分子可通过所述单链核酸分子自我复制完成后回收获得，也可以直接合成，还可以通过纯化与所述单链核酸分子的单链区互补配对的单链核酸分子与所述单链核酸分子连接产物获得。优选通过所述单链核酸分子自我复制完成后回收获得，本方案可以在一定程度上克服因为核酸分子合成过程中长度的限制，而获得长度较长的第一核酸分子，本方法也较通过连接反应获得的方法更为简单，易得。
另外，所述第一核酸分子浓度可为质量体积比，也可为摩尔数体积比；相应的所述第一核酸分子的量可为质量，也可为摩尔数。
此外，所示第一核酸分子还可以是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物的双链区具有相同序列的双链核酸分子，本方案的第一核酸分子可直接通过化学合成的方式合成两条单链核酸分子，然后退火而得，该方法较上述方案的回收方案更为简单；且合成的两条单链核酸分子的链长度相对较短，合成费用低，易操作，能降低本方案的试剂成本。
在第三实施例的基础上，本发明提出第五实施例，所述方法还包括以下步骤：
F、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至C，得标准聚合酶的反应初速度；
G、根据标准聚合酶和待测聚合酶反应初速度的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
本方案中，所述标准聚合酶的活性是已知；优选的，所述标准聚合酶的活性是通过背景技术中所述的方法进行的聚合酶活性测定，其活性单位为U。更优选的，所述标准聚合酶为市场上大公司生成销售的聚合酶，且与待测聚合酶属于相同类型的聚合酶。例如：均为Pfu DNA聚合酶、均为Taq DNA聚合酶、均为Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、均为Vent DNA聚合酶、均为MMLV逆转录酶或均为phi 29 DNA聚合酶。本方案通过F、G步骤，可将待测聚合酶的活性单位换算成U，这对广大的使用者来说，更为方便和直观，有利于与市面上的其他聚合酶的活性进行比较。
在第四实施例的基础上，本发明提出第六实施例，所述方法还包括以下步骤：
H、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至E，得标准聚合酶的聚合酶活性；
I、根据标准聚合酶和待测聚合酶的聚合酶活性的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
本实施例的方案与第五实施例一样，均是通过与标准聚合酶的已知聚合酶活性的比较，将待测聚合酶的活性单位换算成目前通行的活性单位定义，更为方便和直观，有利于与市面上的其他聚合酶的活性的比较。
本发明还提出了第三典型实施例，一种聚合酶活性测定试剂盒，包括第一典型实施例中的任一种单链核酸分子。
本实施例的试剂盒可用于不依赖于同位素标记的聚合酶活性测定方法，进而实现对酶促反应的实时检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，步骤也更为简单，同时还解决了因为单独添加引物的量不当而导致的聚合酶活性测定不准确的技术问题，提高了聚合酶活性检测的准确性。
基于第三典型实施例，本发明提出第七实施例，所述试剂盒还包括双链DNA染料、dNTP和适宜所述聚合酶发挥活性的缓冲液。
根据所述试剂盒中的所述单链核酸分子单链区的不同，所述dNTP可以有多种选择。所述dNTP可以是dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等摩尔数的混合液，本方案尤其适用于所述单链核酸分子为本发明第一实施例中的单链核酸分子。当所述单链核酸分子的单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b时，所述dNTP既可以是dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等摩尔数的混合液，也可以是相对应的dTTP、dATP、dGTP、dCTP或dATP，即所述dNTP与单链区的碱基互补配对。
此外，需要说明的是，所述双链DNA染料是对双链核酸分子具有特异性结合能力，并在与双链DNA分子结合之后能够产生荧光的染料，其不与单链核酸分子结合。
优选的，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。本方案中，Eva Green、Sybr Green I和PicoGreen均是市场上最为常见的双链DNA染料，有利于本方案的推广应用。
更优选的，所述双链DNA染料为Eva Green。
在第七实施例的基础上，本发明提出另一优选实施方案，所述试剂盒还包括所述聚合酶的抗体，所述聚合酶的抗体能够抑制所述聚合酶的低温聚合酶活性。本方案的试剂盒对聚合酶活性的检测结果更为准确。
在上述实施例的基础上，本发明还提出另一优选实施方案，所述试剂盒还包括适宜所述聚合酶发挥活性的缓冲液。本方案的易用性更好。
在上述实施例的基础上，本发明还提出另一优选实施方案，所述试剂盒还包括第一核酸分子，所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
需要说明的是，本方案直接提供了用于对比的第一核酸分子，易用性更好。
更优选的，所述第一核酸分子的茎环结构区上含有淬灭基团。所述淬灭基团能够淬灭双链DNA染料与核酸分子双链区结合后产生的荧光。
更优选的，所述淬灭基团位于第一核酸分子中包括的所述单链核酸分子的第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
本方案的第一核酸分子在进行聚合酶活性测定时，能够淬灭所述第一核酸分子的茎环结构区结合的双链DNA染料产生的荧光，降低本底值，从而提高聚合酶活性检测的准确性。
更优选的，所述淬灭基团位于第一配对区或第二配对区。
与上一方案相比，本方案的第一核酸分子在应用至聚合酶活性测定时，能够进一步避免淬灭基团对结合在所述第一核酸分子的双链区域上的双链DNA染料产生的荧光的干扰，提高聚合酶活性检测的准确性。
更优选的，所述淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。
更优选的，所述淬灭基团为MGB或BHQ。
以下将通过具体实施例来进一步说明本发明进行进一步的详细说明。
在第一具体实施例中，本发明的发明人设计了H60-1（SEQ ID NO:1）、H60-2（SEQ ID NO:2）、H60-3（SEQ ID NO:3）、H60-4（SEQ ID NO:4）、T60-1（SEQ ID NO:5）、A60-1（SEQ ID NO:6）、G60-1（SEQ ID NO:7）和C60-1（SEQ ID NO:8）等8种单链核酸分子，并交上海生工合成。
以Promega Pfu DNA聚合酶（M7741）作为待检测聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液稀释成60mU/μL、30mU/μL、15mU/μL、7.5mU/μL、3.75mU/μL、1.875mU/μL、0.9375mU/μL等7个浓度梯度。
按2×Pfu反应缓冲液，10μL；Pfu DNA 聚合酶5μL；单链核酸分子（10μM），1μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH2O，3μL；合计20μL；分别配置上述9种单链核酸分子对不同Pfu DNA聚合酶浓度的反应体系，以ddH2O为空白对照。其中，2×Pfu反应缓冲液为pH 9.0，含100mM Tris-HCl、8mM MgSO4、0.06%Tween 20、0.6% BSA、0.4mM dNTP的水溶液。
将配制好的上述反应体系放在stepone plus荧光PCR仪的上，75℃保温5min，每10s收集一次荧光信号。将收集到的荧光数据绘制反应进程曲线，结果如图3所示。其中，图3A-H，依次为H60-1、H60-2、H60-3、H60-4、T60-1、A60-1、G60-1和C60-1的反应进程曲线图。所述反应进程曲线为时间荧光强度曲线，即荧光值（Rn）对时间的双链核酸分子增长曲线。
需要说明的是，本发明的方法在利用所述单链核酸分子溶液配制反应体系之前，需先将所述单链核酸分子溶液高温变性，然后退火才能使用。在第一具体实施例中，具体为于95℃变性5min，然后冰上退火。
由图3可知，上述8种单链核酸分子中，后4种相对前4种对不同聚合酶浓度（用量）的区分度更好，荧光值更高，酶促反应的线性也更好；因此，基于后4种单链核酸分子进行的聚合酶活性检测准确性也更高。
另外，需要说明的是，上述后四种单链核酸分子中，单链区为（dT）b或（dC）b的较另外2种对不同Pfu DNA聚合酶浓度（用量）的区分度更好，酶促反应线性区的线性也更好；因此，基于单链区为（dT）b或（dC）b的单链核酸分子进行的聚合酶活性检测准确性比另外2种更高。
本发明还进一步将上述具体实施例中的Pfu DNA聚合酶和2×Pfu反应缓冲液换成Taq DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶以及相应的适宜Taq DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶发挥活性的缓冲液；所得实验结果与上述第一具体实施例类似；即DNA聚合酶可采用荧光检测的方法实现其聚合酶活性的检测。
在第二具体实施例中，采用H60-5（SEQ ID NO:9）、T15-1（SEQ ID NO:10）、T30-1（SEQ ID NO:11）、T60-2（SEQ ID NO:12）、T120-1（SEQ ID NO:13）、T150-1（SEQ ID NO:14）作为聚合酶活性检测方法中的模板和引物，重复第一具体实施例的操作，结果如图4所示。其中，图4A-F，依次为H60-5、T15-1、T30-1、T60-2、T120-1、T150-1的反应进程曲线图。
由图4可知，随着单链核酸分子中单链区长度的增长，在相同聚合酶浓度的前提下，酶促反应的线性范围变大，线性更好；另外，虽然T15-1、T30-1的单链区比H60-1短了不少，但是与H60-1相比，其在聚合酶活性检测实验中线性更好，荧光值更高，不同酶浓度的区分度更好，准确性更高。与T15-1、T30-1类似的单链核酸分子，例如：单链区为（dC）b、（dA）b、（dG）b或（U）b，b小于等于60的单链核酸分子，在用于聚合酶活性检测时，其结果与图4中类似，在此不再另行详细说明。以上结果说明当单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b时，即使单链区的长度较短，与本发明中的其他单链核酸分子相比，其在聚合酶活性检测实验中线性更好，荧光值更高，不同酶浓度的区分度更好，准确性更高。
此外，本发明还分别以：1）T20-1（SEQ ID NO:15）、T40-1（SEQ ID NO:16）、T60-3（SEQ ID NO:17）、T80-1（SEQ ID NO:18）、T100-1（SEQ ID NO:19）；2）C25-1（SEQ ID NO:20）、C50-1（SEQ ID NO:21）、C75-1（SEQ ID NO:22）、C100-1（SEQ ID NO:23）、C125-1（SEQ ID NO:24）等两组单链核酸分子重复了上述单链区长度对聚合酶活性测定的影响实验，部分结果如图5所示。其中，图5A-E，依次为T20-1、T40-1、T60-3、T80-1、T100-1的反应进程曲线图。由图5可知，所得结果与上述实验结论完全相符。
在第三具体实施例中，以H60-6（SEQ ID NO:25）为单链核酸分子，参见图6，以TaKaRa Taq DNA聚合酶作为待检测聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液稀释成500mU/μL、250mU/μL、125mU/μL、62.5mU/μL、31.25mU/μL、15.625mU/μL、7.8125mU/μL和4.90625mU/μL等8个浓度梯度，并以dd H2O为空白对照。
按2×Taq反应缓冲液，10μL；Taq DNA 聚合酶1μL；单链核酸分子（10μM），1μL；ddH2O，6μL；EvaGreen（20×），1μL；anti-taq抗体（500mU/μL），1μL；合计20μL分别配置上述单链核酸分子对不同Taq DNA聚合酶浓度的反应体系。其中，2×Taq反应缓冲液为pH 8.3，含100mM Tris-HCl、8mM MgCl2、0.06%Tween 20、0.3% BSA、0.4mM dNTP的水溶液。
将配制好的上述反应体系放在stepone plus荧光PCR仪的上，96℃变性20s；然后75℃保温5min，每10s收集一次荧光信号。将收集到的荧光数据绘制反应进程曲线，结果如图6所示。
需要说明的是，为了保证anti-taq抗体对Taq DNA聚合酶的低温聚合酶活性的抑制作用，在反应体系的配置过程中，优选先将anti-taq抗体、2×Taq反应缓冲液、单链核酸分子、ddH2O和EvaGreen（20×）等混匀，然后再加入Taq DNA 聚合酶。
对于简单的米氏酶（Michaelian Enzyme），初速度与酶浓度的线性关系前提条件是反应体系中底物浓度远大于酶浓度，在本例中，Taq DNA聚合酶的聚合反应实际上是dNTP和H60-6双底物的酶促反应，但dNTP浓度通常远远大于酶的浓度，因此需要研究的是H60-6与酶的浓度关系，本实验的反应体系中，底物H60-6与酶的最小摩尔比约为50:1，因此H60-6浓度也是远大于Taq DNA聚合酶浓度，这满足米氏方程的前提条件。
在图6中以曲线起始位点（10s处）作切线，如图7所示，记录斜率，结果如表1所示。
表1.酶用量和反应初速度（切线斜率）数据
根据表1的数据可绘制Taq DNA聚合酶使用浓度与初速度关系图，结果如图8所示，对图8中的曲线进行线性回归分析，R2=0.9984，说明在上述酶浓度区间内，酶浓度与初速度的线性关系良好，所测量的酶活性浓度准确性也较高，可用切线斜率来直接表示聚合酶活性。
在第三具体实施例的基础上，本发明提出第四具体实施例，同样以H60-6（SEQ ID NO:25）为单链核酸分子，以自制的Taq DNA聚合酶为待检测DNA聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液将待检测DNA聚合酶稀释40倍和80倍，各3个重复实验，然后参照第三具体实施例的方法进行检测，取平均值。结果如表2所示。
表2.酶用量和反应初速度（切线斜率）数据
将上表中的数据带入图8中的线性回归方程，可知待检测DNA聚合酶 1/40和待检测DNA聚合酶 1/80的酶浓度分别为188.01mU/μL、90.03 mU/μL；换算成原液活性浓度则分别为7.52mU/μL和7.20U/μL，平均值为7.36U/μL。
上述具体实施例是通过反应过程中检测到的荧光值绘制曲线，然后以曲线起始位点（10s处）作切线，记录斜率，以斜率表示聚合酶的反应初速度并作为聚合酶的活性，依赖于双链荧光染料与含双链结构的DNA分子结合后产生的荧光与含双链结构的DNA分子的量的线性关系。
为了更真实的反映反应过程中第一核酸分子的量与双链荧光染料之间的关系，本发明提出第五具体实施例。
本实施例中，按2×Pfu反应缓冲液，50μL；Promega Pfu DNA聚合酶（M7741），5μL；T100-1（SEQ ID NO：19）（10μM），5μL；ddH2O，40μL；合计100μL；配置反应体系。然后将配置好的反应体系置于PCR仪中，96℃变性20s；然后75℃保温20min，将PCR产物纯化回收获得T100-1自我复制完成后形成的产物。测定回收产物的浓度，并配置40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL和1.25ng/μL等6个浓度梯度的回收产物。
按2×Pfu反应缓冲液，10μL；回收产物，5μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH2O，4μL；合计20μL；分别配置上述6个浓度梯度的回收产物对应的反应体系。另外以ddH2O为阴性对照。将配制好的上述7个反应体系放在stepone plus荧光PCR仪的上，75℃保温5min，每10s收集一次荧光信号。将收集到的荧光数据对DNA量作荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线图，然后线性回归分析图中的曲线，结果如图9所示，R2=0.9991，说明在上述DNA浓度区间内，DNA浓度与荧光强度的线性关系良好，可根据聚合酶活性检测过程中荧光检测装置检测到的荧光强度，利用所得的线性方程计算相应的荧光强度对应的DNA质量。
需要说明的是，本具体实施例中所述第一核酸分子（回收产物）浓度采用的是质量体积比，可根据第一核酸分子的分子量换算成摩尔数体积比；然后重做标准曲线图，并进一步得线性方程，然后可根据聚合酶活性检测过程中荧光检测装置检测到的荧光强度，利用所得的线性方程计算相应的荧光强度对应的DNA的摩尔数。当然也可根据第一核酸分子的分子量，直接将上述荧光强度对应的DNA质量换算成荧光强度对应的DNA摩尔数。
另外，基于本具体实施例，可参考第四具体实施例，通过已知的标准聚合酶活性（单位为U，采用同位素标记方法获得），以及通过本实施例方法获得的标准聚合酶的反应初速度和待测聚合酶的反应初速度的比值，换算出以U为单位的待测聚合酶活性。
在本发明的第六具体实施例中，对Eva Green、Sybr Green、PicoGreen三种双链DNA染料在聚合酶活性检测过程中的效果进行比较。
以Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶（HYK，EN1001，5U/μL）为待检测聚合酶，利用含0.1%BSA、0.01%Tween 20的水溶液稀释成12.5mU/μL备用，T60-1（SEQ ID NO:5）作为模板和引物。
按2×Kenow反应缓冲液，10μL；T60-1（10μM），1μL；双链DNA染料（20×），1μL；ddH2O，3μL；合计15μL；分别配置上述3种双链DNA染料对Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶的反应体系。
其中，2×Kenow反应缓冲液为pH 8.8，含100mM Tris-HCl、8mM MgSO4、0.06%Tween 20、0.6% BSA、0.4mM dATP的水溶液。
将配制好的上述反应体系在95℃保温5min，然后立即放入冰上冷却；随后每个体系加入Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶（12.5mU/μL），5μL；将溶液充分混匀，在离心机上离心10s，立即放入ABI Step-One plus荧光PCR仪，37℃保温5min，每10s收集一次荧光信号。将收集到的荧光数据绘制反应进程曲线，结果如图10所示。其中，EG代表Eva Green；SG代表Sybr Green；PG代表PicoGreen。由图10可知，荧光强度最快达到峰值的是Eva Green，其次是Sybr Green，最后是PicoGreen；即，Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶的活性在Eva Green作为双链DNA染料的体系中最强。用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、phi 29 DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶等聚合酶替换第六具体实施例中的Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶，所得结果与第六具体实施例类似，荧光强度最快达到峰值的仍然是Eva Green，其次是Sybr Green，最后是PicoGreen；即，聚合酶的活性在Eva Green作为双链DNA染料的体系中最强。所述双链DNA染料优选Eva Green。
在本发明的第七实施例中，以MMLV逆转录酶（TaKaRa，639523，15U/μL）作为待检测聚合酶，U60-1（SEQ ID NO：26）作为模板和引物。
利用含0.1%BSA、0.01%Tween 20的水溶液将MMLV逆转录酶稀释200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍。
按5×First-Strand Buffer，4μL；MMLV逆转录酶，5μL；U60-1（10μM），1μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH2O，9μL；合计20μL；配置不同MMLV逆转录酶浓度的反应体系，以ddH2O为空白对照。
将配制好的上述反应体系放在stepone plus荧光PCR仪的上，42℃保温5min，每10s收集一次荧光信号。将收集到的荧光数据绘制反应进程曲线，然后以曲线起始位点（10s处）作切线，记录斜率；然后对斜率和对应的MMLV逆转录酶使用浓度作曲线，对曲线进行线性回归分析，R2=0.9991，说明在上述酶浓度区间内，酶浓度与初速度的线性关系良好，本方案可用于MMLV逆转录酶活性测定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 盛司潼
<120> 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt
acttatactc 60
ccgactttgt
cgg
73
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt
acttatactc 60
ccgatcatca tcatcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagatga
tgatgatcgg
110
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt
acttatactc 60
attgattgaa ggcggttcaa
tcaat
85
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt
acttatactc 60
aggcgtcccc acgcct
76
<210> 5
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
60
tgctcccgcg gccgatctgc tcggccgcgg
gagca
95
<210> 6
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
acggcgtttt cgccgt 76
<210> 7
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 60
aaccaggccg
cgtggtt
77
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60
atcgataatt
ttttatcgat
80
<210> 9
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tactggctgt actgaccgct tccgcagata gacatactta ttaacttata
ttcactctta 60
atcgatactt
ttgtatcgat
80
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tttttttttt tttttgggac cgaaacggtc cc
32
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tttttttttt tttttttttt tttttttttt gggaccgaaa
cggtccc
47
<210> 12
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt
60
gggaccgaaa
cggtccc
77
<210> 13
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt
60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
120
gggaccgaaa
cggtccc
137
<210> 14
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt gggaccgaaa cggtccc
167
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tttttttttt tttttttttt cccgcggctt
ttgccgcggg
40
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cccgcggctt
ttgccgcggg 60
<210> 17
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt 60
cccgcggctt
ttgccgcggg
80
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt cccgcggctt
ttgccgcggg
100
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cccgcggctt
ttgccgcggg 120
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccccccccc cccccccccc cccccagctc ccgcgaaaaa
cgcgggagct 50
<210> 21
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc agctcccgcg 60
aaaaacgcgg
gagct
75
<210> 22
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60
cccccccccc cccccagctc ccgcgaaaaa
cgcgggagct
100
<210> 23
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc agctcccgcg aaaaacgcgg 120
gagct
125
<210> 24
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 120
cccccagctc ccgcgaaaaa cgcgggagct
150
<210> 25
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tacaccagtt ccgcagatag acatacttat taacttatat tcactcttac
ttatactccc 60
acgtcgtgct tttgcacgac
gt
82
<210> 26
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60
atcgataccc
ccgtatcgat
80
Claims (21)
1.一种单链核酸分子，其特征在于，包括茎环结构区和单链区；
所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；
所述第一配对区和第二配对区互补配对；
所述单链环区为（dM）a，M为A、T、C、G或U，a为正整数；
所述单链区为（dN）b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C、G或U，b为正整数。
2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述单链区为（dA）b、（dT）b、（dC）b、（dG）b或（U）b。
3.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述第一配对区在5-15bp之间。
4.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述a在3-20之间。
5.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述b在15-150之间。
6.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其特征在于，所述单链核酸分子上含有淬灭基团；所述淬灭基团位于第一配对区、第二配对区或单链区的3’端。
7.一种聚合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备PCR反应体系，所述反应体系包括待测聚合酶、单链核酸分子、双链DNA染料、dNTP和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；
B、进行PCR反应，并通过荧光检测装置检测反应过程中的荧光强度；
所述单链核酸分子为权利要求1-6中任一项所述的单链核酸分子。
8.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述双链DNA染料为Eva
Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。
9.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述待测聚合酶为Taq
DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent
DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶。
10.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述反应体系还包括所述待测聚合酶的抗体，所述待测聚合酶的抗体能够抑制所述聚合酶的低温聚合酶活性。
11.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：
C、根据步骤B的结果获得荧光值对时间的双链核酸分子增长曲线，进而获得待测聚合酶的反应初速度，并以待测聚合酶的反应初速度来表示待测聚合酶活性。
12.根据权利要求11所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤:
D、配置一系列浓度的第一核酸分子，加入所述双链DNA染料，进而测定不同第一核酸分子浓度条件下对应的荧光强度，进而获得荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线；
E、根据荧光强度对第一核酸分子浓度的标准曲线，将步骤C所得待测聚合酶的反应初速度，换算成按单位时间内生成的第一核酸分子的量表示的待测聚合酶活性；
所述步骤D与步骤A、B、C没有先后关系；
所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
13.根据权利要求11所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：
F、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至C，得标准聚合酶的反应初速度；
G、根据标准聚合酶和待测聚合酶反应初速度的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
14.根据权利要求12所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：
H、利用标准聚合酶替换待测聚合酶重复步骤A至E，得标准聚合酶的聚合酶活性；
I、根据标准聚合酶和待测聚合酶的聚合酶活性的对比，得待测聚合酶的相对酶活性。
15.一种聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的单链核酸分子。
16.根据权利要求15所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，还包括双链DNA染料、dNTP和适宜所述聚合酶发挥活性的缓冲液。
17.根据权利要求16所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，所述dNTP为dTTP、dATP、dGTP或dCTP。
18.根据权利要求16所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，所述双链DNA染料为Eva
Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。
19.根据权利要求15所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，所述聚合酶为Taq
DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent
DNA聚合酶、MMLV逆转录酶或phi 29 DNA聚合酶。
20.根据权利要求15所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，还包括所述聚合酶的抗体，所述聚合酶的抗体能够抑制所述聚合酶的低温聚合酶活性。
21.根据权利要求15所述的聚合酶活性测定试剂盒，其特征在于，还包括第一核酸分子，所述第一核酸分子是与所述单链核酸分子自我复制完成后形成的产物具有相同序列的单链DNA核酸分子。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510708704.9A CN106636076B (zh) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
| PCT/CN2016/086968 WO2017071263A1 (zh) | 2015-10-28 | 2016-06-24 | 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510708704.9A CN106636076B (zh) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106636076A true CN106636076A (zh) | 2017-05-10 |
| CN106636076B CN106636076B (zh) | 2019-12-03 |
Family
ID=58631282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510708704.9A Expired - Fee Related CN106636076B (zh) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106636076B (zh) |
| WO (1) | WO2017071263A1 (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107557463A (zh) * | 2016-06-24 | 2018-01-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
| CN109609606A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-04-12 | 成都博奥晶芯生物科技有限公司 | 一种dna聚合酶的相对酶活的测定方法 |
| CN109652500A (zh) * | 2017-10-12 | 2019-04-19 | 深圳华大智造科技有限公司 | 快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法 |
| CN110791555A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-14 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种单链dna定量检测试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN111004834A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-14 | 莫纳(武汉)生物科技有限公司 | 一种Taq DNA聚合酶活性测定方法 |
| CN111635932A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-08 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN112176040A (zh) * | 2020-09-22 | 2021-01-05 | 江苏省海洋资源开发研究院(连云港) | 一种快速测定dna聚合酶活性的方法 |
| CN113862331A (zh) * | 2020-06-30 | 2021-12-31 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN118325894A (zh) * | 2024-06-14 | 2024-07-12 | 广东国盛医学科技有限公司 | 一种引物及检测dna聚合酶单碱基延伸能力的方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111718983B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-04-29 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种检测核酸聚合酶活性的检测方法 |
| CN115838429B (zh) * | 2022-11-25 | 2023-06-30 | 厦门康基生物科技有限公司 | 一种Taq DNA聚合酶抗体组合及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1546354B1 (en) * | 2002-08-29 | 2010-05-05 | Amersham Biosciences Corp. | Analyte detection |
| CN102154489A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-08-17 | 北京大学 | 单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法 |
| CN104357543A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-02-18 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种Poly (A)聚合酶活性测定方法 |
-
2015
- 2015-10-28 CN CN201510708704.9A patent/CN106636076B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-06-24 WO PCT/CN2016/086968 patent/WO2017071263A1/zh not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1546354B1 (en) * | 2002-08-29 | 2010-05-05 | Amersham Biosciences Corp. | Analyte detection |
| CN102154489A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-08-17 | 北京大学 | 单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法 |
| CN104357543A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-02-18 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种Poly (A)聚合酶活性测定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 周海清 等: "分子信标的原理、应用及其研究进展", 《光谱实验室》 * |
| 栾瑞波 等: "一种简便快速的聚合酶活性实时检测新方法", 《生命科学研究》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107557463A (zh) * | 2016-06-24 | 2018-01-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
| CN109652500B (zh) * | 2017-10-12 | 2021-12-14 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法 |
| CN109652500A (zh) * | 2017-10-12 | 2019-04-19 | 深圳华大智造科技有限公司 | 快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法 |
| CN109609606A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-04-12 | 成都博奥晶芯生物科技有限公司 | 一种dna聚合酶的相对酶活的测定方法 |
| CN110791555A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-14 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种单链dna定量检测试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN111004834A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-14 | 莫纳(武汉)生物科技有限公司 | 一种Taq DNA聚合酶活性测定方法 |
| CN111004834B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-07-28 | 莫纳(武汉)生物科技有限公司 | 一种TaqDNA聚合酶活性测定方法 |
| CN111635932B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-07-08 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN113862331A (zh) * | 2020-06-30 | 2021-12-31 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN111635932A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-08 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN113862331B (zh) * | 2020-06-30 | 2024-04-26 | 北京启衡星生物科技有限公司 | 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 |
| CN112176040A (zh) * | 2020-09-22 | 2021-01-05 | 江苏省海洋资源开发研究院(连云港) | 一种快速测定dna聚合酶活性的方法 |
| CN112176040B (zh) * | 2020-09-22 | 2023-11-17 | 江苏百时美生物科技有限公司 | 一种快速测定dna聚合酶活性的方法 |
| CN118325894A (zh) * | 2024-06-14 | 2024-07-12 | 广东国盛医学科技有限公司 | 一种引物及检测dna聚合酶单碱基延伸能力的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106636076B (zh) | 2019-12-03 |
| WO2017071263A1 (zh) | 2017-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106636076B (zh) | 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 | |
| US20230099446A1 (en) | Fast pcr for str genotyping | |
| EP2971080B1 (en) | Methods for amplification and sequencing using thermostable tthprimpol | |
| JP5680080B2 (ja) | アンカーオリゴヌクレオチドおよびアダプターオリゴヌクレオチドを用いる核酸の正規化した定量化方法 | |
| JP5680078B2 (ja) | ライゲーションに基づく核酸の正規化した定量化方法 | |
| TWI688656B (zh) | 具有增加的基因突變特異性的ｄｎａ聚合酶活性增強用ｐｃｒ緩衝液組合物 | |
| CN107849603A (zh) | 利用有限核苷酸组成的引物扩增 | |
| WO2017219928A1 (zh) | 单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 | |
| WO2009154733A2 (en) | Polymerase incorporation of non-standard nucleotides | |
| US12139755B2 (en) | Methods of RNA amplification | |
| CN110088296A (zh) | 改进的多重和多步扩增反应及其试剂 | |
| CN107267615A (zh) | G形夹用于改进的等位基因特异性pcr的用途 | |
| JP5680079B2 (ja) | Ｒｎａの正規化した定量化方法 | |
| CN113186257A (zh) | 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法 | |
| CN112301116A (zh) | 非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法 | |
| US9464308B2 (en) | Method for transcriptional amplification of nucleic acids combining steps of different temperatures | |
| US9334534B1 (en) | Processes replacing standard nucleotides by non-standard nucleotides and non-standard nucleotides by standard nucleotides in DNA | |
| CN110592192A (zh) | 延迟性焦磷酸化激活性聚合反应 | |
| CN116083537A (zh) | 基于核酸酶介导恒温扩增的rna检测方法和试剂盒 | |
| US11667942B1 (en) | Assembly of long DNA molecules by transliteration | |
| US10415088B1 (en) | In vivo conversion of nucleosides in plasmid DNA | |
| EP4105327A1 (en) | Method for synthesizing nucleic acid under constant temperature conditions, kit, and application | |
| WO2016092062A1 (en) | Method for improving the efficiency of cdna generation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191203 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |