CN106581673A - 消融免疫治疗 - Google Patents

Abstract

本文一般涉及免疫治疗，并且更具体地，涉及用于治疗肿瘤和病原体感染组织的免疫治疗的用途。所述免疫治疗涉及首先用设计为由Th1调节机制所排斥的同种异体细胞对患者进行预致敏，然后在肿瘤或病原体感染病灶中诱导原位坏死或细胞凋亡。坏死或细胞凋亡可通过施用于至少一部分肿瘤或病原体感染组织的方法(如冷冻治疗、不可逆电穿孔、化学治疗、放射治疗、超声治疗、乙醇化学消融、微波热消融、射频能量或其组合)来诱导。然后，将单剂量或多剂量的同种异体细胞(例如，Th1细胞)的剂量递送至经预致敏患者的肿瘤或病原体感染组织的范围内或附近。本发明提供了一种免疫治疗策略以发展对肿瘤或病原体的新型全身性(继发性)免疫力。

Description

消融免疫治疗

技术领域

本公开一般涉及免疫治疗，并且更具体地，涉及用于治疗肿瘤和病原体感染组织的治疗方法和组合物。

背景技术

利用免疫系统的力量来治疗慢性感染性疾病或癌症是免疫治疗的主要目标。主动免疫治疗是旨在激活免疫系统以特异性识别并破坏肿瘤或病原体感染细胞的方法。二百多年来，主动免疫治疗的方法已被用来防止大量感染性疾病，包括天花、狂犬病、伤寒、霍乱、鼠疫、麻疹、水痘、流行性腮腺炎、脊髓灰质炎、乙型肝炎和破伤风以及白喉毒素。

主动免疫治疗的概念现被用于开发以治疗现有肿瘤或预防肿瘤复发以及用于治疗和预防慢性病毒感染为目的的治疗性癌症疫苗。这些技术中很多已被证明成功地开发了循环系统中具有特异性杀死肿瘤或病原体感染细胞能力的提高频率的免疫细胞。然而，尽管存在产生抗肿瘤抗原活性的免疫细胞的能力，肿瘤逃逸机制仍能够压倒这种免疫应答，而导致最终的肿瘤进展。

经显示，癌症的主动免疫治疗在大量啮齿动物模型中是非常有效的。然而，人体内多种类型的免疫治疗临床试验几十年来令人失望的结果已经表明人体内免疫系统无法感知人类癌症细胞的威胁/危险，以及同一疾病的啮齿动物模型的免疫系统。

慢性病毒感染也相同。先天性免疫应答能够减缓病毒复制并能够激活可触发抗病毒蛋白合成的细胞因子。继发性免疫系统中和病毒颗粒并且破坏被感染细胞。但是，病毒已发展出一些应对策略以避免免疫攻击并保持所述免疫系统的活动靶标。

有必要提供一种能够克服肿瘤和病毒免疫逃避机制并且训练人体免疫系统来感知导致免疫应答的人体癌症细胞和病毒感染细胞的威胁/危险的主动免疫治疗，所述免疫应答可根除体内中可能位于任何位置的肿瘤或病原体感染细胞。

发明内容

本公开涉用于诱导针对肿瘤或病原体的全身性、继发性免疫应答的方法和组合物。所述方法采用同种异体细胞治疗与用于使肿瘤或病原体感染组织进行细胞窘迫的方法相结合，从而导致了肿瘤特异性抗原或病原体特异性抗原的释放。

一方面，本公开为一种用于诱导针对受试者体内肿瘤或病原体的继发性免疫应答的方法。该方法包含以下步骤：(1)将同种异体细胞的等分试样给药至患有癌症或感染性疾病的受试者，该同种异体细胞被设计为以诱导抗同种异体Th1免疫的方式被受试者免疫系统所排斥；(2)允许约7-14天的时间形成抗同种异体Th1免疫记忆后，以引起受试者体内至少一部分所述肿瘤或感染组织死亡(优选通过坏死)的消融方法(例如，通过诸如但不限于如电穿孔、冷冻消融、化学治疗、放射治疗、超声治疗、乙醇化学消融、微波热消融、射频能量或其组合的方法)对同一受试者体内可及的肿瘤病灶或病原体感染组织进行原位消融；然后，(3)在病灶内注射同一同种异体细胞的第二等分试样(如用于预致敏的相同细胞)(优选地在消融步骤之后2-24小时)，建立作为摄取抗原和响应于坏死或细胞凋亡组织的宿主抗原呈递细胞(即，树突细胞)的继发成熟的佐剂的免疫应答。然后来自病灶的成熟抗原呈递细胞迁移至淋巴结，并刺激全身性抗肿瘤或抗病原体免疫。另一方面，可以省略所述预致敏步骤。对来自肿瘤或病原体感染的组织进行原位消融，然后在所述消融后，将所述同种异体细胞的等分试样进行注射以建立所期望的免疫应答。

另一方面，本公开包含一种用于患者的针对抗肿瘤或病原体的疫苗。所述疫苗包含抗原性组合物，所述抗原性组合物包含来自所述肿瘤或病原体的抗原性物质和同种异体细胞的等分试样，其中向患者给药抗原性组合物建立了排斥反应并刺激了对于抗原的迟发型过敏性反应，从而在所述患者体内作为刺激全身性抗肿瘤或抗病原体免疫的佐剂。所述疫苗还可包含预致敏组合物，其中所述预致敏组合物包含同种异体细胞的等分试样。

另一方面，本公开包含一种给患者接种疫苗的方法。所述方法包含以下步骤：(1)向患有癌症或感染性疾病的受试者给药预致敏组合物，所述预致敏组合物包含被设计为以诱导抗同种异体Th1免疫的方式被所述受试者免疫系统所排斥的同种异体细胞的等分试样；(2)允许约7-14天的时间在所述受试者体内发展抗同种异体Th1免疫记忆后，注射(优选以皮内方式)含有肿瘤抗原或病原体抗原(例如减毒病毒、肿瘤溶菌产物、热休克蛋白)来源的抗原性组合物，优选地含有来自同一个体的感染或癌性组织的自体溶菌产物，所述溶菌产物优选含有伴侣蛋白，并且所述溶菌产物由同种异体细胞的等分试样(用于对患者进行预致敏的相同细胞)配制，从而建立排斥反应并刺激对作为刺激全身性抗肿瘤或抗病原体免疫的佐剂的同种抗原的迟发型过敏反应。另一方面，所述方法可在没有预致敏步骤的情况下实施。

另一个方面，本公开包含用于治疗患者体内肿瘤或病原体的治疗性组合物，其包含原位生成的肿瘤抗原或病原体抗原以及同种异体细胞，其中所述同种异体细胞和原位生成的抗原引发免疫应答，由此所述患者的抗原呈递细胞的继发成熟全身性刺激抗肿瘤或抗病原体免疫。所述肿瘤抗原或病原体抗原是从所肿瘤或病原体感染组织的坏死处原位生成的。所述治疗性组合物还可包含含有同种异体细胞的预致敏组合物。所述预致敏组合物和所述抗原性组合物中可包含约1×10⁸到约1×10¹⁰个细胞的所述同种异体细胞。

另一方面，本说明书包含用于治疗患体内的肿瘤或病原体的疫苗组合物，其包含原位生成的抗原和同种异体细胞，所述原位生成的抗原包含肿瘤抗原或病原体抗原，其中在原位生成抗原的存在下向患者注射同种异体细胞来建立免疫应答，由此所述患者的抗原呈递细胞的继发成熟全身性刺激抗肿瘤或抗病原体免疫。所述组合物中的所述肿瘤抗原来源于肿瘤的原位坏死。所述组合物中的所述病原体抗原来源于所述病原体感染组织的原位坏死。所述组合物还可以包含含有同种异体细胞的预致敏组合物。所述预致敏组合物和所述疫苗组合物中可包含约1×10⁸和约1×10¹⁰个细胞的所述同种异体细胞。

另一方面，本公开包含给患者接种疫苗的方法。所述方法包含以下步骤：(1)向患有癌症或感染性疾病的受试者给药预致敏组合物，所述预致敏组合物包含被设计为以诱导抗同种异体Th1免疫的方式被所述受试者免疫系统所排斥的同种异体细胞的等分试样；(2)允许约7-14天的时间在所述受试者体内发展抗同种异体Th1免疫记忆后，对所述肿瘤或病原体感染组织进行原位消融以释放肿瘤抗原或病原体抗原；(3)给药同种异体细胞的组合物(用于对所述患者进行预致敏的相同细胞)，从而建立排斥反应和刺激对作为刺激全身性抗肿瘤或抗病原体免疫的佐剂的同种抗原的迟发型过敏反应。另一方面，所述方法可在没有预致敏步骤的情况下实施。

具体实施方式

本公开包含一种用于刺激患者体内抗肿瘤或抗病原体免疫的方法。所述方法包含首先对患者进行“预致敏”以通过输注同种异体细胞的等分试样而发展Th1抗同种异体抗原免疫记忆。理想的是，同种异体细胞的输注刺激患者的免疫系统对所述同种异体细胞发生反应。在患者的免疫系统得以形成抗同种异体记忆之前可允许经过一定时间。在一些实施方案中，患者可能需要同种异体细胞的加强针(booster)以发展出适当的Th1免疫记忆。

本文所采用的患者不仅包含小鼠，也包含人类。本文所采用的Th1应答是指产生可激活T细胞和巨噬细胞的细胞因子谱(cytokine profile)。Th1应答与Th2应答不同，Th2应答主要激活依赖于抗体的免疫应答并且与Th1应答是相对立的。

在患者发展了足够的抗同种异体Th1免疫记忆之后，下一步骤包含在肿瘤床或病原体感染组织内的细胞损伤和/或死亡。组织损伤或死亡释放细胞组分并募集清除细胞至损伤部位。在组织损伤或组织死亡过程中由坏死引起的细胞组分的释放对原位生成肿瘤或病原体抗原是关键的。现有技术知晓在瘤床或病原体感染组织内引起组织损伤或死亡的多种方法。优选由可以引起将清除细胞募集至损伤部位的坏死而导致的死亡。在一些优选的实施方案中，组织死亡或损伤通过冷冻消融或通过不可逆电穿孔。可选地，对组织进行离体消融，并将释放的组分注射到患者体内。

清除细胞，包含未成熟树突状细胞，可以拾取(pick up)从受损或死亡组织中释放的抗原。为了引起用于抗原Th1免疫的预致敏的树突状细胞(DC)的成熟，将同种异体细胞的第二等分试样以病灶内方式进行注射。病灶内方式是指通过注射或其他方式直接将本发明的组合物给药至癌性区域或肿瘤或病原体感染组织内。在优选的实施方案中，所有给药至患者的同种异体细胞来自相同来源。优选地，在组织消融后约2至约24小时之间给药同种异体细胞。该方法尤其适用于实体或转移性肿瘤的治疗，具体地在患有位于前列腺、乳腺、骨、肝、肺或肾的肿瘤病灶的患者。

对于患者理想的是，基于引入同种异体细胞的第二等分试样而导致由于患者已经通过引入第一等分试样而预致敏了针对同种异体细胞的Th1免疫的事实而排斥该同种异体细胞，由此发展出强烈的迟发型过敏(DTH)反应。抗同种异体抗原DTH反应的旁观者效应(by-stander effect)可产生用来引起从受损组织收集并处理抗原的树突细胞成熟并迁移至引流淋巴结“危险信号”。组织损伤的诱导及DTH排斥反应的结合可建立引发针对从损伤组织所释放抗原的Th1免疫的炎性环境。

治疗过程所引起的炎症的一般状态可用于引发DC编程(program)T细胞为针对受损组织中造成针对肿瘤或病原体感染细胞的全身继发性免疫应答并使得肿瘤和病原体调节的免疫避免机制失效的抗原的Th1免疫。继发性免疫是指在暴露于抗原后由B和T细胞调节的患者防御，并且该防御表现出特异性、多样性、记忆性和自我/非我识别。该继发性免疫在患者体内是全身性的。继发性免疫与先天性免疫不同，先天性免疫是非特异性的并且在暴露于抗原之前就存在。

在一些实施方案中，消融后给药同种异体细胞可足以产生所期望的应答。换言之，可以省略用同种异体细胞的第一等分试样对患者进行的预致敏。在这些实施方案中，将肿瘤组织或病原体感染组织进行消融，然后注射同种异体细胞的等分试样。

本发明还包含一种给具有癌性细胞或感染组织的患者接种疫苗的方法。该方法可用于利用来自癌性细胞或感染组织中原位生成的抗原连同给药同种异体细胞给患者接种疫苗。这种方法也可用于患有血液恶性肿瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤)或病毒感染性疾病(例如，B或C型肝炎、疱疹、HIV)和消融不易评估的受影响病灶的其他疾病的患者。

所述方法包含首先对患者进行“预致敏”以通过输注同种异体细胞的第一等分试样而发展Th1抗同种异体抗原的免疫记忆。理想的是，同种异体细胞的输注刺激患者的免疫系统对所述同种异体细胞发生反应。在患者的免疫系统得以形成抗同种异体记忆之前可允许经过一定时间。在一些实施方案中，患者可能需要同种异体细胞的加强针以发展出适当的Th1免疫记忆。

下一步骤包含将患者的免疫系统暴露于来自除了本文所述的激活的同种异体细胞之外的癌性细胞或病原体感染组织的抗原。在优选的实施方案中，通过对癌性细胞/肿瘤或病原体感染组织进行消融而原位生成所述抗原。对所述肿瘤或所述病原体感染组织进行原位消融导致了患者体内肿瘤抗原或病原体抗原的释放。将同种异体细胞继而给药在病灶部位导致了通过建立患者体内排斥反应和刺激针对抗原的迟发型过敏反应的所期望的免疫反应。消融可通过冷冻消融、电穿孔或其他导致肿瘤或病原体感染组织的坏死性死亡的方法。

在其他实施方案中，所述预致敏步骤之后，所述方法可包含：将抗原性组合物给药至患者体内，所述抗原性组合物包含含有来自癌性细胞或感染组织的抗原的自体溶菌产物。该组合物还包含同种异体细胞的等分试样，即来自如在预致敏步骤中使用的同种异体细胞的相同来源的同种异体细胞。注射所述抗原性组合物可在患者体内建立排斥反应，并可刺激针对抗原的迟发型过敏反应。

清除细胞，包含未成熟树突状细胞，可以拾取由原位消融或由自体溶菌产物生成的抗原。所述同种异体细胞可引起用于抗原Th1细胞免疫的预致敏的树突状细胞成熟。对于患者理想的是，由于患者已经预致敏了针对在预致敏步骤中同种异体细胞的第一等分试样所引入的同种异体细胞的Th1免疫的事实，在坏死性病灶部位引入同种异体细胞而发展出强烈的迟发型过敏(DTH)反应。

治疗过程所引起的炎症的一般状态可用于引发DC编程(program)T细胞为针对消融部位中造成针对肿瘤或病原体感染细胞的全身继发性免疫应答并使得肿瘤和病原体调节的免疫避免机制失效的抗原的Th1免疫。

本公开还提供了一种用于增强弱免疫原性或无免疫原性肿瘤的免疫原性的方法和一种使免疫应答从非保护性免疫应答(例如，Th2应答)偏离到保护性免疫应答(例如，Th1)的方法。这种疾病包含，例如，所有类型的癌症和由多种病原体感染引起的疾病(如肝炎病毒、诸如曲霉、HIV、疟疾、伤寒、霍乱、疱疹病毒、衣原体和HPV的真菌感染)。

本发明还包含用于治疗患者体内肿瘤或病原体的治疗性组合物。所述治疗组合物优选包含同种异体细胞和原位生成的抗原，所述原位生成的抗原包含肿瘤坏死或病原体感染组织坏死的产物。所述治疗性组合物还可包含预致敏组合物。所述预致敏组合物通常含有注射到患者体内从而由所述患者的免疫系统以引起同种异体Th1免疫的方式产生排斥反应的同种异体细胞。

所述治疗性组合物包含来自肿瘤或病原体感染组织的抗原性物质和同种异体细胞的等分试样。在一些优选的实施方案中，所述抗原性物质是含有来自癌性细胞或来自感染组织的抗原所原位释放的抗原性物质。所述抗原性物质可源自肿瘤或病原体感染组织的组织坏死原位。优选地，抗原性物质源自肿瘤或病原体感染组织的消融。

所述消融可在体内、原位或离体进行。在一些实施方案中，抗原性物质包含基于对来自肿瘤或病原体感染组织中的组织进行消融而释放的热休克蛋白。

所述治疗性组合物还包含同种异体细胞。在具有原位生成抗原性物质的实施方案中，所述治疗组合物包含直接给药至含有原位生成抗原的病灶部位的同种异体细胞。将所述同种异体细胞注射到患者体内时，可建立排斥反应并刺激对抗原的迟发型过敏反应，从而作为刺激患者体内全身性抗肿瘤或抗病原体的免疫的佐剂。

所述治疗性组合物可包含作为由所述预致敏组合物和所述同种异体细胞所产生应答的佐剂的其他组分。所述预致敏组合物和同种异体细胞可包含通常存在于治疗性组合物的其他组分，例如，防腐剂。这些组分的加入在本发明的范围之内。

在一些实施方案中，治疗组合物可仅包含同种异体细胞和原位生成的抗原，而不包含所述预致敏组合物。获得所期望免疫应答可不需要所述预致敏组合物。

本发明还包含用于患者的针对肿瘤或病原体的疫苗组合物。所述疫苗优选包含预致敏组合物和抗原性组合物。所述预致敏组合物通常含有注射到患者体内从而由所述患者的免疫系统以引起同种异体Th1免疫的方式产生排斥反应的同种异体细胞。

所述抗原性组合物包含来自肿瘤或病原体感染组织的抗原性物质和同种异体细胞的等分试样。在一些实施方案中，所述抗原性物质是含有来自癌性细胞或来自感染组织的抗原的自体溶菌产物。所述抗原性物质可源自肿瘤或病原体感染组织的组织坏死。优选地，抗原性物质源自对肿瘤或病原体感染组织的消融。所述消融可以在体内或离体进行。在一些实施方案中，所述抗原性性物质包含基于对来自肿瘤或病原体感染组织中的组织进行消融而释放的热休克蛋白。所述抗原性组合物还包含同种异体细胞。所述抗原性物质和所述同种异体细胞可组合在一起或单独包装。

本发明还包含原位生成疫苗组合物。该疫苗中的抗原性物质是在原位生成的，并且将所述同种异体细胞作为佐剂给药至患者，优选地以病灶内方式。可以通过对患者释放所述抗原性物质的范围内的肿瘤或病原体感染组织进行消融实现原位产生抗原性物质。所述消融可通过冷冻消融、电穿孔或导致肿瘤或病原体感染组织的坏死性死亡的其他方法。

在一些具有原位生成抗原的实施方案中，给药至患者的抗原性组合物包含同种异体细胞，并且在含有所释放的抗原的坏死性病灶部位给药这些细胞。将所述同种异体组合物注射到患者体内时，可建立排斥反应并刺激针对抗原的迟发型过敏反应，从而作为刺激患者体内全身性抗肿瘤或抗病原体免疫的佐剂。

所述疫苗可包含作为由所述预致敏组合物和所述抗原性组合物产生应答的佐剂的其他组分。所述预致敏组合物和抗原性组合物可以包含通常存在于疫苗的其他组分，例如，防腐剂。这些组分的加入在本发明的范围之内。

在一些实施方案中，所述疫苗可以仅包含抗原性组合物，而不包含所述预致敏组合物。所述抗原性组合物可足以获得所期望的免疫应答。

本发明的治疗性疫苗可用于预防和治疗疾病，诸如通过抑制或逃避免疫应答而发展和/或持续的癌症或慢性病毒疾病。

预致敏步骤

预致敏步骤的目的是在患者体内建立抗同种异体Th1免疫，其可在再次暴露于同种抗原时被记起。通过将患者暴露于同种异体细胞的等分试样以及当对所述患者给药第二等分试样时由于免疫记忆所造成的由患者的免疫系统继对这些同种异体细胞排斥而发生预致敏。优选地，所述患者在预致敏之前不是免疫抑制的，因为这会抑制患者排斥所输注的同种异体细胞的能力，同时还会抑制抗同种异体抗原Th1免疫的发展。

在本发明的一个实施方案中，患者的免疫系统倾向于产生Th1免疫。优选控制同种异体细胞以发展对排斥同种异体细胞有应答的Th1免疫而不发展Th2免疫。在一个实施方案中，所述患者的免疫系统可倾向于产生通过给药产生Th1细胞因子(例如，IFN-γ和TNF-α)的同种异体细胞的Th1应答。Th1细胞因子可协助对同种异体抗原的免疫应答倾向Th1型免疫。使患者的免疫系统倾向于产生Th1免疫的其他方法也在本发明的范围之内。

用于首先对患者进行预致敏、然后用于病灶内给药(诱导细胞死亡后)或作为病原性或肿瘤物质的来源的佐剂的同种异体细胞优选地为同种异体激活T细胞、更优选地为同种异体激活CD4+ Th1细胞、更优选地为同种异体CD4+ T细胞，其已分化为效应器或记忆细胞并产生高水平的1型细胞因子(如IL-2、IL-15、IFN-γ、TNF-α)同时在细胞表面还表达(优选地以高密度)如CD40L、TRAIL和FasL的效应分子但不产生IL-4或其他2型细胞因子。先天免疫细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和NK细胞)的CD40连接具有诱导高水平的细胞因子IL-12的能力。IL-12使CD4+ T细胞向Th1型免疫极化，增强CD8+ T细胞的增殖，并激活NK细胞。这些促炎性事件可以基于所述患者免疫系统的排斥使对同种异体细胞上同种异体抗原的Th1免疫稳定发展。。

在所述预致敏步骤中，将激活的同种异体T细胞给药至患者，优选地以静脉内方式，但也可以以皮内方式给药。所述同种异体细胞优选来源于故意HLA错配供体。用于静脉内输注的同种异体细胞的等分试样的优选剂量为至少约1×10⁷个细胞，更优选为在约1×10⁸到1×10¹⁰个细胞之间。可初步产生免疫应答的该范围之外的同种异体细胞的剂量也在本发明的范围之内。

理想的是，在消融受影响的组织或给药抗原性组合物之前，对患者Th1抗同种异体抗原免疫的发展进行检测。Th1抗同种异体抗原免疫的发展可能至少需要约7天。优选地，使患者在约7天至约14天发展出Th1抗同种异体抗原免疫。可以通过，例如ELISPOT实验，测量Th1抗同种异体抗原免疫的发展。检测患者Th1抗同种异体抗原免疫的发展的其他方法也在本发明的范围之内。如果Th1抗同种异体抗原免疫弱，可以给药额外的同种异体细胞的加强针注射。优选地以皮内方式加强针注射以在皮肤内产生延迟型过敏(DTH)反应。

同种异体T细胞的产生

理想的是，可以产生同种异体T细胞，从而在激活和输注到患者体内后，所述患者可以产生Th1免疫。一种用于产生具有刺激抗同种异体Th1免疫所必需性质的同种异体细胞的优选方法包含：(1)通过去除正常筛选供体中白细胞来收集单核细胞来源物质；(2)从所述来源物质分离CD4+ T细胞；(3)在第0天、第3天和第6天用固定化抗CD3和抗CD28单克隆抗体(mAb)来激活CD4+细胞；(4)在第9天使用固定化的抗CD3和抗CD28单克隆抗体再次激活该细胞，并在激活的24小时内输注该细胞。

细胞死亡步骤

原位细胞死亡或细胞损伤导致将DC募集到病灶部位，并可提供由DC摄取的抗原源。优选的是，通过引起坏死的死亡过程来破坏靶标组织。坏死是指单个细胞或细胞群体的死亡使得大量细胞内组分被释放到环境中。对于本申请的目的，坏死包含通过多种方法(包括冷冻消融、不可逆电穿孔、化学治疗、放射治疗、超声治疗、乙醇化学消融、微波热消融、射频能量或其组合)的细胞死亡。坏死性杀死的细胞激活内源性窘迫信号，该窘迫负责DC和健康或细胞凋亡式死亡细胞不产生的刺激物的募集和成熟。此外，将未成熟DC暴露于这些刺激物提供了对引起局部和全身性Th1免疫关键的成熟信号。

在一个优选的实施方案中，为了通过坏死引起死亡，优选地在原位冷冻靶标组织。冷冻手术是一种能够应用液体氮气或氩气诱导组织性坏死的目标精准且受控制的程序。已经在体外和体内研究了在冷冻手术中和之后发生的生物学变化。冷冻细胞和由解冻细胞后发展出的血管淤塞引起组织损伤和坏死。已经知晓，冷冻手术(原位冷冻)引发能够产生针对冷冻组织的自体抗原的特异性免疫应答的抗原刺激物(可与由肠道外给药抗原而获得的相比较)。

冷冻消融法可使肽类从经过裂解的肿瘤或由DC处理的抗原的病原体感染细胞中释放出来，并建立促炎性细胞因子环境。冷冻消融后释放出的诸如IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的细胞因子能够激活T、NK细胞和对能够破坏癌症或病原体感染细胞的免疫应答必不可少的朗格汉斯(Langerhans)细胞。

在另一个优选的实施方案中，为了通过坏死引起死亡，优选地对靶标组织进行不可逆电穿孔。不可逆电穿孔法是通过不可逆细胞膜透化作用将微秒至毫秒的电脉冲递送至组织以产生细胞坏死的一种组织消融技术。在不可逆电穿孔法中，电极间细胞的细胞膜破裂从而引起细胞坏死。不可逆电穿孔法可使抗原从经过裂解的肿瘤或由DC处理的抗原的病原体感染细胞中释放出来，并建立促炎性细胞因子环境。

另一个用于产生抗原源的优选方法是从死亡感染组织或肿瘤中分离自体伴侣蛋白，也被称为热休克蛋白(HSP)。HSP在对细菌、真菌和寄生病原体的免疫应答的重要靶标中。在胞外环境中的某些伴侣蛋白由于其对伴侣多肽以及与宿主的免疫系统的相互作用的能力也可调节先天性和继发性免疫，具体地为专职性抗原呈递细胞。已表明，接种来自肿瘤的热休克蛋白可引发抗肿瘤应答。目前的研究表明，HSP免疫原性源自与其相关联的抗原性肽类。

Katsantis在美国专利No.6,875,849中描述了一种用于分离伴侣蛋白以用作抗原源的优选方法。Srivastava在美国专利No.6,797,480、No.6,187,312、No.6,162,436、No.6,139,841、No.6,136,315和No.5,837,251中描述了其他方法。

辅助步骤

辅助步骤的目的是引起DC成熟以刺激针对含有死亡靶标组织的病灶所摄取的抗原的Th1免疫。这可以通过注射相同同种异体细胞来实现，即如那些用于对患者进行预致敏的相同起源的同种异体细胞。所述同种异体细胞的等分试样，优选地，以病灶内方式注射，即直接进入由冷冻消融、或其他细胞死亡的方法所引起的坏死性病灶。可选地，当伴侣蛋白被用作抗原源时，将用于对患者进行预致敏的相同的同种异体细胞连同伴侣蛋白的注射，优选以皮内的方式。产生所期望的免疫应答的同种异体细胞的剂量通常为至少约1×10⁷个细胞，更优选地在约1×10⁸到1×10¹⁰个细胞之间。可生成所期望的免疫应答的该范围外的同种异体细胞的剂量也在本发明的范围之内。同种异体细胞的制备与上述相同。

为了启动免疫应答并且克服天然耐受性，免疫系统需要自(self)组织，坏死性细胞死亡后所释放出来的或与伴侣蛋白相关的抗原必需被DC摄取并且与标志“危险”的免疫激活组分一起呈递。针对同种异体细胞的记忆小免疫应答建立该“危险”。

组织常驻性DC(称为未成熟DC)能够从环境中捕获原位生成的抗原，但不足以刺激T细胞。在对病原体感染的应答以及继而发生的炎性应答中，DC经历称为成熟的分化过程，由此DC上调了迁移至引流淋巴结的能力并向T细胞呈递所捕获的抗原。为了激活Th1 CD4⁺T细胞和CTL，DC需要使若干成熟/分化刺激物完整(integrate)。在存在病原体或肿瘤的部位，暴露于病原体或肿瘤衍生的决定簇、促炎性细胞因子和/或细胞碎片诱导成熟过程的第一步骤。该成熟过程包含上调共刺激分子和趋化因子受体，由此DC分别获得向T细胞呈递抗原的能力以及迁移至淋巴结的能力。在淋巴结上，同源CD4⁺ T细胞的存在提供了针对DC的额外分化刺激物，从而调节激活T细胞的存活和CD4⁺T细胞的极化。

在抗原摄取部位发生DC成熟，并回忆性排斥反应作为提供适当的炎性危险信号的佐剂，该信号对DC成熟、向淋巴结的迁移以及针对病灶所摄取的抗原的Th1免疫的程序化是必要的。

实施例

动物

Balb/c小鼠是宿主，C57BL/6(B6)小鼠用作Th1细胞的来源。所有小鼠为6至10周龄，并饲养在保存在哈达萨-希伯来大学医学中心无特定病原体的设施中，并以经批准的动物实验方案进行处理。

制备同种异体Th1记忆细胞

从雄性C57BL/6小鼠收集脾脏细胞并用氯化铵-钾(ACK)缓冲液处理来裂解红细胞。每个脾脏中分离出约7千万到1亿个细胞。然后利用MS柱(Miltenyi Biotec，德国)上的CD4免疫磁性颗粒通过阳性选择(纯度>98％)对CD4+ T细胞进行纯化，分离出约8至12百万的CD4细胞，其产率为50-60％。以抗CD3和抗CD28包覆的顺磁性珠子(CD3/CD28T细胞扩增珠，Dynal/Invitrogen)按照初始珠子:CD4细胞为3:1的比例扩增而产生Th1记忆细胞。将经过纯化的CD4细胞与20IU/mL重组小鼠(rm)IL-2、20ng/ml的rm IL-7和10ng/mL的rm IL-12(Peprotech，新泽西州)和10μg/mL抗鼠IL-4mAb(Becton Dickenson)孵育在含有10％FBS、青霉素-链霉素-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)(Biological Industries，以色列)和3.3mM N-乙酰基-半胱氨酸(NAC，Sigma)(完全培养基)的RPMI1640培养基内。从第3天到第6天，每天向该CD4培养物添加具有rm IL-2和rm IL-7的额外的含细胞因子的完全培养基，以维持在0.5至1×10⁶个细胞/mL之间的细胞浓度。从第3天到第6天，每天添加额外的CD3/CD28珠。随着细胞的扩增，计算所加入珠子的数量以维持1:1的珠子:细胞的比例。在培养6天后，CD4细胞扩增约80至100倍，而且通过物理破裂和磁体上的传代以收获CD4细胞并从珠子上脱离下来。在实验中使用的所收获细胞的表型均大于95％的CD4+、CD45RO+、CD62L^lo、IFN-α+和IL-4-。

CD3/CD28纳米珠子的制备

生物素化小鼠抗CD3和抗CD28mAbs(BD Pharmingen)各自在400μL的PBS中稀释为25μg/ml的终浓度，然后以1:1的比例混合，使得最终体积为800μL。洗涤20μl的链霉亲和素包覆的纳米珠子(Miltenyi，德国)并在PBS中稀释为200μL的终体积。然后将800μL的CD3/CD28mAb溶液和200μL的经过稀释的纳米珠子进行混合，使得在1ml的总体积中每种mAb的终浓度为10μg/ml。在室温下，将混合物置于旋转混合装置上30分钟。然后将连接有mAb的纳米珠子通过磁体上的MS柱(Miltenyi，德国)，并充分洗涤。然后将留存的纳米珠从柱中释放并重悬于200μL的PBS中。纳米珠子无法激活幼稚T细胞。因此，纳米珠对所收获的Th1记忆细胞滴定(tittered)，所收获的Th1记忆细胞在6天前已经用CD3/CD28 T细胞扩增珠子(Dynal，挪威)预先进行了激活。虽然每批次略有不同，通常20μL/10⁷个细胞被发现提供预先经过激活的Th1记忆细胞的最佳激活。

CD3/CD28交联

在需要输注经过激活的Th1记忆细胞的实验中，在输注前将所收获的Th1细胞与预先浓度滴定的连接有CD3/CD28的纳米珠子进行孵育。为了达到最佳激活，所述细胞需要与所述纳米珠子进行最少4h和最多18h的培养。最佳激活引起IFN-α的产生以及细胞表面CD40L和FasL的上调。对于这些实验，CD3/CD28交联Th1记忆细胞的所有输注发生在预培养4-8h后。在输注前彻底清洗细胞，以消除任何无关纳米珠子。在这些实验中使用的交联Th1记忆细胞在细胞表面表达FasL和CD40L，并产生2000ng/ml/10⁶个细胞/6h的过量IFN-α和小于每10⁶个细胞/6h的20pg/ml的IL-4。无CD3/CD28交联的Th1记忆细胞不产生细胞因子或不表达FasL和CD40L。

冷冻治疗

用球形氧化亚氮冷冻探针(直径3mm)进行冷冻治疗。将气体保持在50巴的压力并且使焦耳-汤姆逊效应在组织中达到-30至-40℃的温度范围。在肿瘤的中心制造一个切口，冷冻探针被放置成与肿瘤接触(插入1-2mm深)：其目的是通过冷冻来影响肿瘤，但不完全地破坏它。三次循环的快速冷冻(持续20秒)，然后进行缓慢解冻。在病灶中心产生冰球，其达到约三分之二的总肿瘤体积。

实施例1

为了检测同种异体Th1细胞在广泛转移性疾病中刺激全身性抗肿瘤免疫的能力，测试了以下方案。将致死量的肿瘤细胞(包含BCL1白血病、4T1乳腺癌和3LL肺癌)在第0天静脉输注到小鼠体内，并且皮内注射肿瘤细胞建立实体肿瘤块。在第7天，给予小鼠1×10⁵剂量的同种异体Th1细胞。在第14天，肿瘤内注射：(a)生理盐水；(b)生理盐水+局部冷冻消融的肿瘤；(c)10³个细胞剂量的同种异体Th1细胞；或(d)同种异体Th1细胞+局部冷冻消融的肿瘤的任何一种来治疗小鼠。在第90天存活动物的结果如下所示(n＝10)：

实施例2

为了研究荷实体瘤患者的治疗是否可从本发明中受益，上述实验设计在只接受皮内注射肿瘤以建立实体肿瘤块的动物体内进行重复。该结果类似于从患有转移性疾病的那些动物所获得的结果。

Th1细胞与冷冻治疗的结合导致了高治愈率。冷冻治疗通过坏死杀死肿瘤，其被认为是比通过细胞凋亡的死亡(由化学治疗造成的死亡类型)更病理性的细胞死亡类型。据认为，冷冻治疗使肿瘤更具免疫原性，并因此同种异体Th1细胞与坏死性肿瘤死亡的结合建立了一种导致全身性抗肿瘤免疫的肿瘤疫苗类型。

尽管已参考优选实施方案描述了本发明，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明的精神和范围内可以做出形式和细节上的改变。

Claims (19)

1.一种用于治疗患者体内肿瘤或病原体的治疗组合物，包含：

同种异体细胞；和

包含肿瘤坏死或病原体感染组织坏死的产物的抗原，其中原位生成所述抗原，由此所述同种异体细胞和所述原位生成的抗原引发患者的免疫应答，以建立抗肿瘤或抗病原体免疫。

2.一种疫苗组合物，包含：

包含同种异体细胞的佐剂；和

由病变细胞或组织的坏死而原位生成的抗原，其中坏死部位存在的所述佐剂连同原位生成的抗原引发患者的免疫应答，以建立针对所述疾病的免疫。

3.根据权利要求1和2所述的组合物，进一步包含预致敏组合物，其中所述预致敏组合物包含同种异体细胞。

4.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述抗原是通过对所述肿瘤或病原体感染组织进行消融而原位生成的。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述消融通过冷冻消融。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述消融通过电穿孔。

7.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述抗原包含肿瘤或病原体抗原、热休克蛋白和其组合。

8.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述同种异体细胞是激活的T细胞。

9.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述同种异体细胞表达高水平的1型细胞因子。

10.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述同种异体细胞在所述细胞表面表达高密度的CD40L、TRAIL、FasL和其组合。

11.一种诱导患者体内针对肿瘤或病原体的继发性免疫应答的方法，所述方法包含：

从所述疾病或病原体感染中原位生成抗原；和

给药指向原位生成抗原的部位的同种异体细胞，从而建立作为从经消融组织摄取抗原的佐剂的免疫应答，由此所述患者的抗原呈递细胞的继发成熟全身性刺激抗肿瘤或抗病原体免疫。

12.根据权利要求11所述的方法，进一步包含：

在原位抗原产生前对患者给药预致敏组合物，所述预致敏组合物包含以诱导同种异体Th1免疫的方式被所述患者的免疫系统所排斥的同种异体T细胞；和

在原位抗原产生前使所述患者的免疫系统形成抗同种异体Th1免疫记忆。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗原是通过对所述肿瘤或病原体感染组织进行消融而原位生成的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述消融通过冷冻消融。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述消融通过电穿孔。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗原包含肿瘤或病原体抗原、热休克蛋白和其组合。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述同种异体细胞是同种异体T细胞。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述同种异体细胞表达高水平的1型细胞因子。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述同种异体细胞在所述细胞表面表达高密度的CD40L、TRAIL、FasL和其组合。