CN106635892A - 一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法，属于发酵工程领域。本发明以一株产香橙素的基因工程菌株为出发菌株，利用葡萄糖和有机氮源获得较高菌体浓度，经过诱导剂诱导外源蛋白表达，最终实现香橙素的高效生物合成。本发明的生产方法可以实现天然香橙素的高效率生产，在发酵周期55h内，发酵液中香橙素浓度达到3～5g/L，底物质量转化率达70～90％。
Description
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
香橙素(Aromadendrine)，又名二氢山萘酚(Dihydrokaempferol)是一种黄酮醇，属于黄酮类化合物，是植物花色苷的一种重要前体物质。香橙素第一次是从桃中发现的，此后陆续发现存在于不同植物中，如流苏树属的植物、酒神菊树、山羊树、侧柏叶和西伯利亚红松等，但在自然界分布并不广泛。
黄酮类化合物已被广泛报道具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，和神经保护活性。现在也已有多篇报道表明香橙素具有多种生物活性，如抗炎活性、清除自由基的活性和抗肿瘤活性。香橙素可以通过刺激葡萄糖吸收和改善胰岛素抗性而具有抗糖尿病活性，而高浓度的香橙素还可以减少小胶质细胞中脂多糖诱导的一氧化氮的产生。此外，香橙素衍生物具有多种生物活性，如抗增殖和成骨作用。因此，香橙素在医药、保健品和食品添加剂等方面有着广泛的用途。
目前香橙素主要通过植物提取获得，但由于香橙素在植物中含量太低，需要消耗大量的植物原料，植物原料的获得、收集及储存都不方便，使得通过植物提取的香橙素成本较高。因此，为了满足工业大生产的要求，这就需要有一种新的技术来替代植物提取法生产香橙素，这种新方法操作起来要更简便、生产成本更低、生产率更高。而利用微生物发酵的生物合成法是实现上述要求的有效途径。目前为止，还未见以柚皮素为底物利用生物发酵法生产香橙素的报道。
发明内容
本发明首先提供了一株大肠杆菌(Escherichia coli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。该菌株形态呈短杆状，在固体培养基上菌落呈透明的圆形。
本发明还提供利用所述大肠杆菌生物转化柚皮素生产香橙素的方法，包括以下步骤
(1)制备种子培养液：将纯种接种到种子培养基中，在28～32℃条件下，180～200rpm摇床振荡培养13～17h，制得种子液；
(2)细胞培养：将种子液，按体积比2～10％的接种量接入发酵培养基中，在35～37℃条件下，150～300rpm培养2～8h；
(3)诱导：发酵液降温至30℃，加入诱导剂进行诱导，继续培养2～10h；
(4)转化：加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液进行发酵转化，发酵周期为40～70h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将种子液，按体积比3～8％的接种量接入发酵培养基中，在37℃条件下，150～300rpm培养2～8h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)将步骤(2)的细胞培养液降温至30℃，加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mM IPTG进行诱导，继续培养2～10h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)采用发酵罐发酵时，发酵罐培养条件为：温度控制37℃，pH不低于6.5～6.8，转速控制100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm；发酵液pH开始上升至7.3～8.0时，开始加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mM IPTG诱导培养。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)采用发酵罐发酵时，维持温度30℃，pH控制7.3～8.6，转速100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm，以0.1～0.6g/L/h的速率加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液开始转化，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。葡萄糖补加量为300g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)采用发酵罐发酵时，将2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液分批次加入，每次加入0.1～1.0g/L，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。葡萄糖补加量为300g/L。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨2.5～7.5g/L，酵母抽提物1～7.5g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨2.5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)还可以将步骤(3)经诱导培养后的菌体离心收集，然后借助缓冲液构建全细胞转化体系，催化柚皮素合成香橙素。
在本发明的一种实施方式中，发酵过程通过添加磷酸或盐酸、氢氧化钠或氨水来控制pH。
本发明的优点：本发明以柚皮素为底物的微生物转化法生产香橙素，质量转化率达70～90％，生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染、环境友好等优点，充分保持了香橙素的天然性，首次实现了天然香橙素的生物合成。相比较于从植物中提取天然香橙素，本发明方法获得单位天然香橙素的生产成本大大降低，且生产方法简单，有利于实现工业生产。本发明所公布的方法所制得的发酵液中香橙素水平较高，发酵液中香橙素浓度达到3～5g/L，底物转化率也达到70～90％，且得到的香橙素发酵液成分简单，底物残留少，容易提取高纯度香橙素晶体。
生物材料保藏
一株大肠杆菌(Escherichia coli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。
附图说明
图1大肠杆菌使用不同浓度蛋白胨培养基摇瓶发酵合成香橙素的情况
图2大肠杆菌使用不同浓度酵母提取物培养基摇瓶发酵合成香橙素的情况
图3大肠杆菌摇瓶发酵合成香橙素不同诱导时间的情况
具体实施方式
分析方法：采用高效液相色谱法分析发酵液中的底物柚皮素和产物香橙素。采用岛津SPD-M20A二极管阵列检测器，Phenomenex luna 5u C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μ)；流动相15％～70％乙腈：85％～30％0.15％(w/v)乙酸溶液梯度洗脱；流速0.8ml/min；柱温35℃；进样量5μL。
实施例1
出发菌株：该出发菌株为大肠杆菌(E.coli)DHK-161114CCTCC NO:M 2016645。
平板培养：将穿刺管保存的大肠杆菌划线接种至平板培养基上，在30℃培养箱中培养15～24h。
制备大肠杆菌CCTCC NO:M 2016645菌种库：挑取单菌落，接种到种子培养基中，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养13～17h，吸取所得种子培养液0.5ml转移至50％甘油溶液中，配制成终浓度25％的种子甘油管，-80℃保存。
制备种子液：吸取20uL种子甘油管，接种到种子培养基中，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养13～17h，制得种子液。
制备种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，自来水配制，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
制备发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，自来水配制，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养16h，按5％接种量移种至发酵培养基中(50ml/250ml)，在37℃条件下，200rpm摇床震荡培养3h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导3h，维持30℃，共加入2.7g/L的40％(w/v)的柚皮素溶液，整个发酵周期54h，发酵结束测定底物、产物含量，结果见表1。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：称取一定量的柚皮素用DMSO溶解定容至40％(w/v)浓度。
表1大肠杆菌摇瓶发酵合成香橙素的情况
| 试验批次 | 香橙素产量(g/L) | 柚皮素含量(g/L) |
| 第一次 | 1.79 | 0.50 |
| 第二次 | 1.75 | 0.59 |
| 第三次 | 1.74 | 0.79 |
| 第四次 | 1.82 | 0.65 |
| 第五次 | 1.68 | 0.53 |
实施例2不同蛋白胨浓度
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵培养基：分别配制蛋白胨0、2.5、5、7.5、10.0和12.5g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，自来水配制，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养16h，按5％接种量移种至不同蛋白胨浓度的发酵培养基中(50ml/250ml)，在37℃条件下，200rpm摇床震荡培养3h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导3h，维持30℃，共加入2.7g/L底物柚皮素，发酵时间54h，发酵结束测定底物、产物含量，结果见图1，蛋白胨浓度为2.5g/L时，香橙素的产量达到2.1g/L。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例3不同酵母提取物浓度
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵培养基：蛋白胨10g/L，分别配制酵母抽提物浓度为0、2.5、5.0和7.5g/L，氯化钠10g/L，自来水配制，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养16h，按5％接种量移种至不同酵母提取物浓度的发酵培养基中(50ml/250ml)，在37℃条件下，200rpm摇床震荡培养3h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导3h，维持30℃，共加入2.7g/L底物柚皮素，发酵时间54h，发酵结束测定底物、产物含量，结果见图2，酵母抽提物浓度为2.5g/L时，香橙素的产量达到1.8g/L。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例4全细胞转化
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵培养基：同实施例1。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养16h，按5％接种量移种至发酵培养基中(50ml/250ml)，在37℃条件下，200rpm摇床震荡培养3h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖分别诱导1h、3h和5h，再离心收集菌体悬浮于同样体积的pH8.0的PBS缓冲液中进行转化，维持30℃，共加入2.0g/L底物柚皮素，发酵周期54h，发酵结束测定底物、产物含量，结果见图3，乳糖诱导5h后所得细胞转化柚皮素生产香橙素的产量为0.6g/L左右。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例5
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵发酵培养基：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2。自来水配制，初始体积2.7L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养8h，将100ml种子液(接种量3.3％)移种至发酵培养基中，在37℃条件下，300rpm发酵罐培养2h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导2h后，加入40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，柚皮素分批次加入，每次加入量约0.1～1.0g/L，每当HPLC检测底物浓度在0.1g/L以下时开始补加底物。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束由柚皮素合成香橙素的质量转化率达80％～90％，结果见表2。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长和转化过程中pH无需进行控制；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例6
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵发酵培养基：
蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2。自来水配制，初始体积2.7L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养8h，将100ml种子液(接种量3.3％)移种至发酵培养基中，在37℃条件下，300rpm发酵罐培养2h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导2h后，加入40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，柚皮素分批次加入，每次加入量约0.1～1.0g/L，每当HPLC检测底物浓度在0.1g/L以下时开始补加底物。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束由柚皮素合成香橙素的质量转化率达80％～90％，结果见表2。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长和转化过程中pH无需进行控制；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例7
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵发酵培养基：
蛋白胨5g/L，酵母提取物7.5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2。自来水配制，初始体积2.7L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养8h，将100ml种子液(接种量3.3％)移种至发酵培养基中，在37℃条件下，300rpm发酵罐培养2h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导2h后，加入40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，柚皮素分批次加入，每次加入量约0.1～1.0g/L，每当HPLC检测底物浓度在0.1g/L以下时开始补加底物。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束由柚皮素合成香橙素的质量转化率达80％～90％，结果见表2。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长和转化过程中pH无需进行控制；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例8
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备发酵发酵培养基：
蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 7.5g/L，pH 7.2。自来水配制，初始体积2.7L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
吸取20μL种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养8h，将100ml种子液(接种量3.3％)移种至发酵培养基中，在37℃条件下，300rpm发酵罐培养2h，降温至30℃，加入1.5％的乳糖诱导2h后，加入40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，柚皮素分批次加入，每次加入量约0.1～1.0g/L，每当HPLC检测底物浓度在0.1g/L以下时开始补加底物。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束由柚皮素合成香橙素的质量转化率达80％～90％，结果见表2。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长和转化过程中pH无需进行控制；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
表2 5L发酵罐大肠杆菌采用不同发酵培养基成分合成香橙素的情况
表3大肠杆菌5L发酵合成香橙素提高菌浓的情况
实施例9流加发酵
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备种子液：吸取20μl种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量50ml/250ml，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养17h。
制备发酵发酵培养基：蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 7.5g/L，pH7.2。自来水配制，初始体积2.75L，121℃高压蒸汽灭菌20min。初始葡萄糖15g/L，115℃高压蒸汽灭菌后接种前加入。
将100ml种子液(接种量3.3％)移种至发酵培养基中，在37℃条件下，300rpm发酵罐培养6h，降温至30℃，加入1.2％的乳糖诱导3h后，开始流加40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，流加速率0.25g/L/h，同时以0.3g/L/h的速率流加葡萄糖溶液，葡萄糖流加量达到300g/L。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束共消耗柚皮素9.3g，由柚皮素合成香橙素的质量转化率达80％～90％，结果见表4。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长过程中控制pH7.0，诱导转化阶段维持pH8.0；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
实施例10IPTG诱导
出发菌株：同实施例1。
制备种子培养基：同实施例1。
制备种子液：吸取20μl种子甘油管接入种子摇瓶培养基中，装液量200ml/1L，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养17h。
制备发酵发酵培养基：蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 7.5g/L，pH7.2。自来水配制，初始体积2.75L，121℃高压蒸汽灭菌20min。初始葡萄糖15g/L，115℃高压蒸汽灭菌后接种前加入。
将1.2L种子液(接种量4％)移种至50L发酵罐培养基中，在37℃条件下，200rpm发酵罐培养8h，降温至30℃，加入0.8mM IPTG诱导2h，10h开始流加40％(w/v)柚皮素溶液进行转化，流加速率0.15g/L/h，同时以0.3g/L/h的速率流加葡萄糖溶液，葡萄糖流加量达到300g/L。发酵过程中测定底物、产物含量，发酵结束由柚皮素合成香橙素的质量转化率达70～90％，结果见表4。
发酵罐发酵过程参数控制：生长阶段温度控制37℃，诱导及转化阶段温度控制30℃；生长过程中控制pH7.0，诱导转化阶段维持pH8.0；溶氧偶联搅拌，控制30％以上；搅拌控制在100rpm～700rpm；通气比为0.6vvm。
上述40％(w/v)柚皮素溶液制备：同实施例1。
表4大肠杆菌50L发酵合成香橙素使用IPTG诱导的情况
| 发酵时间(h) | 香橙素(g/L) | 柚皮素(g/L) | OD600 |
| 7 | / | / | 12.77 |
| 10 | / | / | 11.16 |
| 23 | 0.77 | 0.31 | 15.81 |
| 28 | 0.94 | 0.26 | 15.93 |
| 30.5 | 1.05 | 0.27 | 16.24 |
| 47.5 | 1.27 | 0.27 | 15.35 |
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株大肠杆菌(Escherichia coli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。
2.一种应用权利要求1所述大肠杆菌生物转化柚皮素生产香橙素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备种子培养液：将纯种接种到种子培养基中，在28～32℃条件下，180～200rpm摇床振荡培养13～17h，制得种子液；
(2)细胞培养：将种子液，按体积比2～10％的接种量接入发酵培养基中，在35～37℃条件下，150～300rpm培养2～8h；
(3)诱导：发酵液降温至30℃，加入诱导剂进行诱导，继续培养2～10h；
(4)转化：加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液进行发酵转化，发酵周期为40～70h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)将种子液，按体积比3～8％的接种量接入发酵培养基中，在37℃条件下，150～300rpm培养2～8h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)将步骤(2)的细胞培养液降温至30℃，加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mM IPTG进行诱导，继续培养2～10h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用发酵罐发酵时，发酵罐培养条件为：温度控制37℃，pH不低于6.5～6.8，转速控制100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm；发酵液pH开始上升至7.3～8.0时，开始加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mM IPTG诱导培养。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)采用发酵罐发酵时，维持温度30℃，pH控制7.3～8.6，转速100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm，以0.1～0.6g/L/h的速率加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液开始转化，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)采用发酵罐发酵时，维持温度30℃，pH控制7.3～8.6，转速100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm，将2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液分批次加入，每次加入0.1～1.0g/L，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
9.根据权利要求2～8任一所述的方法，其特征在于，发酵培养基：蛋白胨2.5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)还可以将步骤(3)经诱导培养后的菌体离心收集，然后借助缓冲液构建全细胞转化体系，催化柚皮素合成香橙素。
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| CN120240645B (zh) * | 2025-06-06 | 2025-09-09 | 云南西草资源开发有限公司 | 一种含黄酮类成分的红花提取物的制备方法及其应用 |
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