CN106566833A - 新基因mdl1及其定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人类线粒体新基因MDL1和MDL1AS的全长核苷酸序列及其表达量的定量检测方法，属于生物技术领域。基因MDL1的核苷酸序列为：1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；或2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。基因MDL1AS的核苷酸序列为：1)SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；或2)SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。MDL1和MDL1AS是调控线粒体基因表达的关键基因，线粒体供能是各种生命活动的基础，本发明验证了MDL1在多种肿瘤细胞中表达的显著性变化，有非常重要的临床检测和治疗价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及两个人类线粒体新基因MDL1和MDL1AS的全长序列，其表达量的检测方法以及应用。
背景技术
动物线粒体进化上极端保守，基本上包括2个rRNA，13个mRNA和22个tRNA编码基因。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，为生命活动提供能量。肿瘤等多种疾病的发生，需要短时间内大量的能量供给，因此离不开线粒体的异常复制和表达。但是，人们对于有关线粒体复制和表达等调控的分子机制的了解仍然处于初级阶段。直到2016年，南开大学高山和卜文俊等通过单分子转录组测序数据挖掘，在国际上首次发现了两个潜在的线粒体基因表达调控基因MDL1和MDL1AS，并通过多种实验手段确认了它们的全长序列。这两个基因来自一直以来被认为是不发生转录的线粒体基因组区域，称作D-Loop区。后来研究发现，动物线粒体D-Loop区普遍存在编码RNA的现象。进一步的实验又发现，MDL1基因在肿瘤等一些线粒体异常表达的组织或细胞中有显著性变化，因此，该基因有作为临床检测或治疗靶点的可能性。
发明内容
本发明的目的是在国际上首次设计提供一套简单的基于qRT-PCR的检测方法，检测MDL1基因和MDL1AS基因在各种组织或细胞中的表达量，以支持基础研究和临床检测。
所述的一种人类线粒体基因MDL1，其特征在于其核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
(2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。
所述的一种人类线粒体基因MDL1AS，其特征在于其核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或
(2)SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。
所述的基因MDL1转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于RNA反转引物由20个bp以上的接头序列(5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′)与18个Oligo(dT)组成。
所述基因MDL1转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于cDNA扩增需要如下任何一对引物：
(1)引物对1上游5′-CCACAGCACTTAAACACATCTCTGC-3′
引物对1下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(2)引物对2上游5′-AACACATCTCTGCCAAACCCCAA-3′
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(4)引物对4上游5′-ACACCAGCCTAACCAGATTTC-3′
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(5)引物对5上游5′-TGCACTTTTAACAGTCACCCC-3′
引物对5下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(6)引物对6上游5′-ACACATTATTTTCCCCTCCCACTCC-3′
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(7)引物对7上游5′-CCCCTCCCACTCCCATACTACTAAT-3′
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(8)引物对8上游5′-TAACCCCATACCCCGAACCAA-3′
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(9)引物对9上游5′-TATTTTCCCCTCCCACTCCCATACT-3′
引物对9下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
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(11)引物对11上游5′-CTTAAACACATCTCTGCCAAACCCC-3′
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(14)引物对14上游5′-CCGAACCAACCAAACCCCAAA-3′
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(15)引物对15上游5′-CAACCAAACCCCAAAGACACC-3′
引物对15下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(16)引物对16上游5′-TCTCTGCCAAACCCCAAAA-3′
引物对16下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(17)引物对17上游5′-GCACTTAAACACATCTCTGCC-3′
引物对17下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(18)引物对18上游5′-CTAACACCAGCCTAACCAGAT-3′
引物对18下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(19)引物对19上游5′-CGGTATGCACTTTTAACAGTCACCC-3′
引物对19下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(20)引物对20上游5′-ACACACACACCGCTGCTAA-3′
引物对20下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
所述基因MDL1AS转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于cDNA扩增需要如下任何一对引物：
(1)引物对1上游5′-CTATGTACTGTTAAGGGTGGGTAGG-3′
引物对1下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(2)引物对2上游5′-GGTGGCTTTGGAGTTGCAGTT-3′
引物对2下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(3)引物对3上游5′-GTTGAGGGTTGATTGCTGTACTTGC-3′
引物对3下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(4)引物对4上游5′-GGGGTTTTGATGTGGATTGGGT-3′
引物对4下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(5)引物对5上游5′-GGTACCGTACAATATTCATGGTGGC-3′
引物对5下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(6)引物对6上游5′-TACATAGCGGTTGTTGATGGGTGAG-3′
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(7)引物对7上游5′-TGGTACCCAAATCTGCTTCCC-3′
引物对7下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(8)引物对8上游5′-GCAGTTGATGTGTGATAGTTGAGGG-3′
引物对8下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(9)引物对9上游5′-ACTGTTAAGGGTGGGTAGGTTTG-3′
引物对9下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(10)引物对10上游5′-GTAGGTTTGTTGGTATCCTAGTGGG-3′
引物对10下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
所述的基因MDL1在检测线粒体表达异常中的应用。
所述的基因MDL1在肿瘤检测中的应用。
所述的基因MDL1AS在检测线粒体表达异常中的应用。
所述的基因MDL1AS在肿瘤检测中的应用。
所述的肿瘤，其特征在于包括肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、淋巴癌、前列腺癌和神经母细胞瘤。
本发明的实验证明，根据特殊设计的反转引物，从多种癌细胞系中通过qRT-PCR检测到MDL1和MDL1AS基因，通过癌细胞系与正常细胞的对比，发现MDL1基因在癌细胞中表达有显著变化。
附图说明
图1为MDL1基因在SH-SY5Y细胞系中的qRT-PCR产物的电泳图。
图2为MDL1基因在Hela细胞系中的qRT-PCR产物的电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
(1)细胞培养：肺癌(NCI-H460)、乳腺癌(MCF-7)、肝癌(HepG2)、宫颈癌(Hela)、淋巴癌(HTL-90)、前列腺癌(PC3)和神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞系利用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，每两天更换一次培养基，每四天传代一次。
(2)总RNA提取：参照试剂盒RNAiso Plus(TaKaRa，Japan)提取，共得到体积为25μL，浓度为1.3μg/μL的总RNA。
(3)RNA反转：从总RNA中取出0.8～1μgRNA，参照试剂盒PrimeScript RT ReagentKit with gDNA Eraser(TaKaRa，Japan)进行RNA反转，反转使用了40-nt长度的特殊引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-T18)。
(4)cDNA扩增：参照试剂盒SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa，Japan)进行cDNA扩增，使用的qRT-PCR仪器为德国Eppendorf公司生产的Mastercycler ep Realplex2。PCR条件为：95℃初始变性30s，40次PCR循环，每次循环(95℃变性10s，55℃退火10s然后68℃延伸20s)。扩增使用内参基因GAPDH(143-bp)，上下游引物分别为(ACATCGCTCAGACACCATG)和(TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG)。
(5)产物的确认：扩增产物通过凝胶电泳和Sanger测序两种手段进行确认。凝胶电泳使用1％的琼脂糖进行，缓冲液为TAE，电压8V/cm。Sanger测序采用双向测通的方法，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
(6)实验结果：结果表明基因MDL1和MDL1AS在多种肿瘤细胞系中显著表达(见图1和图2)，并且相对正常组织有显著改变。
Claims (10)
1.一种人类线粒体基因MDL1，其特征在于其核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
(2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。
2.一种人类线粒体基因MDL1AS，其特征在于其核苷酸序列为
(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或
(2)SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经替换、删除或插入一个或几个核苷酸形成的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述基因MDL1转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于RNA反转引物由20个bp以上的接头序列(5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′)与18个Oligo(dT)组成。
4.如权利要求1所述基因MDL1转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于cDNA扩增需要如下任何一对引物：
(1)引物对1上游5′-CCACAGCACTTAAACACATCTCTGC-3′
引物对1下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(2)引物对2上游5′-AACACATCTCTGCCAAACCCCAA-3′
引物对2下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(3)引物对3上游5′-AACAAAGAACCCTAACACCAGCC-3′
引物对3下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(4)引物对4上游5′-ACACCAGCCTAACCAGATTTC-3′
引物对4下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(5)引物对5上游5′-TGCACTTTTAACAGTCACCCC-3′
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(6)引物对6上游5′-ACACATTATTTTCCCCTCCCACTCC-3′
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(7)引物对7上游5′-CCCCTCCCACTCCCATACTACTAAT-3′
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(8)引物对8上游5′-TAACCCCATACCCCGAACCAA-3′
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(9)引物对9上游5′-TATTTTCCCCTCCCACTCCCATACT-3′
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(10)引物对10上游5′-AACCCTAACACCAGCCTAACCAG-3′
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(11)引物对11上游5′-CTTAAACACATCTCTGCCAAACCCC-3′
引物对11下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(12)引物对12上游5′-CTCCCACTCCCATACTACTAATC-3′
引物对12下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(13)引物对13上游5′-CATACCCCGAACCAACCAA-3′
引物对13下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(14)引物对14上游5′-CCGAACCAACCAAACCCCAAA-3′
引物对14下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(15)引物对15上游5′-CAACCAAACCCCAAAGACACC-3′
引物对15下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(16)引物对16上游5′-TCTCTGCCAAACCCCAAAA-3′
引物对16下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(17)引物对17上游5′-GCACTTAAACACATCTCTGCC-3′
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(18)引物对18上游5′-CTAACACCAGCCTAACCAGAT-3′
引物对18下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(19)引物对19上游5′-CGGTATGCACTTTTAACAGTCACCC-3′
引物对19下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(20)引物对20上游5′-ACACACACACCGCTGCTAA-3′
引物对20下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′。
5.如权利要求2所述基因MDL1AS转录的RNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于cDNA扩增需要如下任何一对引物：
(1)引物对1上游5′-CTATGTACTGTTAAGGGTGGGTAGG-3′
引物对1下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(2)引物对2上游5′-GGTGGCTTTGGAGTTGCAGTT-3′
引物对2下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(3)引物对3上游5′-GTTGAGGGTTGATTGCTGTACTTGC-3′
引物对3下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(4)引物对4上游5′-GGGGTTTTGATGTGGATTGGGT-3′
引物对4下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
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(6)引物对6上游5′-TACATAGCGGTTGTTGATGGGTGAG-3′
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(7)引物对7上游5′-TGGTACCCAAATCTGCTTCCC-3′
引物对7下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(8)引物对8上游5′-GCAGTTGATGTGTGATAGTTGAGGG-3′
引物对8下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(9)引物对9上游5′-ACTGTTAAGGGTGGGTAGGTTTG-3′
引物对9下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
(10)引物对10上游5′-GTAGGTTTGTTGGTATCCTAGTGGG-3′
引物对10下游5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′。
6.如权利要求1所述基因MDL1在检测线粒体表达异常中的应用。
7.如权利要求1所述基因MDL1在肿瘤检测中的应用。
8.如权利要求2所述基因MDL1AS在检测线粒体表达异常中的应用。
9.如权利要求2所述基因MDL1AS在肿瘤检测中的应用。
10.如权利要求7和9所述的肿瘤，其特征在于包括肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、淋巴癌、前列腺癌和神经母细胞瘤。
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| WO2016063122A1 (en) * | 2014-10-20 | 2016-04-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for screening a subject for a cancer |
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