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CN106619619A - 化合物hubin‑1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途 - Google Patents

化合物hubin‑1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途 Download PDF

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CN106619619A
CN106619619A CN201710010015.XA CN201710010015A CN106619619A CN 106619619 A CN106619619 A CN 106619619A CN 201710010015 A CN201710010015 A CN 201710010015A CN 106619619 A CN106619619 A CN 106619619A
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CN
China
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hubin
compound
liver
hepatitis
group
Prior art date
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Application number
CN201710010015.XA
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English (en)
Inventor
陈智
刘艳宁
朱海红
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Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
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Publication date
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin

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Abstract

本发明涉及药物研发领域，具体公开了化合物HUBIN‑1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现了化合物HUBIN‑1的肝细胞保护作用和抗炎治疗作用，且适用于多种类型的肝脏炎症，开拓了化合物HUBIN‑1的应用领域。本发明为急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎（肝衰竭），包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等多种肝脏炎症性疾病提供了新的预防和/或治疗药物，具有明显的社会效益。

Description

化合物HUBIN-1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中 的用途
技术领域
本发明涉及药物研发领域，具体公开了化合物HUBIN-1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途。
背景技术
肝脏炎症性疾病是目前临床上的一种常见疾病，从病因学角度来分类，可分为病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等。我国属乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行国家，全国现有乙型肝炎患者约3000万人。根据起病缓急和病程长短，可分为急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎(肝衰竭)等。由于缺乏恰当和有效的干预和治疗措施，部分急性肝炎患者和慢性肝炎患者病情可迅速发展成为重型肝炎。临床报道显示重型肝炎的病死率非常高，病死率高达50％～70％。肝炎病毒(在我国主要是乙型肝炎病毒)感染，化学性毒物或药物，缺血、酒精、放射性刺激，遗传性代谢障碍及自身免疫病等多种因素均可引起慢或急性肝炎，甚至导致重型肝炎(肝衰竭)。重型肝炎(肝衰竭)病情发展迅速、凶险，伴有肝细胞广泛坏死，导致肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，表现为以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等的一组临床症候群。
目前，对于重型肝炎(肝衰竭)尚缺乏有效的治疗手段及药物，导致其病死率一直居高不下。临床上通常只能采取相应的代谢和营养支持等综合疗法。尽管肝移植可用于一些具体原因所致的急性肝功能衰竭患者，但因为脏器来源和治疗费用的问题，不能在临床上大规模使用。而生物人工肝支持系统和肝、干细胞移植在治疗急性重型肝炎(肝衰竭)中的作用尚处在临床研究早期阶段。因此亟待研发新的治疗药物，开拓新的治疗手段和方法，以提升重型肝炎(肝衰竭)的救治存活率，且能改善各种急性和慢性肝炎患者的炎症程度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供化合物HUBIN-1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途。
为了实现本发明的目的及相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了化合物HUBIN-1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途，所述化合物HUBIN-1的结构式如式Ⅰ所示：
所述化合物HUBIN-1的分子式为C13H11CIFN3O2。所述化合物HUBIN-1的分子量为295.0524。
所述化合物HUBIN-1为现有技术，可通过现有方法制备获得，这些均在本领域技术人员所能够知晓的知识范畴内。
优选地，所述药物具备以下作用中的任一项或多项：(1)能够降低ALT水平；(2)能够降低AST水平；(3)能够减轻肝细胞变性和坏死程度；(4)抑制肝细胞凋亡；(5)减少炎症细胞浸润；(6)抑制肝脏巨噬细胞(枯否细胞)活化和炎症因子分泌；(7)抑制肝细胞脂化和细胞脂质毒性；(8)促进肝星状细胞的凋亡。
优选地，所述药物具备以下作用中的任一项或多项：(1)抗肝损伤；(2)抗炎症细胞浸润；(3)抗肝细胞脂化；(4)抗肝纤维化。
优选地，所述肝脏炎症性疾病包括但不限于急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
优选地，所述肝脏炎症性疾病包括但不限于病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等多种肝脏炎症性疾病，包括急性肝炎、慢性肝炎和急性重型肝炎、亚急性重型肝炎、慢加急性重型肝炎。
优选地，所述化合物HUBIN-1作为有效成分之一或唯一有效成分。
本发明第二方面公开了一种肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物，含有安全有效量的化合物HUBIN-1，以及药学上可接受的载体。
优选地，所述化合物HUBIN-1作为有效成分之一或唯一有效成分。
药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。
本发明药物使用时，所述化合物HUBIN-1作为唯一有效成分，或者所述化合物HUBIN-1作为有效成分之一，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型。
本发明的药物可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式。
所述药物的制剂形式可以为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末，或者栓剂。上述制剂类型可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关定义理解，上述制剂的制备可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关制剂的方法配制。
本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗肝脏炎症性疾病的方法，包括步骤：将含有安全有效量的化合物HUBIN-1的药物施用于作用对象。
优选地，所述肝脏炎症性疾病为急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎(肝衰竭)，包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等多种肝脏炎症性疾病。
使用剂量可以是1.25～10mg/kg，可根据使用对象的具体情况选择。这些均在医师所知晓和掌握的知识范围内。
所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。
本发明的第四方面，提供了化合物HUBIN-1的新用途，所述化合物HUBIN-1的结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ，
包括以下用途中的任一项或多项：(1)能够降低ALT水平；(2)能够降低AST水平；(3)能够减轻肝细胞变性和坏死程度；(4)抑制肝细胞凋亡；(5)减少炎症细胞浸润；(6)抑制肝脏巨噬细胞(枯否细胞)活化和炎症因子分泌；(7)抑制肝细胞脂化和细胞脂质毒性；(8)促进肝星状细胞的凋亡。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现了化合物HUBIN-1的肝细胞保护作用和抗炎治疗作用，且适用于多种类型的肝脏炎症，开拓了化合物HUBIN-1的应用领域。本发明为急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎(肝衰竭)，包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等多种肝脏炎症性疾病提供了新的预防和/或治疗药物，具有明显的社会效益。
附图说明
图1：化合物HUBIN-1不同给药剂量对小鼠肝炎模型的保护作用；其中，HUBIN-1-0.625组、1.25组、2.5组、5组、10组，分别表示LPS/D-GalN造模前30分钟进行0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg以及10mg/kg剂量的化合物HUBIN-1腹腔给药的治疗组；化合物HUBIN-1治疗组肝脏病理明显改善，2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg治疗组效果最佳，肝组织几无肝细胞坏死和炎细胞浸润。
图2：化合物HUBIN-1不同给药时间对小鼠肝炎模型的治疗作用；化合物HUBIN-1于LPS/D-GalN造模前30分钟、造模后30分钟及1小时给药均能显著缓解肝细胞坏死和炎细胞浸润，改善肝脏病理。
图3：化合物HUBIN-1与Nec-1对小鼠肝炎的疗效比较；于LPS/D-GalN造模前30分钟进行同等剂量(5mg/kg)的化合物HUBIN-1或Nec-1(Nec-1①、②、③分别购自Sigma-Aldrich、Merck Millipore、BioVision)的腹腔给药，化合物HUBIN-1较之Nec-1更能显著改善肝脏病理。
图4：化合物HUBIN-1对TNF-α/ActD诱导的肝细胞凋亡和坏死的影响；模型组表示以TNF-α/ActD诱导的肝细胞凋亡/坏死模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分别表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加TNF-α/ActD刺激；TNF-α/ActD刺激6小时后分析细胞早期凋亡比例，化合物HUBIN-1预处理能显著下调L02细胞的早期凋亡比例(4A)；TNF-α/ActD刺激24小时后分析坏死比例，化合物HUBIN-1预处理能显著下调L02细胞的坏死比例。
图5：LPS/D-GalN模型小鼠肝组织Caspase-3剪切体和RIP1蛋白的Western Blot分析；1为正常对照组，2-4为LPS/D-GalN模型组，5-7为2.5mg/kg剂量HUBIN-1治疗组，8-10为5mg/kg剂量HUBIN-1治疗组，11为单纯化合物HUBIN-1注射组；2.5mg/kg和5mg/kg剂量的HUBIN-1治疗组中Caspase-3剪切体和RIP1蛋白表达水平均显著低于模型组，提示化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的保护作用是通过抑制肝细胞的凋亡和坏死。
图6：化合物HUBIN-1对棕榈酸诱导的肝细胞脂质毒性的影响；模型组表示以高浓度棕榈酸(PA)诱导肝细胞脂质毒性模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分别表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加PA刺激；化合物HUBIN-1预处理能显著降低PA导致的细胞毒性，并呈剂量依赖性。
图7：化合物HUBIN-1对STS诱导的肝星状细胞系LX2凋亡的影响；模型组表示以STS诱导的LX2细胞凋亡模型，HUBIN-1-25μM、-50μM、-100μM分别表示以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加STS诱导。化合物HUBIN-1预处理能促进STS诱导的HSC凋亡，并呈剂量依赖性。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 化合物HUBIN-1溶液的配制
化合物HUBIN-1，采用DMSO助溶后配制成的化合物HUBIN-1的储存液，于注射前以PBS稀释配成化合物HUBIN-1的溶剂。
实施例2 化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的保护作用-量效关系研究
动物模型是验证新的治疗药物、新的治疗手段是否有效的研究工具，目前国际上采用的模拟重型肝炎的动物模型有药物性重型肝炎模型(对-乙酰氨基酚模型、LPS/D-GalN模型、硫代乙酰胺模型、四氯化碳模型等)、急性肝缺血模型、部分肝切除模型等。其中LPS/D-GalN模型，因其可重复性好，肝外毒性不明显，肝损伤表现接近临床等优势，是一种较为理想的重型肝炎动物模型。
六周龄雄性C57BL/6小鼠(购于南京生物医药研究院)随机分为正常对照组、化合物HUBIN-1组、模型组(LPS/D-GalN组)、治疗组(0.625mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组、1.25mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组、2.5mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组、5mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组、10mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组)。治疗组分别按0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg以及10mg/kg的剂量进行化合物HUBIN-1的溶剂的腹腔注射，30分钟后LPS/D-GalN(10μg/kg LPS+400mg/kg D-GalN)腹腔注射造模；模型组以等体积的溶剂代替化合物HUBIN-1的溶剂；化合物HUBIN-1组以等体积的PBS代替LPS/D-GalN；正常对照组不做处理。LPS/D-GalN造模6小时摘眼球法取血，并取肝脏组织固定和冻存，生化及病理学检查评估各组小鼠肝损伤程度。
实验结果：
LPS/D-GalN模型组ALT、AST水平均较正常对照组显著升高(表1)，肝组织病理切片亦显示肝细胞坏死及炎细胞浸润明显；各个剂量的治疗组较模型组，其ALT、AST水平均显著降低，尤以2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg组降低更为明显(这3个剂量间无统计学差异)，这三组小鼠肝组织病理切片亦显示肝细胞几无坏死，炎细胞浸润也减少(图1)；单纯化合物HUBIN-1注射组(10mg/kg剂量)的肝功能及病理与正常对照组类似。
以上结果表明，化合物HUBIN-1以2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg剂量给药对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎均具有保护作用。优选剂量为2.5mg/kg，5mg/kg。
表1
ALT(U/L) AST(U/L) 统计分析
正常对照 26.3±1.4 86±1.4 a,c
单独化合物HUBIN-1 25.3±0.7 87.1±3.9 a,c
LPS/GalN模型组 1631.3±258.4 932.5±88.9 b,c
化合物HUBIN-1-0.625治疗组 639.5±114.7 522.4±61.8 a,b,c
化合物HUBIN-1-1.25治疗组 228.7±45.2 225.3±40.1 a,b,c
化合物HUBIN-1-2.5治疗组 79.4±3.9 134.4±5.7 a,b
化合物HUBIN-1-5治疗组 93.6±7.1 151.8±8.5 a,b
化合物HUBIN-1-10治疗组 111.3±12.3 161.6±13.2 a,b
注：数值为MEAN±SE；a—与模型组相比有统计学差异；b—与正常对照比有统计学差异；c—与化合物-2.5剂量治疗组相比有统计学差异。
实施例3 化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的治疗作用-时效关系研究
六周龄雄性C57BL/6小鼠(购于南京生物医药研究院)随机分为正常对照组、模型组(LPS/D-GalN组)、治疗组(2.5mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组)。治疗组腹腔注射LPS/D-GalN造模(10μg/kg LPS+400mg/kg D-GalN)，分别于LPS/D-GalN造模前30分钟以及造模后30分钟、1小时、2小时给予化合物HUBIN-1 2.5mg/kg剂量腹腔注射；模型组以等体积的溶剂代替化合物HUBIN-1；正常对照组不做处理。LPS/D-GalN造模6小时摘眼球法取血，并取肝脏组织固定和冻存，生化及病理学检查评估各组小鼠肝组织损伤程度。
实验结果：
LPS/D-GalN模型组ALT、AST水平均较正常对照组显著升高，肝组织病理切片亦显示肝细胞坏死及炎细胞浸润明显；LPS/D-GalN造模前30分钟给予化合物HUBIN-1(2.5mg/kg)腹腔注射，可减轻LPS/D-GalN诱导的肝损伤程度。与模型组相比，化合物HUBIN-1干预组小鼠血清ALT及AST水平显著下降(表2)。病理切片亦显示肝细胞几无坏死，炎细胞浸润也减少(图2)；LPS/D-GalN造模后30分钟及1小时给药亦能缓解肝脏炎症，降低血清ALT、AST水平，但其治疗效果不及造模前给药；而造模后2小时再给药，治疗组的肝组织病理与生化指标与模型组相比无显著差异。
以上结果表明，化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎不仅具有预防保护作用，早期给药还具有治疗作用。
表2
ALT(U/L) AST(U/L) 统计分析
正常对照 26.3±1.4 86±1.4 a,c
LPS/GalN模型组 1631.3±258.4 932.5±88.9 b,c
造模前30分钟给药组 79.4±3.9 134.4±5.7 a,b
造模后30分钟给药组 448.3±48.8 416.7±34.3 a,b,c
造模后1小时给药组 718.3±121.9 528.3±72.3 a,b,c
造模后2小时给药组 1461.3±212.7 819.4±130.2 b,c
注：数值为MEAN±SE；a—与模型组相比有统计学差异；b—与正常对照比有统计学差异；c—与造模前30分钟给药组相比有统计学差异。
实施例4 化合物HUBIN-1与Nec-1在LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的疗效比较
Nec-1分别购买自如下公司：
表3
六周龄雄性C57BL/6小鼠(购于南京生物医药研究院)随机分为正常对照组、模型组(LPS/D-GalN组)、化合物HUBIN-1治疗组(5mg/kg+LPS/D-GalN组)、Nec-1治疗组(Nec-1①、②、③均采用5mg/kg剂量)。治疗组分别按5mg/kg剂量腹腔注射化合物HUBIN-1或Nec-1①、②、③，30分钟后LPS/D-GalN(10μg/kg LPS+400mg/kg D-GalN)腹腔注射造模；模型组以等体积的溶剂代替化合物HUBIN-1；正常对照组不做处理。LPS/D-GalN造模6小时摘眼球法取血，并取肝脏组织固定和冻存，生化及病理学检查评估各组小鼠肝损伤程度。
实验结果：
LPS/D-GalN模型组ALT、AST水平均较正常对照组显著升高，肝组织病理切片亦显示肝细胞坏死及炎细胞浸润明显；化合物HUBIN-1治疗组和Nec-1治疗组较模型组，其ALT、AST水平，以及肝细胞坏死程度和炎细胞浸润均显著降低；尤以化合物HUBIN-1的疗效最佳，其较Nec-1①、②、③治疗组，血清ALT、AST水平降低更为明显(而Nec-1①、②、③这三组间无统计学差异)，小鼠肝组织病理切片亦显示肝细胞几无坏死，炎细胞浸润也更少(图3)。
以上结果表明，同等剂量条件下化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的保护作用优于商品化Nec-1。
表4
ALT(U/L) AST(U/L) 统计分析
正常对照 26.3±1.4 86±1.4 a,c
LPS/GalN模型组 1631.3±258.4 932.5±88.9 b,c
化合物HUBIN-1治疗组 93.6±7.1 151.8±8.5 a,b
Nec-1①治疗组 765.3±134.4 585.7±69.8 a,b,c
Nec-1②治疗组 692.3±111.3 515.3±72.8 a,b,c
Nec-1③治疗组 559.5±104.7 492.4±61.8 a,b,c
注：数值为MEAN±SE；a—与模型组相比有统计学差异；b—与正常对照比有统计学差异；c—与化合物HUBIN-1治疗组相比有统计学差异。
实施例5 化合物HUBIN-1抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌
枯否细胞(肝脏巨噬细胞)在各类肝脏炎症性疾病的发生发展中起重要作用，临床和基础研究中均发现肝炎过程中存在枯否细胞活化和炎症因子分泌异常的现象。体外常采用LPS刺激，诱导巨噬细胞活化及炎症因子分泌来建模，该细胞模型可用于抗肝炎药物的体外筛选和疗效评估。
我们采用小鼠原代肝脏巨噬细胞(枯否细胞)建立巨噬细胞活化模型，LPS购自Sigma公司。分离小鼠原代枯否细胞，分为对照组，LPS模型组(500ng/ml)，化合物HUBIN-1干预组(分别以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加LPS刺激)。LPS刺激24小时后，收集细胞培养上清，ELISA检测炎症因子TNF-α、HMGB1的水平。
实验结果：
LPS刺激会促进枯否细胞分泌TNF-α、HMGB1，而化合物HUBIN-1预处理枯否细胞能显著降低这些炎症因子的分泌水平，并呈剂量依赖性(表5)。
以上结果表明，化合物HUBIN-1可抑制LPS诱导的巨噬细胞活化和炎症因子分泌，具有抗炎功效。
表5
注：数值为MEAN±SD；a—与模型组相比有统计学差异；b—与对照比有统计学差异；c—与化合物HUBIN-1-25μM组相比有统计学差异；d—与化合物HUBIN-1-100μM组相比有统计学差异。
实施例6 化合物HUBIN-1抑制TNF-α/ActD诱导的肝细胞凋亡和坏死
病毒感染、酒精、高脂及药物刺激等因素所致的肝炎都存在肝细胞的凋亡和坏死现象。体外常采用TNF-α/ActD刺激来诱导肝细胞凋亡、坏死，建立肝细胞损伤的细胞模型，该细胞模型可用于肝病治疗药物的体外筛选和疗效评估。
我们采用人肝上皮细胞系L02细胞(购自ATCC)建立肝细胞损伤模型，TNF-α和ActD分别购自PeproTech和MCE公司。L02细胞贴壁过夜后，分为对照组，TNF-α/ActD模型组(10ng/ml TNF-α+0.2μM ActD)，化合物HUBIN-1干预组(分别以25、50、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加TNF-α/ActD刺激)。TNF-α/ActD刺激6小时和24小时后收集细胞，采用BD的凋亡/坏死检测试剂盒进行肝细胞凋亡和坏死的检测。
实验结果：
TNF-α/ActD刺激6小时能诱导L02细胞的早期凋亡，化合物HUBIN-1预处理能显著下调L02细胞的早期凋亡比例，并呈剂量依赖性(图4A)；TNF-α/ActD刺激24小时后能明显诱导L02细胞的坏死，化合物HUBIN-1预处理能显著下调L02细胞的坏死比例，并呈剂量依赖性(图4B)。
以上结果表明，化合物HUBIN-1对TNF-α/ActD诱导的肝细胞凋亡和坏死具有明显的缓解作用，有肝细胞保护作用。
实施例7 化合物HUBIN-1抑制LPS/D-GalN模型小鼠肝组织的凋亡和坏死
六周龄雄性C57BL/6小鼠(购于南京生物医药研究院)随机分为正常对照组、化合物HUBIN-1组、模型组(LPS/D-GalN组)、治疗组(2.5mg/kg HUBIN-1+LPS/D-GalN组、5mg/kgHUBIN-1+LPS/D-GalN组)。治疗组分别按2.5mg/kg或5mg/kg剂量进行化合物HUBIN-1的溶剂的腹腔注射，30分钟后LPS/D-GalN(10μg/kg LPS+400mg/kg D-GalN)腹腔注射造模；模型组以等体积的溶剂代替化合物HUBIN-1的溶剂；化合物HUBIN-1组以等体积的PBS代替LPS/D-GalN；正常对照组不做处理。LPS/D-GalN造模6小时后，处死小鼠取其肝脏组织进行Caspase-3(其剪切体提示凋亡)和RIP1(提示坏死)分子的Western Blot检测(抗体均购自CST公司)。
实验结果：
LPS/D-GalN模型组中Caspase-3剪切体和RIP1蛋白的表达水平显著增加(图5)；2.5mg/kg和5mg/kg剂量的HUBIN-1治疗组中上述分子的表达水平均显著下调；单纯化合物HUBIN-1注射组上述分子的表达水平亦显著低于模型组。
结合实施例2，该实施例结果表明，优选剂量的化合物HUBIN-1对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的保护作用是通过抑制肝细胞的凋亡和坏死。
实施例8 化合物HUBIN-1抑制脂肪酸诱导的肝细胞脂化和细胞脂质毒性
脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪性肝病严重威胁国人健康，已被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。体外常采用脂肪酸(如，油酸(OA)和棕榈酸(PA))诱导法建立肝细胞脂化模型，该细胞模型可用于脂肪肝治疗药物的体外筛选和疗效评估。
我们采用人肝上皮细胞系L02细胞(购自ATCC)建立肝细胞脂化模型，油酸和棕榈酸均购自Sigma公司。L02细胞贴壁过夜后，分为对照组，OA/PA模型组(OA:PA按2:1混合配制成终浓度0.5mM的脂肪酸诱导培养基)，化合物HUBIN-1干预组(分别以50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再进行OA/PA诱导培养)。OA/PA诱导48小时后进行肝细胞脂化检测。或采用1mM棕榈酸刺激L02细胞建立肝细胞脂质毒性模型，分析化合物HUBIN-1(分别以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再进行PA刺激)对PA导致的细胞脂质毒性的干预效果，PA刺激24小时后采用MTS法分析细胞毒性。
实验结果：
OA/PA处理48小时后可诱导L02细胞出现明显的脂肪变性，化合物HUBIN-1预处理能显著减少L02细胞的脂肪变性程度；高浓度PA会导致明显的细胞脂质毒性，化合物HUBIN-1预处理能显著降低PA导致的细胞毒性，并呈剂量依赖性(图6)。
以上结果表明，化合物HUBIN-1能抑制脂肪酸诱导的肝细胞脂化和细胞脂质毒性，有潜在的脂肪肝疗效。
实施例9 化合物HUBIN-1促进肝星状细胞的凋亡
肝星状细胞(HSC)是肝纤维化/肝硬化过程中的主要效应细胞，当肝脏受到炎症等损伤时，HSC被激活，激活的HSC一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞。人肝星状细胞系LX2经诱导活化后可用于抗纤维化药物的体外筛选和疗效评估。
星孢菌素(STS)可用于HSC的诱导活化，而高剂量STS可诱导HSC的过度活化进而发生细胞凋亡。我们采用STS(购自MCE)诱导LX2细胞(购自ATCC)活化建立HSC活化—凋亡细胞模型。分为对照组，STS模型组(50nM)，化合物HUBIN-1干预组(分别以25μM、50μM、100μM的化合物HUBIN-1预处理1小时，再加STS刺激)。STS刺激24小时后收集细胞，采用BD的凋亡检测试剂盒进行流式细胞凋亡检测。
实验结果：
STS刺激24小时能诱导LX2细胞的晚期凋亡，化合物HUBIN-1预处理能进一步提高LX2细胞的晚期凋亡比例，并呈剂量依赖性(图7)。
以上结果表明，化合物HUBIN-1能促进STS诱导的HSC凋亡，具有潜在的抗纤维化疗效。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.化合物HUBIN-1在制备肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物中的用途，所述化合物HUBIN-1的结构式如式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物具备以下作用中的任一项或多项：
(1)能够降低ALT水平；(2)能够降低AST水平；(3)能够减轻肝细胞变性和坏死程度；(4)抑制肝细胞凋亡；(5)减少炎症细胞浸润；(6)抑制肝脏巨噬细胞/枯否细胞活化和炎症因子分泌；(7)抑制肝细胞脂化和细胞脂质毒性；(8)促进肝星状细胞的凋亡。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物具备以下作用中的任一项或多项：
(1)抗肝损伤；(2)抗炎症细胞浸润；(3)抗肝细胞脂化；(4)抗肝纤维化。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝脏炎症性疾病包括急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝脏炎症性疾病包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎。
6.一种肝脏炎症性疾病预防和/或治疗药物，含有安全有效量的化合物HUBIN-1，以及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述化合物HUBIN-1作为有效成分之一或唯一有效成分。
8.一种预防和/或治疗肝脏炎症性疾病的方法，包括步骤：将含有安全有效量的化合物HUBIN-1的药物施用于作用对象。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述肝脏炎症性疾病包括急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
10.化合物HUBIN-1的新用途，所述化合物HUBIN-1的结构式如式Ⅰ所示：
包括以下用途中的任一项或多项：(1)能够降低ALT水平；(2)能够降低AST水平；(3)能够减轻肝细胞变性和坏死程度；(4)抑制肝细胞凋亡；(5)减少炎症细胞浸润；(6)抑制肝脏巨噬细胞/枯否细胞活化和炎症因子分泌；(7)抑制肝细胞脂化和细胞脂质毒性；(8)促进肝星状细胞的凋亡。
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