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CN106536569A - 可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 - Google Patents

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 Download PDF

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CN106536569A
CN106536569A CN201580040034.6A CN201580040034A CN106536569A CN 106536569 A CN106536569 A CN 106536569A CN 201580040034 A CN201580040034 A CN 201580040034A CN 106536569 A CN106536569 A CN 106536569A
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程琼
R.迪科斯莫
A.奥维汉德
游正
M.S.帕伊内
赖建平
K.鲁伊布林格-贾斯斯
S.C.罗斯曼
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EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明提供酶促制备的可溶性α‑葡聚糖纤维组合物，其适于用作食物和饲料应用中的耐消化纤维。所述可溶性α‑葡聚糖纤维组合物可与一种或多种附加的食物成分共混以制备包含纤维的组合物。本发明还提供了包含所述可溶性α‑葡聚糖纤维的组合物的制备和使用方法。

Description

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月29日提交的，标题为“Enzymatic Synthesis of SolubleGlucan Fiber”的美国临时申请62/004305的优先权和权益，其公开内容以引用方式全文并入本文。
以引用方式并入的序列表
在2015年5月13日创建并且与本文一起提交的，以大小为636,928字节的名称为“20150515_CL6036WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”文件提供的序列表以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及可溶性α-葡聚糖纤维，包含所述可溶性纤维的组合物，以及制备和使用所述可溶性α-葡聚糖纤维的方法。所述可溶性α-葡聚糖纤维是在上胃肠道中高度耐消化的，在下胃肠道中表现出可接受的产气率，作为膳食纤维具有良好的耐受性，并且具有一种或多种通常与可溶性膳食纤维相关联的有益特性。
背景技术
膳食纤维(可溶性和不可溶性两者)是对于健康、消化和预防病症诸如心脏病、糖尿病、肥胖症、憩室炎和便秘重要的营养物质。然而，大多数人不食用每日推荐摄入的膳食纤维。2010年美国人膳食纤维指南(美国农业部和美国卫生和人类服务部，Dietary Guidelines for Americans，2010，第7版，Washington，DC：美国政府印刷局，2010年12月)报道了膳食纤维摄入不足是成人和儿童的公共健康问题。因此，仍然需要增加每日膳食纤维摄入量，尤其是适用于多种食物应用的可溶性膳食纤维。
历史上，膳食纤维被定义为植物中固有的和完整的非消化性碳水化合物和木质素。该定义已经扩展到包括不被人的上消化道中的内源酶显着水解，并且另外不被存在于下消化道中的微生物显着发酵的碳水化合物聚合物。可溶性寡糖纤维产物(诸如果糖、葡聚糖的低聚物等)当前用于多种产品应用中。然而，许多可商购获得的可溶性纤维具有不可取的特性诸如低耐受性(造成不可取的效果诸如腹部胃气胀或气体、痢疾等)、缺乏耐消化性、高成本或制备方法需要至少一个酸催化的热处理步骤以将更易消化的糖苷键(例如葡聚糖中的α-(1，4)键)随机重排为具有更耐消化性的键的更高度支化的化合物。仅使用天然存在的酶以由安全和容易获得的底物，诸如蔗糖合成适宜的葡聚糖纤维的方法可能对消费者更具吸引力。
各种菌种具有由蔗糖合成右旋糖酐低聚物的能力。Jeanes等人(JACS(1954)76：5041-5052)描述了由96种细菌菌株制备的右旋糖酐。右旋糖酐被报道包含显著百分比(50-97％)的α-(1，6)糖苷键与不同量的α-(1，3)和α-(1，4)糖苷键。未报道存在于单独菌株内的酶(数量和类型两者)，并且在某些菌株中的右旋糖酐特征表现出可变性，其中由每种菌种产生的右旋糖酐可以是由每种菌种产生的多于一种酶的产物。
属于葡糖苷水解酶家族70的葡糖基转移酶(葡聚糖蔗糖酶；GTF)能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡聚糖蔗糖酶通过形成的糖低聚物的类型进一步分类。例如，右旋糖酐蔗糖酶是产生主要具有α-(1，6)糖苷键的糖低聚物(“右旋糖酐”)的那些，并且变聚糖蔗糖酶是趋于产生具有富含α-(1，3)糖苷键的主链的不溶性糖低聚物的那些。变聚糖蔗糖酶由常见氨基酸来表征。例如，A.Shimamura等人(J.Bacteriology，(1994)176：4845-4850)研究了GTF与变异链球菌(Streptococcus mutans)GS5的结构-功能关系，并且识别了影响由GTF合成的葡聚糖产物的性质的多个氨基酸位置，其中产生α-(1，3)-和α-(1，6)-异头键的相对量的变化。罗伊糖蔗糖酶(Reuteransucrases)趋于产生富含α-(1，4)、α-(1，6)和α-(1，4，6)糖苷键的糖低聚物，并且交替蔗糖酶是趋于产生具有由交替的α-(1，3)和α-(1，6)糖苷键组成的直链主链的糖低聚物的那些。这些酶中的一些能够在不同程度上引入其它糖苷键，常常作为支化点。V.Monchois等人(FEMS Microbiol Rev.，(1999)23：131-151)讨论了提出的多种葡聚糖蔗糖酶的作用机制和结构-功能关系。H.Leemhuis等人(J.Biotechnol.，(2013)163：250-272)描述了葡聚糖蔗糖酶的特征性三维结构、反应、机制和α-葡聚糖分析。
描述使用葡聚糖蔗糖酶(野生型、截短型或其变体)制备糖低聚物的专利和公布的专利申请的非限制性列表已被报道用于右旋糖酐(美国专利4,649,058和7,897,373；以及美国专利申请公布2011-0178289A1)、罗伊糖(reuteran)(美国专利申请公布2009-0297663A1和美国专利6,867,026)、交替糖和/或麦芽交替糖低聚物(“MAO”)(美国专利7,402,420和7,524,645；美国专利申请公布2010-0122378A1；和欧洲专利EP1151085B1)、α-(1，2)支链右旋糖酐(美国专利7,439,049)、和包含α-(1，3)、α-(1，6)和α-(1，3，6)键的混合物的混合键糖低聚物(缺乏交替糖样主链)(美国专利申请公布2005-0059633A1)。授予Kol-Jakon等人的美国专利申请公布2009-0300798A1公开了表达产生改性淀粉的变聚糖蔗糖酶的基因改性的植物细胞。
已经报道了使用葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶的组合来酶促制备异麦芽糖、异麦芽寡糖和右旋糖酐。美国专利2,776,925描述了用于酶促制备中间分子量的右旋糖酐的方法，所述方法包括右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的同时作用。美国专利4,861,381A描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的组合酶促制备包含39-80％异麦芽糖的组合物。Goulas等人(Enz.Microb.Tech(2004)35：327-338)描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶由蔗糖批量合成异麦芽寡糖(IMO)。美国专利8,192,956公开了使用重组表达的杂交基因酶促制备用于临床应用的异麦芽寡糖(IMO)和低分子量右旋糖酐，所述杂交基因包含融合在一起的编码α-葡聚糖酶的基因和编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其中葡聚糖酶基因是来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)的基因，其中右旋糖酐蔗糖酶基因是来自明串珠菌属(Leuconostoc sp.)的基因。
Hayacibara等人(Carb.Res.(2004)339：2127-2137)描述了突变酶和右旋糖酐酶对由来自牙斑中蔗糖的糖基转移酶形成的葡聚糖的产生和结构的影响。报道的研究目的在于评价在突变酶和右旋糖酐酶存在下(单独的或组合的)由GTF合成的葡聚糖的产量和结构，试图阐明在牙斑形成期间可发生一些相互作用。
突变酶(葡聚糖内切-1，3-α-葡聚糖水解酶)由一些真菌(包括木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和枝孢菌属(Cladosporium))以及一些细菌(包括链霉菌属(Streptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus))产生。W.Suyotha等人(Biosci，Biotechnol.Biochem.，(2013)77：639-647)描述了域结构和域缺失对来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)KA-304的α-1，3-葡聚糖水解酶的活性的影响。Y.Hakamada等人(Biochimie，(2008)90：525-533)描述了多种突变酶的域结构分析，并且提出了突变酶的系统发育树。I.Shimotsuura等(Appl.Environ.Microbiol.，(2008)74：2759-2765)报道了来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)菌株RM1的突变酶的生物化学和分子特征，其中N末端域具有强突变结合活性但不具有突变酶活性，然而C末端域负责突变酶活性但具有显著低于完整蛋白的突变结合活性。C.C.Fuglsang等人(J.Biol.Chem.，(2000)275：2009-2018)描述了重组真菌突变酶(内切葡聚糖酶)的生物化学分析，其中所述真菌突变酶由NH2末端催化域和假定的COOH末端多糖结合域构成。
包含α-(1，6)糖苷键的葡聚糖可由麦芽糊精酶促产生。已经报道来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的酶糊精右旋糖酐酶(“DD酶”；E.C.2.4.1.2；有时在替代方案中称为“右旋糖酐糊精酶)由麦芽糊精底物合成右旋糖酐。DD酶催化α-(1，4)连接的供体底物(即，麦芽糊精)的非还原端葡糖基残基转移至生长的α-(1，6)受体分子的非还原端。Naessans等人(J.Microbiol.Biotechnol.(2005)32：323-334)总结了来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶和右旋糖酐。
其他人已经研究了糊精右旋糖酐酶的特性。Kimura等人(JP2007181452(A))和Tsusaki等人(WO2006/054474)两者公开了糊精右旋糖酐酶。Mao等人(Appl.Biochem.Biotechnol.(2012)168：1256-1264)公开了来自氧化葡糖杆菌DSM-2003的糊精右旋糖酐酶。Mountzouris等人(J.Appl.Microbiol.(1999)87：546-556)公开了通过氧化葡糖杆菌NCIB 4943的细胞悬浮液由麦芽糊精制备右旋糖酐的研究。
授予Okada等人的JP4473402B2和JP2001258589公开了使用来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶与α-葡糖苷酶的组合制备右旋糖酐的方法。将所选的α-葡糖苷酶用于水解麦芽糖，其被报道为针对右旋糖酐合成具有抑制性。
还已经描述了“GtfB-型”α-葡糖基转移酶，其使用α-(1，4)连接的葡聚糖寡糖底物代替蔗糖以产生具有α-(1，6)糖苷键的葡聚糖寡糖。授予Dijkhuizen等人的美国专利申请公布2012-0165290描述了来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的GtfB α-葡糖基转移酶，以及其在以下方法中的用途，所述方法用于通过在适当的反应条件下使包含至少两个α-(1，4)连接的D-葡萄糖单元的多糖和/或寡糖底物与GtfB接触，制备具有一个或多个α-(1，6)糖苷键和一个或多个连续的α-(1，4)糖苷键的葡聚糖寡糖的混合物。
已经报道了对右旋糖酐的α-(1，2)支化的酶促加成。来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)NRRL B-1299的葡萄糖基转移酶(DsrE)具有能够向右旋糖酐添加α-(1，2)支链的第二催化域(“CD2”)(美国专利7,439,049和5,141,858；公布的美国专利申请公布2009-0123448；以及Bozonette等人，J.Bacteriol.(2002)184(20)：5723-573)。美国专利申请公布2010-0284972公开了通过施用包含α-(1，2)支化的α-(1，6)右旋糖酐的组合物改善受试者的健康的方法和组合物。Sarbini等人(Appl.Envion.Microbiol.(2011)77(15)：5307-5315)描述了由人粪便微生物群体外发酵右旋糖酐和α-(1，2)支化的右旋糖酐。Brison等人(J.Biol.Chem.，(2012)287(11)：7915-7924)描述了来自肠膜明串珠菌NRRL B-1299的DsrE葡糖基转移酶的截短形式(偶联到第二催化域CD2的葡聚糖结合域(GBD)(即，GBD-CD2))，其能够将α-(1，2)支链加到右旋糖酐中。
本领域中已经报道了各种糖低聚物组合物。例如，美国专利6,486,314公开了α-葡聚糖，其包含至少20个，最多至约100,000个α-葡糖酐单元，其中38-48％为4-连接的葡糖酐单元，其中17-28％为6-连接的葡糖酐单元，并且7-20％为4，6-连接的葡糖酐单元，和/或葡萄糖-寡糖，其包含至少两个4-连接的葡糖酐单元、至少一个6-连接的葡糖酐单元和至少一个4，6-连接的葡糖酐单元。美国专利申请公布2010-0284972A1公开了用于改善受试者的健康的组合物，其包含α-(1，2)-支化α-(1，6)低聚右旋糖酐。美国专利申请公布2011-0020496A1公开了支链糊精，所述糊精具有以下结构的，其中葡萄糖或异麦芽寡糖通过α-(1，6)糖苷键连接至糊精的非还原端，并且具有10至52的DE。美国专利6,630,586公开了支链麦芽糊精组合物，其包含22-35％(1，6)糖苷键；还原糖含量为＜20％；多分散性指数(Mp/Mn)＜5；并且数均分子量(Mn)为4500g/mol或更小。美国专利7,612,198公开了可溶性、高度支化的葡萄糖聚合物，其具有小于1％的还原糖含量，介于13％和17％之间的α-(1，6)糖苷键的含量和具有介于0.9×105和1.5×105道尔顿之间的值的分子量，其中所述可溶性高度支化的葡聚糖聚合物具有以下支链长度分布曲线：70至85％的聚合度(DP)小于15，10至14％的DP介于15和25之间，并且8至13％的DP大于25。
糖低聚物和/或包含所述低聚物的碳水化合物组合物已经被描述为适于用作食物应用中的可溶性纤维的来源(美国专利8,057,840和美国专利申请公布2010-0047432A1和2011-0081474A1)。美国专利申请公布2012-0034366A1公开了低糖、包含纤维的碳水化合物组合物，其被报道为适于用作食物产品中的传统玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和其它甜味剂的替代物。
仍然需要开发新型可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其耐消化，耐下消化道中的微生物的发酵、具有低粘度、并且适用于食物和其它应用中。优选地，α-葡聚糖纤维组合物可使用已经与在人类中安全使用相关联的酶由蔗糖酶促制备。
发明内容
本发明提供一种包含α-(1，2)支链的α-葡聚糖可溶性纤维组合物，其适用于多种应用，包括但不限于食物应用、改善胃肠健康的组合物和个人护理组合物。可溶性纤维组合物可直接用作食物中的成分或可掺入适用于食物应用的碳水化合物组合物中。
本发明还提供一种制备可溶性葡聚糖纤维组合物的方法。
本发明还提供了在食物应用中使用可溶性纤维组合物或包含所述可溶性纤维组合物的碳水化合物组合物的方法。在某些方面，提供一种改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量将本发明可溶性纤维组合物施用于受试者从而发挥通常与可溶性膳食纤维相关联的至少一种健康益处，诸如改变食物的热量含量、降低食物的血糖指数、改变粪便重量、改变胆固醇代谢、并且可提供益生元效果。
本发明提供一种水溶性纤维组合物，其基于干固体计包含以下物质：
a.下列的范围：
i.0％至50％的α-(1，3)糖苷键；或
ii.0％至40％的α-(1，4)糖苷键；或
iii.i)和ii)的任意组合；
b.1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合；
c.0-25％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.少于99％的α-(1，6)糖苷键；
e.小于300kDa的重均分子量；
f.在20℃下，在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
g.小于20％的消化度，如分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
i.小于26的多分散性指数。
在一个实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于10％的还原糖。
在另一个实施方案中，如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物中的α-(1，3)糖苷键和α-(1，3，6)糖苷键的总和在3至50％的范围内。
在另一个实施方案中，如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含15-35％的α-(1，4)糖苷键。
在另一个实施方案中，提供一种碳水化合物组合物，其包含：0.01至99重量％(基于干固体)的如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种食物产品、个人护理产品或药学产品，其包含如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或碳水化合物组合物。
在另一个实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.蔗糖；
ii.具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；和
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
c.任选地，分离α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个的实施方案中，上述方法还包括步骤(d)：将α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的反应条件下使蔗糖与至少一种葡糖基转移酶或至少一种葡糖基转移酶和至少一种葡聚糖水解酶的组合接触，从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的含水反应条件下使麦芽糊精底物与以下物质接触：
i.糊精右旋糖酐酶或
ii.糊精右旋糖酐酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合；
从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物主链与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将(b)的反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.糊精糊精酶；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
iv.蔗糖；和
v.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而形成包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物；以及
c.任选地，将步骤(b)的α-葡聚糖纤维组合物分离。
在另一个实施方案中，提供一种制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括向食物或饮料中掺入本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种抑制哺乳动物中血糖含量升高的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种降低哺乳动物活体中脂质的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种治疗哺乳动物便秘的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加和/或支链脂肪酸产生减少。
在另一个实施方案中，提供一种低龋性组合物，其包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
在另一个实施方案中，还提供了本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
生物序列简述
下面的序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(2009)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政规程的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1为来自肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides)J18的葡糖基转移酶的氨基酸序列，如以 gi：356644413报道的，其具有2771个氨基酸。
SEQ ID NO：2为来自肠膜明串珠菌NRRL 1299的DsrE蛋白质的氨基酸序列，如以 gi：23320943报道的(Bozonnet等人，J.Bacteriol.184：5763(2002))。
SEQ ID NO：3为编码成熟肠膜明串珠菌肠膜亚种J18 GtfJ18蛋白质的多核苷酸序列，其不具有在大肠杆菌(E.coli)BL21 DE3中表达的天然信号序列(其中所得的重组产生蛋白质的菌株被称为“EC0059”)。
SEQ ID NO：4为成熟肠膜明串珠菌肠膜亚种J18 GtfJ18蛋白质的氨基酸序列，本文中被称为“成熟GtfJ18”或“EC0059”(来自产生蛋白质的对应的大肠杆菌菌株)。
SEQ ID NO：5为编码来自肠膜明串珠菌肠膜亚种J18的GtfJ18蛋白质的截短型式的多核苷酸序列，其包括葡聚糖结合域(GBD)的部分和具有α-(1，2)支化活性的CD2催化域(SEQ ID NO：7的氨基酸残基1664-2771)，如在大肠杆菌BL21 DE3菌株中表达的，本文中被称为“EC0059T1”。
SEQ ID NO：6为具有α-(1，2)支化活性的截短的GtfJ18蛋白质的氨基酸序列，本文中被称为“gtfJ18T1”或“EC0059T1”(产生截短的蛋白质的对应大肠杆菌菌株)。
SEQ ID NO：7为仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)HS-6 Gtf-S葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：357235604中(具有天然信号序列的前体)，本文中也称为“GTF5604”。来自仓鼠链球菌的葡糖基转移酶的相同的氨基酸序列以 gi：4691428报道。因此，该特定氨基酸序列在本文中也被称为“GTF1428”。另选地，酶还可在本文中被称为SG1018(来自用于表达GTF5604的对应枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株)。
SEQ ID NO：8为编码仓鼠链球菌HS-6GtfS葡糖基转移酶GTF5604的全长野生型序列的多核苷酸序列(包括天然信号序列)，其在芽孢杆菌表达载体pHYT中克隆并表达。
SEQ ID NO：9为汗毛链球菌(Streptococcus downei)GtfS葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：121729(具有天然信号序列的前体)，在本文中也称为“GTF1729”或“SG1006”(表达GTF1729的对应枯草芽孢杆菌菌株)。
SEQ ID NO：10为衍生自 gi：345526831的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)M18葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也被称为“GTF6831”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列取代。酶还可在本文中被称为“SG1031”(是指表达GTF6831的对应枯草芽孢杆菌菌株)。
SEQ ID NO：11为衍生自 gi：22138845的远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF8845”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列(SEQ ID NO：34)取代。酶还可在本文中被称为“SG1051”(是指表达GTF8845的对应枯草芽孢杆菌菌株)。
SEQ ID NO：12为编码截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF0088”或“SG1066”(是指表达GTF0088的对应枯草芽孢杆菌菌株)。
SEQ ID NO：13为衍生自 gi：335358117的动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)KCTC 3501葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF8117”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列取代。酶还可在本文中被称为“SG1115”(是指表达GTF8817的对应枯草芽孢杆菌菌株)。
SEQ ID NO：14为变异链球菌NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：290580544中的。
SEQ ID NO：15为编码截短的变异链球菌NN2025 Gtf-B( gi：290580544)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：16为截短的变异链球菌NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“0544葡糖基转移酶”或“GTF0544”)。
SEQ ID NO：17为唾液链球菌Gtf-J葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：47527中的。
SEQ ID NO：18为编码唾液链球菌成熟Gtf-J葡糖基转移酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：19为唾液链球菌Gtf-J成熟葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“7527葡糖基转移酶”或“GTF7527”)。
SEQ ID NO：20为编码在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的腐殖质类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)突变酶的核酸序列( gi：257153265，其中 gi：257153264为对应多核苷酸序列)。
SEQ ID NO：21为在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达的成熟腐殖质类芽孢杆菌突变酶的氨基酸序列( gi：257153264；本文称为“3264突变酶”或“MUT3264”)。
SEQ ID NO：22为编码马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)18224TM突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：23为马尔尼菲青霉18224TM突变酶的氨基酸序列( gi：212533325；本文中也称为“3325突变酶”或“MUT3325”)。
SEQ ID NO：24为质粒pTrex的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：25为编码来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的糊精右旋糖酐酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：26为由氧化葡糖杆菌的菌株表达的糊精右旋糖酐酶(EC 2.4.1.2)的氨基酸序列，本文中称为“DD酶”(参见JP2007181452(A))。
SEQ ID NO：27为大肠杆菌malQ的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：28为大肠杆菌malS的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：29为大肠杆菌malP的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：30为大肠杆菌malZ的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：31为大肠杆菌amyA的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：32为终止序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：33为接头序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：34为用于表达载体中的枯草芽孢杆菌AprE信号肽的氨基酸序列，所述表达载体偶联到各种酶以在枯草芽孢杆菌中表达。
SEQ ID NO：35-43和52-67为各种葡糖基转移酶的核酸序列和氨基酸序列。
SEQ ID NO：44-51为各种突变酶的核酸序列和氨基酸序列。
SEQ ID NO：35为唾液链球菌Gtf-L葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：662379中的。
SEQ ID NO：36为编码截短的唾液链球菌Gtf-L( gi：662379)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：37为截短的唾液链球菌Gtf-L葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“2379葡糖基转移酶”或“GTF2379”)。
SEQ ID NO：38为唾液链球菌Gtf-I葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：450874中的。
SEQ ID NO：39为编码截短的远缘链球菌Gtf-I( gi：450874)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：40为截短的远缘链球菌Gtf-I葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“0874葡糖基转移酶”或“GTF0874”)。
SEQ ID NO：41为链球菌属C150 Gtf-S葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：495810459中的(先前称为 gi：.322373279)
SEQ ID NO：42为编码截短的链球菌属C150 Gtf-S( gi：495810459)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：43为截短的链球菌属C150 Gtf-S葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“0459葡糖基转移酶”、“GTF0459”、“3279葡糖基转移酶”或“GTF3279”)。
SEQ ID NO：44为编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：45为构巢曲霉FGSC A4突变酶的氨基酸序列( gi：259486505；本文中也称为“6505突变酶”或“MUT6505”)。
SEQ ID NO：46为编码琼楠木霉(Hypocrea tawa)突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：47为美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的琼楠木霉突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“琼楠木霉突变酶”)。
SEQ ID NO：48为编码长枝康宁木霉(Trichoderma konilangbra)突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：49为美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的长枝康宁木霉突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“长枝康宁木霉突变酶”)。
SEQ ID NO：50为编码里氏木霉(Trichoderma reesei)RL-P37突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：51为美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的里氏木霉RL-P37突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“里氏木霉592突变酶”)。
SEQ ID NO：52为编码截短的口腔链球菌(Streptococcus oralis)葡糖基转移酶的核酸序列( gi：7684297)。
SEQ ID NO：53为编码截短的口腔链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF4297”。
SEQ ID NO：54为编码变异链球菌葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列( gi：24379358)。
SEQ ID NO：55为编码截短的变异链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF9358”。
SEQ ID NO：56为编码解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列( gi：32597842)。
SEQ ID NO：57为编码截短的解没食子酸链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF7842”。
SEQ ID NO：58为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：51574154中的。
SEQ ID NO：59为编码罗伊氏乳杆菌葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列( gi：51574154)。
SEQ ID NO：60为编码截短的罗伊氏乳杆菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，本文中称为“GTF4154”。
SEQ ID NO：61为衍生自 gi：1054877的格氏链球菌(Streptococcus gordonii)葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF4877”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列取代。
SEQ ID NO：62为汗毛链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：121724中的。
SEQ ID NO：63为编码截短的汗毛链球菌( gi：121724)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：64为截短的汗毛链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“1724葡糖基转移酶”或“GTF1724”)。
SEQ ID NO：65为Streptococcus dentirousetti葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于 gi：167735926中的。
SEQ ID NO：66为编码截短的Streptococcus dentirousetti( gi：167735926)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：67为截短的Streptococcus dentirousetti葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“5926葡糖基转移酶”或“GTF5926”)。
SEQ ID NO：68为来自罗伊氏乳杆菌 gi：189485784的“GTFB-型”葡糖基转移酶的氨基酸序列(也称为“4，6-α-葡聚糖转移酶)，其在结构上涉及能够由麦芽寡糖合成直链异麦芽糖/麦芽寡糖的家族70的葡糖苷水解酶葡聚糖蔗糖酶(GH70)的成员。
SEQ ID NO：69为来自罗伊氏乳杆菌ML1 gi：357208772的4，6-α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列，其在结构上涉及能够由麦芽寡糖合成直链异麦芽糖/麦芽寡糖的家族70葡糖苷水解酶葡聚糖蔗糖酶(GH70)的成员。
SEQ ID NO：70为来自罗伊氏乳杆菌JCM 1112 gi：189485784的4，6-α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列，其在结构上涉及能够由麦芽寡糖合成直链异麦芽糖/麦芽寡糖的家族70葡糖苷水解酶葡聚糖蔗糖酶(GH70)的成员。
SEQ ID ON：71为多糖奈瑟球菌(Neisseria polysaccharea)淀粉蔗糖酶(E.C.2.4.1.4)( gi：4107260)的氨基酸序列，其能够使用以下反应，由蔗糖和1，4-α-D-葡糖基底物合成麦芽寡糖：
具体实施方式
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。
如本文所用，在本发明的元素或组分之前的词语“一个”、“一种”和“这个”旨在表明元素或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或更多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”意在包括由“基本由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本由……组成”包含”意在包括术语“由……组成”所涵盖的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰成分或反应物的数量时是指数值量的变化，该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中等等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有的范围均包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2&4-5”、“1-3&5”等等。
如本文所用，术语“得自”应当是指源材料(例如，蔗糖)，其能够得自特定来源，但不必须限于所述特定来源。
如本文所用，术语“有效量”将是指适于实现期望效果的所用的或所施用的物质量。物质的有效量可根据应用变化。本领域技术人员将通常能够在不进行实验的情况下确定特定应用或受试者的有效量。
如本文所用，术语“分离的”是指物质呈自然界中不存在的形式或环境。分离的物质的非限制性示例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从一种或多种或所有所述物质在自然界中与之缔合的天然存在的成分中至少部分地移除的任何物质，包括但不限于任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于存在于自然界中的物质，通过人工改性的任何物质；或者(4)通过相对于与所述物质天然缔合的其它成分，增加所述物质的量来改性的任何物质。
如本文所用，术语“非常低至没有消化度”、“很少或没有消化度”、和“低至无消化度”将是指如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”，McCleary等人，(2010)J.AOAC Int.，93(1)，221-233)所测量的可溶性葡聚糖纤维的消化度的相对水平；其中很少或没有消化度将是指基于干固体计(d.s.b.)，小于12％的可溶性葡聚糖纤维组合物是可消化的，优选地小于5％可消化，更优选地小于1％可消化。在另一方面，消化度的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维检测定，IntegratedTotal Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012，J.AOAC Int.，95(3)，824-844)测定。
如本文所用，术语“水溶性”将是指由在25℃下在pH 7的水中以20重量％或更高可溶解的纤维构成的本发明的葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“可溶性纤维”、“可溶性葡聚糖纤维”、“α-葡聚糖纤维”、“甘蔗糖纤维”、“葡萄糖纤维”、“可溶性膳食纤维”和“可溶性葡聚糖纤维组合物”是指由水溶性葡萄糖低聚物构成的本发明纤维组合物，其所述低聚物具有3或更大的葡聚糖聚合度，其为耐消化的(即表现出非常低至没有消化度)，在人小肠中具有很少或没有吸收，并且在下消化道中至少部分地可发酵。可溶性葡聚糖纤维组合物的消化度使用AOAC方法2009.01测量。本发明可溶性纤维通过将α-(1，2)糖苷键加至在主链中包含有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物(“主链”)中获得。在一个实施方案中，α-(1，6)葡聚糖底物中的α-(1，6)键的有效量为以分子计，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％或所有α-糖苷键。在一个实施方案中，本发明可溶性葡聚糖纤维组合物由可得自例如甘蔗和/或糖用甜菜的蔗糖(α-D-吡喃葡萄糖基β-D-呋喃果糖苷；CAS#57-50-1)酶促合成。在另一个实施方案中，具有有效量的α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物(“主链”)使用酶诸如糊精右旋糖酐酶由可得自经加工的淀粉的麦芽糊精来合成，其中使用蔗糖酶源和具有α-(1，2)支化活性的多肽添加α-(1，2)糖苷键。在一个实施方案中，首先合成α-葡聚糖底物，然后与具有α-(1，2)支化活性的多肽接触(顺序反应设计)。在另一个实施方案中，负责合成α-葡聚糖底物主链的酶和具有α-(1，2)支化活性的多肽存在于使用有效量蔗糖的相同反应混合物中(即，同时反应)。在一个实施方案中，同时反应包含能够用作糊精右旋糖酐酶底物的合适的麦芽糊精，能够合成包含有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖的糊精右旋糖酐酶，具有α-(1，2)支化活性的多肽，以及用于附加的α-(1，2)支化的有效量的蔗糖。在另一个实施方案中，上述顺序或同时反应还可包含具有内切水解的α-葡糖苷酶(例如具有内切水解活性的突变酶或糊精酶)。在优选的实施方案中，选择用于合成α-葡聚糖底物“主链”的酶以产生α-葡聚糖底物，其包含1至50％的α-(1，3)糖苷键，多于10％但少于40％的α-(1，4)糖苷键，或它们的任意组合，只要具有α-(1，2)支化活性的多肽可将α-(1，2)糖苷键引入α-葡聚糖底物即可。
如本文所用，“重均分子量”或“Mw”计算为
Mw＝∑NiMi 2/∑NiMi；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。
重均分子量可通过诸如静态光散射、小角中子散射、X射线散射和沉降速度的技术来测定。
如本文所用，“数均分子量”或“Mn”是指样本中所有聚合物链的统计平均分子量。数均分子量计算为Mn＝∑NiMi/∑Ni；其中Mi为链的分子量并且Ni为所述分子量的链数。聚合物的数均分子量可通过如下技术来测定：诸如凝胶渗透色谱法，通过(Mark-Houwink方程)测定粘度，和依数法诸如蒸气压渗透压、端基测定或质子NMR。
如本文所用，“多分散性指数”、“PDI”、“不均匀性指数”、“分散性”是指给定聚合物(诸如葡萄糖低聚物)样本中分子质量分布的量度，并且可通过将重均分子量除以数均分子量来计算(PDI＝Mw/Mn)来计算。
应当注意，如本文所用，术语“葡聚糖”和“吡喃葡萄糖”被认为是同义词并可互换使用。类似地，用于本文的术语“葡糖基”和“吡喃葡糖基”被认为是同义词并可互换使用。
如本文所用，“糖苷键(glycosidic linkages)”或“糖苷键(glycosidic bonds)”是指连接糖低聚物(寡糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。糖苷键的示例可包括具有以下键的α-连接的葡萄糖低聚物：1，6-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，6)键或简称为“α-(1，6)”键)；1，3-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，3)键或简称为“α-(1，3)”键)；1，4-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，4)键或简称为“α-(1，4)”键)；1，2-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1，2)键或简称为“α-(1，2)”键)；以及通常与支链糖低聚物缔合的此类键的组合。
如本文所用，“α-葡聚糖底物主链”、“葡聚糖主链”、“葡聚糖底物主链”、“底物主链”或简单地“主链”将是指α-葡聚糖底物，其在合适的含水反应条件下，在蔗糖存在时，由具有α-(1，2)支化活性的多肽作用于其上，其中反应的纯结果是将至少一个α-(1，2)连接的葡聚糖加入底物主链中。通常，在引发支化反应之前，葡聚糖底物主链主要由α-1(，6)糖苷键组成。在一个实施方案中，在引发支化反应之前，葡聚糖底物主链基本上是直链的，其主要具有α-1(，6)糖苷键并且将通常具有少于1％的α-(1，2)键；尤其是在已经合成葡聚糖底物主链之后进行支化反应时。一旦引发支化反应，具有α-(1，2)支化反应的多肽就将α-(1，2)连接的葡萄糖残基加入葡聚糖主链。因为在反应期间可加入多个α-(1，2)连接的葡萄萄残基，所以葡聚糖底物主链将具有增加量的(按总键的百分比计)α-(1，2)连接的葡聚糖残基。因此，合适的α-葡聚糖底物主链可具有大于1％的α-(1，2)键，只要具有α-(1，2)支化活性的多肽能够将附加的α-(1，2)连接的葡聚糖加入底物主链中即可。前提条件是，具有α-(1，2)支化活性的多肽将不包括能够添加不是α-(1，2)糖苷键的糖苷键的催化活性域。在引发酶促α-(1，2)支化反应之前，α-葡聚糖底物主链将具有至少3的DP并且将具有至少50％，优选地至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的α-(1，6)键。在一个实施方案中，
如本文所用，术语“葡聚糖蔗糖酶”、“葡糖基转移酶”、“葡糖苷水解酶70型”、“GTF”和“GS”是指分类为通常存在于乳酸菌诸如链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weisella)或乳杆菌属(Lactobacillus)中的糖苷-水解酶家族70的转葡糖苷酶(参见，Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡糖基转移酶可通过特征性结构识别，诸如Leemhuis等人(J.Biotechnology(2013)162：250-272)和Monchois等人(FEMS Micro.Revs.(1999)23：131-151)中所述的那些。取决于GTF酶的特异性，可形成包含各种糖苷键诸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直链和/或支链葡聚糖。一些葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表可包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。特异性受体还可包括例如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。所得葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。葡糖基转移酶的示例以氨基酸SEQ ID NO：1，2，4，6，7，9，10，11，12，13，14，16，17，19，35，37，38，40，41，43，53，55，57，58，60，61，62，64、和67提供。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶包含选自7，9，10，11，12，13，14，16，以及它们的任意组合的氨基酸序列；其中SEQ ID NO：6为能够将α-(1，2)支链加到适宜的α-葡聚糖底物主链的葡糖基转移酶的截短型式。在另一个实施方案中，使用至少一种葡糖基转移酶与至少一种具有内切水解活性的α-葡聚糖水解酶(诸如本文所述的突变酶和糊精酶)的组合以合成α-葡聚糖底物“主链”，其可使用至少一种具有α-(1，2)支化活性的多肽(即，SEQ ID NO：6)改性。
如本文所用，术语“Gtf-B型”葡聚糖蔗糖酶将是指具有4-6-α-葡糖基转移酶活性的多肽，诸如GtfB-型葡糖基转移酶，通常来自罗伊氏乳杆菌的菌株。示例包括但不限于SEQID NO：68、69和70。应当注意，来自变异链球菌的Gtf-B葡糖基转移酶(SEQ ID NO：14，16)最初注释为Gtf-B，但不认为是本文中被称为“Gtf-B型”葡糖基转移酶的那些，因为其不具有4，6-α-葡糖基转移酶活性。
如本文所用，术语“淀粉蔗糖酶”将是指结构上涉及GH70葡糖基转移酶的酶(E.C.2.4.1.4)，其能够使用以下反应由蔗糖和1，4-α-D-葡糖基底物合成麦芽寡糖：
蔗糖+(1，4-α-D-葡糖基)nD-果糖+(1，4-α-D-葡糖基)n+1。
淀粉蔗糖酶的示例为多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶( gi：4107260；本文作为SEQ ID NO：71提供)。
如本文所用，术语“具有α-(1，2)支化活性的多肽”或“具有α-(1，2)支化活性的酶催化剂”将是指催化活性的葡糖基转移酶(或其片段)，其能够将α-(1，2)糖苷键引入(使用蔗糖作为底物)具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物“主链”上。在一个实施方案中，具有α-(1，2)支化活性的多肽为截短的葡糖基转移酶，其包含能够将α-(1，2)支链加入α-葡聚糖底物主链的催化域。在一个实施方案中，能够增加α-(1，2)支化的催化域还包含至少一个葡聚糖结合域。优选地，具有α-(1，2)支化活性的多肽是截短的葡糖基转移酶，其中不存在能够合成不是α-(1，2)糖苷键的键(即，主链合成域或“CD1”域存在于下列酶中：诸如来自肠膜明串珠菌肠膜亚种的GtfJ18葡糖基转移酶，参见 gi：356644413(SEQID NO：1)和来自肠膜明串珠菌RRL-1299的DsrE葡糖基转移酶，如 gi：23320943中报道的；SEQ ID NO：2)。在一个优选的实施方案中，具有α-(1，2)支化活性的多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同一性的氨基酸序列。在另一个优选的方面，具有α-(1，2)支化活性的多肽基本上由与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同一性的氨基酸序列组成。
如本文所用，术语“异麦芽寡糖”或“IMO”是指基本上由通常具有DP 2至20的平均尺寸的α-D-(1，6)糖苷键构成的葡聚糖低聚物。异麦芽寡糖商业上可由α-淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶和α-葡糖苷酶对玉米淀粉或淀粉衍生物产物的酶促反应制成。可商购获得的产品包括异麦芽寡糖(DP在3至8的范围内，例如异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、异麦芽八糖)的混合物，并且还可包括潘糖。
如本文所用，术语“右旋糖酐”是指包含至少95％的α-D-(1，6)糖苷键(通常具有在支化点处的最多5％的α-D-(1，3)糖苷键)的水溶性α-葡聚糖，如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”)所测量的，其多于10％是可消化的。右旋糖酐常常具有大于1000kDa的平均分子量。如本文所用，能够由蔗糖合成右旋糖酐的酶可描述为“右旋糖酐蔗糖酶”(EC 2.4.1.5)。
如本文所用，术语“变聚糖”是指水不溶性α-葡聚糖，其主要包含(存在50％或更多的糖苷键)的1，3-α-D糖苷键并且通常具有常常大于9的聚合度(DP)。能够由蔗糖合成包含大于50％的1，3-α-D糖苷键的变聚糖或α-葡聚糖低聚物的酶可被描述为“变聚糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)，前提条件是所述酶不产生交替糖。
如本文所用，术语“交替糖”是指在至少50％的直链寡糖主链内具有交替的1，3-α-D糖苷键和1，6-α-D糖苷键的α-葡聚糖。能够由蔗糖合成交替糖的酶可描述为“交替蔗糖酶”(EC 2.4.1.140)。
如本文所用，术语“罗伊糖”是指在支化点处包含1，4-α-D-糖苷键(通常＞50％)；1，6-α-D-糖苷键；以及4，6-二取代的α-葡糖基单元的可溶性α-葡聚糖。能够由蔗糖合成罗伊糖的酶可描述为“罗伊糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)。
如本文所用，术语“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”将是指能够水解α-葡聚糖低聚物的酶。如本文所用，葡聚糖水解酶可由针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性来定义。示例可包括但不限于右旋糖酐酶(EC 3.2.1.1；能够内切水解α-(1，6)-连接的糖苷键)、突变酶(EC 3.2.1.59；能够内切水解α-(1，3)-连接的糖苷键)和交替糖酶(EC 3.2.1.-；能够内切水解裂解交替糖)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
如本文所用，术语“右旋糖酐酶”(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.11)是指能够内切水解1，6-α-D-糖苷键的酶(主要存在于右旋糖酐中的键)。已知右旋糖酐酶可用于多种应用中，包括用作用于预防龋齿、斑块和/或牙垢的牙粉中的成分和用于水解原糖果汁或甘蔗和糖用甜菜的糖浆。已知多种微生物能够产生右旋糖酐酶，其中为青霉属(Penicillium)、拟青霉属(Paecilomyces)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)、穗孢属(Spicaria)、轮枝孢属(Verticillium)、蠕孢菌属(Helminthosporium)和毛壳霉属的真菌(Chaetomium)；乳酸菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、噬细胞菌属(Cytophaga)、枯草芽孢杆菌(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)和黄杆菌属(Flavobacterium)的细菌，以及酵母如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)。食物级右旋糖酐酶是可商购获得的。食物级糊精酶的示例为 Plus L，由Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark出售的来自毛壳菌的酶。
如本文所用，术语“突变酶”(葡聚糖内切-1，3-α-葡糖苷酶；EC 3.2.1.59)是指水解切断1，3-α-D-糖苷键(主要存在于变聚糖中的键)的酶。突变酶购自多种细菌和真菌源。突变酶的示例以SEQ ID NO：21，23，45，47，49，51，以及它们的任意组合提供；其中优选SEQID NO：21、23以及它们的组合。
如本文所用，术语“交替糖酶”(EC 3.2.1.-)是指内切水解裂解交替糖的酶(授予Cote等人的U.S.5,786,196)。
如本文所用，术语“野生型酶”将是指包含氨基酸序列的酶(其全长和活性截短形式)，如在获得和/或注释的生物体中存在的。所述酶(其全长或催化活性截短形式)可在微生物宿主细胞中重组产生。取决于微生物宿主，可引入微小的修改(通常N-端或C-端)以有利于所需酶以活性形式表达。所述酶通常在用作制备本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物中的加工助剂之前纯化。在一个方面，使用同时存在于反应体系中的至少两种野生型酶的组合以便获得本发明的可溶性葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“底物”和“合适的底物”将是指α-葡聚糖底物主链，其能够在含水反应条件下，在蔗糖存在下由具有α-(1，2)支化活性的多肽改性(即，添加至少一个α-(1，2)糖苷键)。α-葡聚糖底物主链可在酶促引入α-(1，2)支链的步骤之前合成(并且任选地分离)或者可在α-(1，2)支化酶的存在下同时合成(即，在有效量蔗糖存在下，在具有α-(1，2)支化活性的多肽的相同反应混合物中进行葡聚糖底物主链合成)。可以各种方式制备α-葡聚糖底物，其包括但不限于(1)在蔗糖的存在下由至少一种葡糖基转移酶合成(使用不同于具有α-(1，2)支化活性的多肽的多肽)，(2)使用具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽，“Gtf-B型”GH70葡糖基转移酶或它们的组合，由得自淀粉或蔗糖的麦芽糊精合成(例如，使用淀粉蔗糖酶由蔗糖合成麦芽糊精底物)，(3)在至少一种α-葡聚糖水解酶(即，右旋糖酐酶、突变酶或它们的组合)的存在下，使用方法(1)和/或(2)合成，以及(4)以及(1)、(2)或(3)的任意组合，只要α-葡聚糖底物主链能够被具有α-(1，2)主链活性的多肽作用即可。在另一个实施方案中，α-葡聚糖底物可在α-(1，2)支化步骤之前合成，或可与α-(1，2)直链同时合成(即，具有α-(1，2)支化活性的多肽和有效量的蔗糖存在于含水反应混合物中)。在使用上述实施方案中任一种合成α-葡聚糖主链的情况下，“底物”可以为蔗糖、麦芽糊精或它们的组合；任选地在一个或多个附加受体的存在下。在另一个实施方案中，底物组合物还可包含一个或多个受体，诸如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。在一个优选的方面，α-葡聚糖底物主链包含至少50％的α-(1，6)糖苷键。在另一个优选的实施方案中，α-葡聚糖底物主链包含1至50％的α-(1，3)糖苷键。
在一个实施方案中，使用至少一种能够形成葡萄糖低聚物的葡糖基转移酶与在相同反应混合物中的至少一种α-葡聚糖水解酶的组合(即，它们在反应混合物中同时存在并是活性的)合成α-葡聚糖底物主链。因此，α-葡聚糖水解酶的“底物”是由蔗糖通过葡糖基转移酶在反应体系中同时合成的葡萄糖低聚物。在一个方面，其中酶不在反应混合物中同时使用的两种酶法(即，至少一种葡糖基转移酶(GTF)和至少一种α-葡聚糖水解酶)通过条件从本发明方法中排除。
如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物与酶在其中发生接触的材料(合适的底物)和水。合适的反应组分可由多种酶构成。在一个方面，合适的反应组分包括至少一种具有α-(1，2)支化活性的多肽、蔗糖、和至少一种具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物。在“主链”中具有有效量的α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物可由下列合成：(1)使用至少一种葡聚糖蔗糖酶的蔗糖，(2)由已经接触至少一种糊精右旋糖酐酶、至少一种“Gtf-B型”葡糖基转移酶、以及它们的组合的经加工的淀粉或蔗糖获得的麦芽糊精，或者(3)它们的任意组合。具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物“主链”可在酶促添加α-(1，2)支链之前合成或可在包含至少一个具有α-(1，2)支链的多肽的相同反应混合物中同时合成，前体条件是具有α-(1，2)支化活性的多肽与用于合成具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物“主链”的酶不同。在另一个方面，使用以下物质制备向其中添加α-(1，2)支链的α-葡聚糖底物“主链”：单一葡聚糖蔗糖酶、葡聚糖蔗糖酶的组合、至少葡聚糖蔗糖酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、糊精右旋糖酐酶、“GtfB型”葡糖基转移酶(即，4，6-α-葡聚糖转移酶；Kralj等人，Appl.Env.Microbiol.(2011)77(22)：8154-8163)、糊精右旋糖酐酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、“GtfB-型”葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、以及它们的任意组合。
如本文所用，“一个单位的葡聚糖蔗糖活性”或“一个单位的葡糖基转移酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与200g/L蔗糖温育时，转化1μmol蔗糖/分钟的酶量。蔗糖浓度使用HPLC确定。
如本文所用，“一个单位的右旋糖酐酶活性”定义为当在与pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL右旋糖酐底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定盒测定(Lever M.，(1972)，A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates，Anal.Biochem.47，273-279)。
如本文所用，“一个单位的突变酶糖酶活性”定义为当在与pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL变聚糖底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定盒测定(Lever M.，同上)。
如本文所用，“一个单位的糊精右旋糖酐酶活性”定义为当在pH 4.65和30℃下与25g/L麦芽糊精(DE 13-17)温育时，消耗1umol的淀粉葡糖苷酶可消化的葡萄糖当量所需的酶量。淀粉葡糖苷酶可消化的葡萄糖当量通过在pH 4.65和60℃利用黑曲霉淀粉葡糖苷酶(目录号A7095，Sigma，0.6单位/mL)处理30分钟，之后HPLC定量在淀粉葡糖苷酶处理时形成的葡萄糖。
如本文所用，术语“酶催化剂”是指包含酶和酶的组合的催化剂，其具有获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物的必要活性。在一个实施方案中，酶可另选地被称为“具有特定活性的多肽”。在某些实施方案中，可需要酶催化剂的组合以获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物。酶催化剂可以呈完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶的形式。酶催化剂可以为野生型酶的截短型式，只要维持期望的活性即可。在某些实施方案中，酶催化剂还可以是化学改性的(诸如通过聚乙二醇化或通过与交联剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将酶催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。
如本文所用，“药用的”是指所考虑的化合物或组合物适用于与人和其它动物的组织接触，但不具有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等，与合理的益处/风险比相称。
如本文所用，术语“寡糖”是指包含介于3和约30个由α-糖苷键连接的单糖单位的均聚物。
如本文所用，术语“多糖”是指包含大于30个由α-糖苷键连接的单糖单位的均聚物。
如本文所用，术语“食物”广义地用于本文以包括多种物质，所述物质可被人类消化，其包括但不限于饮料、乳制品、烘焙食物、能量棒、果冻、果酱、谷物、膳食补充剂和药用胶囊或片剂。
如本文所用，术语“宠物食物”或“动物饲料”广义地用于本文以包括多种物质，其可被非人类动物消化，并且可包括例如狗粮、猫粮和家畜饲料。
如本文所用，“个人护理产品”是指用于美容处理毛发、皮肤、头皮和牙齿的产品，其包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部治疗物。在一些特别优选的实施方案中，这些产品用于人体，而在其它实施方案中，这些产品用于由非人类动物美容使用(例如在某些兽医应用中)。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：
本领域普通技术人员将认识到，可以进行本文公开的氨基酸序列的改性，同时保留与所公开的氨基酸序列相关的功能。例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。例如，本文所公开的氨基酸序列中任何特定氨基酸可以取代另一功能等同的氨基酸。为了本发明目的，将取代定义为在以下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族非极性残基或弱极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸取代谷氨酸)或一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。所提出的修饰中的每一者均完全在本领域常规技术内，由所编码的产物的生物活性的保留决定。
如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情况。
如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”是指体外装配组分核苷酸。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员能预期成功的基因表达的可能。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。
如本文所用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不同时天然可见的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中处于其天然位置的原生基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是它通过基因转移引入到宿主生物中。外来基因可包含插入到非天然生物内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组的基因。
如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即，该编码序列处于该启动子的转录控制下时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNa)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”、“重组”或“转化”生物。
如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Accelrys Software Corp.，San Diego，CA)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))以及并入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，甲roc.Int.Symp.](1994)，开会日期1992，111-20。编辑：Suhai、Sandor.出版社：Plenum，NewYork，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的结构特性和功能特性
人胃肠酶容易识别和消化具有大量α-(1，4)糖苷键的直链α-葡聚糖低聚物。用交替的键诸如α-(1，2)、α-(1，3)和α-(1，6)替代这些键通常减小α-葡聚糖低聚物的消化度。增加支化度(使用交替键)也可降低相应的消化度水平。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物(包含α-(1，2)支链)使用一种或多种酶促加工助剂由蔗糖(蔗糖)和合适的α-葡聚糖底物主链制备，所述酶促加工助剂具有来自微生物的基本上与存在于自然界中相同的氨基酸序列(或其活性截短形式)，所述微生物具有长期暴露于人类的历史(天然存在于口腔中或存在于食物如啤酒、发酵的大豆等中的微生物等)和/或公认为是安全的(GRAS)那些。可溶性纤维具有低消化度至没有消化度，表现出高耐受性(即，如由可接受的气体形成量所测量的)、低粘度(能够在宽范围食物应用中使用)、和至少部分地可被肠道菌群发酵，提供可能的益生元效应(例如，增加据报道与提供潜在的益生元效应相关的双歧杆菌和乳酸菌的数量和/或活性)
取决于所选择的酶，适用于与本发明具有α-(1，2)支化活性的多肽一起使用的α-葡聚糖底物主链可由蔗糖、麦芽糊精、或它们的组合合成。用于制备适用于α-(1，2)支化反应的α-葡聚糖底物主链的酶可包括葡糖基转移酶(使用蔗糖)、4，6-α-葡聚糖水解酶(使用麦芽糊精/麦芽寡糖)、糊精右旋糖酐酶(使用麦芽糊精/麦芽寡糖)，其各自可单独使用或与一种或多种α-葡聚糖水解酶组合使用(例如，右旋糖酐酶、突变酶等)。麦芽糊精/麦芽寡糖可由经加工的淀粉制备或使用淀粉蔗糖酶由蔗糖合成。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物由以下参数的组合来表征：
a.下列的范围：
a)0％至50％的α-(1，3)糖苷键；或
b)0％至40％的α-(1，4)糖苷键；或
c)a)和b)的任意组合。
b.1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合；
c.0-25％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.少于99％的α-(1，6)糖苷键；
e.小于300kDa的重均分子量；
f.在20℃下，在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
g.如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量的小于20％的消化度；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
i.小于26，优选小于5的多分散性指数。
在一个实施方案中，如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其中α-(1，3)糖苷键和α-(1，3，6)糖苷键含量的总和在3％至50％的范围内，优选地3％至25％。
在另一个实施方案中，如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含15-35％；优选地20-30％的α-(1，4)糖苷键。
在另一个实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含1％至40％，优选地2％至30％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合。
在另一个实施方案中，除了以上提及的糖苷键含量实施方案之外，本发明α-葡聚糖纤维组合物包含小于300000道尔顿(Da)、优选地1500至300000Da、更优选1500至90,000Da，更优选地1500至20,000Da，并且甚至更优选地1500至16,000Da的重均分子量(Mw)。
在一个优选的实施方案中，上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含95至98％的α-(1，6)糖苷键、2至5％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合，并且包含大于10,000Da；优选地大于10,000Da但小于20,000Da的重均分子量。
在另一个实施方案中，除了任何以上特征之外，在20℃下和水中12重量％下，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物还可具有小于250厘泊(cP)(0.25帕斯卡秒(Pa·s))、优选小于10厘泊(cP)(0.01帕斯卡秒(Pa·s))、优选小于7cP(0.007Pa·s)、更优选小于5cP(0.005Pa·s)、更优选小于4cP(0.004Pa·s)、并且最优选小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。
如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量，本发明的可溶性α-葡聚糖组合物具有小于20％，优选地小于15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％消化度的消化度。
除了任何以上实施方案之外，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在25℃下pH 7水中还具有至少20重量/重量％、优选至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。
在一个实施方案中，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含的还原糖的含量小于10重量％、优选小于5重量％、并且最优选1重量％或更少。
在另一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含介于1500和90,000g/mol之间；优选地1500至30,000g/mol，更优选地1500至20,000g/mol，并且更优选地3000至16000g/mol的数均分子量(Mn)。在一个实施方案中，数均分子量(Mn)介于13000和16000之间。
在一个实施方案中，本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含少于4kcal/g、优选少于3kcal/g、更优选少于2.5kcal/g、并且最优选约2kcal/g或更少的含热量。
包含葡聚糖纤维的组合物
取决于期望的应用，可利用适用于食物、个人护理产品和/或药物的一种或多种其它材料配制(例如，共混、混合、掺入等)本发明的葡聚糖纤维/纤维组合物。因此，本发明包括包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物。在该上下文中，术语“包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物”可包括例如，营养或食物组合物，诸如食物产品、食物补充剂、或功能性食物。在另一个实施方案中，“包含本发明葡聚糖纤维组合物的组合物”还可包括个人护理产品、化妆品和药物。
本发明葡聚糖纤维/纤维组合物可被指定为期望的产品(例如食物、个人护理产品等)中的成分，或可以与一种或多种附加的食物级材料共混以形成用于期望的产品例如食物、个人护理产品等)中的碳水化合物组合物。掺入碳水化合物中的α-葡聚糖纤维组合物的量可根据应用变化。因此，本发明包含碳水化合物组合物，所述碳水化合物组合物包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。在一个实施方案中，碳水化合物组合物包含0.01至99重量％(基于干固体)，优选地0.1至90重量％，更优选地1至90％，并且最优选地5至80重量％的上述可溶性葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“食物”旨在包括人类食用以及动物食用的食物。所谓“功能性食物”，是指声称具有优于提供营养物的基本营养功能的健康促进和/或疾病预防和/或疾病降低特性的任何新鲜的或经加工的食物。功能性食物可包括例如，经加工的食物或利用健康促进添加剂强化的食物。功能性食物的示例为利用维生素强化的食物，或具有活的培养物的发酵食物。
包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维素组合物的碳水化合物组合物可包含本领域已知包含在营养组合物中的其它材料，诸如水或其它水性溶液、脂肪、糖、淀粉、粘合剂、增稠剂、着色剂、调味剂、着嗅剂、酸化剂(例如乳酸或苹果酸等)、稳定剂、或高强度甜味剂、或矿物质等。适宜的食物产品的示例包括面包、早餐谷物、饼干、蛋糕、曲奇、梳打饼、酸奶、酸乳酒、味噌、纳豆、豆豉、泡菜、酸菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精饮料、小吃、汤、冷冻甜点、油炸食物、比萨、意面制品、马铃薯制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、谷物、生面团、加工肉类和奶酪、酸奶、冰淇淋甜点、基于牛奶的饮料、沙拉酱、调味汁、浇头、甜点、糖果产品、基于谷物的小吃棒、制备的菜肴等。包含本发明的α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物可以呈液体、浆液、粉末、颗粒、成形球、成形棒，成形板、成形立方体、片剂、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
在一个实施方案中，根据本发明的碳水化合物组合物可包含至少两种纤维源(即，本发明α-葡聚糖纤维组合物之外的至少一种附加的纤维源)。在另一个实施方案中，一种纤维源为本发明的葡聚糖纤维并且第二纤维源为寡糖或多糖，其选自抗性/支链麦芽糊精/纤维糊精(诸如得自Roquette Freres(Lestrem，France)的得自DM-Matsutani LLC(Decatur，Illinois)的)，聚右旋糖(得自Danisco-DuPontNutrition&Health(Wilmington，DE)的)，可溶性玉米纤维(例如，得自Tate&Lyle(London，UK)的)，异麦芽寡糖(IMO)、交替糖和/或麦芽交替糖寡糖(MAO)(例如，得自Aevotis GmbH(Potsdam，Germany)的FIBERMALTTM；SUCROMALTTM(得自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、支链淀粉、抗性淀粉、菊糖、果寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、木寡糖、阿拉伯木寡糖、尼古尔寡糖、龙胆寡糖、半纤维素和果糖低聚物糖浆。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维可作为常规碳水化合物的替代物或补充剂加入食物中。因此，本发明的另一个实施方案是包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的食物产品。在另一个方面，所述食物产品包含通过本发明方法制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用于碳水化合物组合物和/或食物产品中，所述组合物和/或食物产品包含一种或多种高强度人造甜味剂，包括但不限于甜叶菊、阿斯巴甜、蔗糖素、纽甜、丁磺氨钾、糖精、以及它们的组合。本发明可溶性α-葡聚糖纤维可与糖替代物共混，所述糖替代物诸如甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤藓醇、甘油醇、甘草甜素、氢化淀粉水解物、菊粉、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、麦芽寡糖、麦芽交替寡糖(诸如， SUCROMALTTM，购自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、甘露醇、神奇蛋白、罗汉果苷混合物、莫纳甜、莫内林、osladin、五聚糖、山梨醇、甜菊糖、塔格糖、索马甜、木糖醇以及它们的任意组合。
包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品将具有比其中使用常规碳水化合物的类似食物产品更低的血糖应答、更低的血糖指数、和更低的血糖负载。另外，因为可溶性α-葡聚糖纤维的特征在于人类胃或小肠中的非常低的消化度至没有消化度，所以降低了食物产品的含热量。本发明的水溶性α-葡聚糖纤维可以粉末的形式使用，共混入具有其它可溶性食物成分的干粉末中，或可以包含本发明膳食纤维的液体糖浆(本文中也被称为“可溶性纤维糖浆”、“纤维糖浆”或简称“糖浆”)的形式共混或使用。“糖浆”可作为可溶性纤维源加入食物产品中。其可增加食物产品的纤维含量，但对风味、口感、或质感不具有负面影响。
纤维糖浆可单独地或与增量剂诸如糖醇或麦芽糊精组合地用于食物产品中，以减少含热量和/或增强产品的营养特征。纤维糖浆还可用作食物产品中脂肪的部分替代物。
纤维糖浆可作为嫩化剂或调质剂用于食物产品中，以增加脆性或折断性、改善视觉吸引力、和/或改善生面团、奶蛋糊或其它食物组合物的流变性。纤维糖浆还可作为湿润剂用于食物产品中，以增加产品的架藏寿命、和/或产生更柔软、更湿润的质地。其还可用于食物产品中以降低水活性或固定和管理水。纤维糖浆的附加用途可包括：替代涂蛋液和或增强食物产品的表面光泽、改变面粉淀粉糊化温度、改性产品的质地、以及增强产品的褐变。
纤维糖浆可用与各种类型的食物产品中。其中本发明糖浆可非常有用的一种食物产品类型是烘焙产品(即烘焙食物)，诸如蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团。常规的烘焙产品可具有相对高的糖和高的总碳水化合物。本发明糖浆用作烘焙产品中的成分可有助于降低糖和碳水化合物含量，以及降低总卡路里，同时增加烘焙产品的纤维含量。
存在烘焙产品的两种主要类型：酵母发酵和化学发酵。在酵母发酵的产品，如甜甜圈、甜面团和面包中，本发明的包含纤维的糖浆可用于替代糖，但少量糖仍然可能是期望的，这是由于酵母或外壳褐变需要发酵底物。纤维糖浆可作为包含非纤维的糖浆或液体甜味剂的直接替代物与其它液体一起添加。然后，生面团可在烘焙行业中常用的条件下加工，包括混合、发酵、分开、成形或挤出为长面包或挤出成型、发面、和烘焙或油炸。可使用类似于传统产品的条件，将产品烘焙或油炸。面包可在420°F至520°F(216-271℃)范围内的温度下常规烘焙20至23分钟，并且甜甜圈可在400-415°F(204-213℃)范围内的温度下油炸，但还可使用其它温度和时间。
化学发酵的产品通常具有更多的糖，并且可包含更高含量的包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物和/或可食用糖浆。成品曲奇可包含30％糖，其可完全地或部分地用包含本发明葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物和/或糖浆替代。这些产物可具有例如4-9.5的pH。含水量可例如介于2-40％之间。
在膏化步骤期间在开始混合时，或在类似于糖浆或干甜味剂正在被替代的任何方法中，本发明碳水化合物组合物和/或包含纤维的浆料可容易地掺入并可加入脂肪中。可将产品混合并且然后例如通过成片、旋转切割、线切割或通过另一成型工艺成形。然后可在典型的烘焙条件下，例如在200-450°F(93-232℃)下，烘焙产品。
其中可使用碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是早餐谷物。例如，包含纤维的糖浆可用于替换在挤出的谷物片中和/或那些片的外部包衣中的全部或部分的糖。所述包衣通常为成品谷物片总重量的30-60％。糖浆可以例如喷雾或洒落形式施用。
其中可使用(任选地以碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的形式)本发明α-葡聚糖纤维组合物的另一食物产品类型是乳制品。其中其可使用的乳制品的示例包括酸奶、酸奶饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、和乳制品甜点，诸如脱脂凝乳和打发的慕斯型产品。这可包括旨在直接食用的乳制品(例如包装好的冰沙)以及旨在与其它成分共混的那些(例如共混的冰沙)。其可用于巴氏灭菌乳制品，诸如在160°F至285°F(71-141℃)的温度下巴氏灭菌的乳制品。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是糖果。其可用于其中的糖果的示例包括硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖或胶糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果干。在水果干中，包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物可与果汁组合使用。所述果汁可提供大部分甜味，并且包含葡聚糖纤维的组合物可减少总糖含量并增加纤维。可将包含葡聚糖纤维的本发明组合物加入最初的糖浆中并且加热至最终固含量。所述浆料可从200-305°F(93-152℃)加热以实现最终固含量。可在加热之前或之后加入酸以产生为2-7的最终pH。可将包含葡聚糖纤维的组合物用作存在的0-100％的糖和1-100％的玉米糖浆或其它甜味剂的替代物。
其中可使用包含α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是果酱和果冻。果酱和果冻由水果制成。果酱包含水果片，然而果冻由果汁制成。包含本发明纤维的组合物可如下代替糖或其它甜味剂使用：将水果和果汁称入罐中；将糖、含纤维组合物和果胶预混；将干组合物加入液体中并煮至214-220°F(101-104℃)的温度；热填充到广口瓶中并蒸馏5-30分钟。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是饮料。其可用于其中的饮料的示例包括碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物(例如玛格丽特混合物)、清水、和饮料干混物。使用本发明α-葡聚糖纤维可克服当将其它类型的纤维加入饮料中时产生的透明度问题。糖的完全替代是可能的(其可以例如为高达总配方的12％或更多)。
另一产品类型是高固体填充物。高固体填充物的示例包括小吃条、烤酥饼、甜甜圈和曲奇中的填充物。高固体填充物可以为例如酸/水果填充物或有香味的填充物。纤维组合物可加入原样食用的产品中，或加入可通过食物加工机(附加的烘焙)或通过消费者(烘焙稳定填充)进行进一步加工的产品中。在本发明的一些实施方案中，高固体填充物可具有介于67-90％之间的固体浓度。所述固体可被包含本发明α-葡聚糖纤维的组合物完全替换，或其可用于存在的其它甜味剂固体的部分替换(例如，替换5-100％的现有固体)。通常水果填充物可具有2-6的pH，然而有香味的填充物可介于4-8pH之间。填充物可冷却制备或在高达250°F(121℃)下加热以蒸发至期望的最终固含量。
其中可使用α-葡聚糖纤维组合物或(包含α-葡聚糖纤维组合物)的碳水化合物组合物的另一食物产品类型是挤出和成片的小吃。其可使用的挤出和成片小吃的示例包括膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片。在制备挤出片时，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可与干产品一起直接添加。可在挤出机中添加少量水，并且然后，其可通过在100°F至300°F(38-149℃)范围内的各种区域。所述干产品可以干产品混合物的0-50％的含量添加。包含本发明葡聚糖纤维的糖浆还可沿挤出机在液体端口之一处加入。产品可以低含水量(5％)制出，并且然后烘焙以移除过量水分，或以略高水分含量(10％)制出，并且然后油炸以移除水分并煮出产品。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可更典型地在350°F(177℃)下持续10分钟。烘焙可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。在片状小吃中，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用作其它干燥成分(例如，面粉)的部分替代物。其可以为干重的0-50％。可将产品干混，并且然后加入水以形成粘性面团。产品混合物可具有5至8的pH。然后可将生面团成片并切割，并且然后烘焙或油炸。烘焙可以在高达500°F(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可通常在350°F(177℃)下持续2-5分钟。来自使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一潜在益处是当其作为内部成分添加或作为油炸食物的外部上的包衣添加时，油炸小吃中的脂肪含量减少多达15％。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是明胶状点心。明胶状点心的成分常常作为干混物出售，其中明胶作为胶凝剂。糖固体可利用干混物中包含本发明葡聚糖纤维的组合物部分或完全地替代。然后可将干混物与水混合并加热至212°F(100℃)以溶解明胶，并且然后可加入更多水和/或水果以完成明胶状点心。然后使明胶冷却并固化。明胶还可以架藏稳定的包装出售。在该情况下，稳定剂通常是基于角叉菜胶的。如上所述，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于替代最高达100％的其它甜味剂固体。可将干燥成分混入液体中并且然后巴氏灭菌并放入杯中，并使其冷却和固化。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是小吃棒。其可用于其中的小吃棒的示例包括早餐替代棒和代餐棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒。其可用于小吃棒的任一部分中，诸如在高固体填充物、结合糖浆、或颗粒部分中。完全或部分替代结合糖浆中的糖是可能的。结合糖浆通常为50-90％固体，并且以在10％结合糖浆与90％颗粒，至70％结合糖浆与30％颗粒范围内的比率施用。结合糖浆通过将甜味剂、增量剂、和其它粘合剂(如淀粉)的溶液加热至160-230°F(71-110℃)来制备(取决于糖浆中所需的最终固体)。然后将糖浆与颗粒混合以包覆颗粒，从而提供遍布基质的包衣。包含本发明葡聚糖纤维的组合物还可用于颗粒本身。这可以为直接膨胀或枪式膨化的挤出片。其可以与另一种谷物成分、玉米粗粉、米粉或其它类似成分组合使用。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维糖浆的组合物的另一食物产品类型是奶酪、奶酪酱和其它奶酪制品。其可用于其中的奶酪、奶酪酱和其它奶酪制品的示例包括低乳固体奶酪、低脂奶酪、和低卡路里奶酪。在块状奶酪中，其可有助于改善熔融特性，或减小通过其它成分诸如淀粉增加的熔融限制效果。其还可用于奶酪酱中，例如作为增量剂，来替代脂肪、乳固体或其它典型的增量剂。
其中可使用包含本发明葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是可食用和/或水溶性的膜。其可用于其中的膜的示例包括用于包封旨在用于水中的各种食物和饮料的干混物的膜，或者用于递送颜色或风味剂的膜，诸如在烹饪之后但仍然热时加入食物中的香料膜。其它膜应用包括但不限于水果和蔬菜植物鞣皮，以及其它柔性膜。
在另一个实施方案中，可使用的包含本发明葡聚糖纤维的组合物为汤、糖浆、酱汁、和调味品。典型的调味品可以为0-50％油，其pH范围为2-7。其可冷加工或热加工。可将其混合，并且然后可添加稳定剂。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。调味品组合物可需要加热以活化稳定剂。典型的加热条件可以为170-200°F(77-93℃)并持续1-30分钟。在冷却之后，加入油以制备预乳液。然后，使用匀化器、胶体磨或其它高剪切工艺将产品乳化。
酱汁可具有0-10％油和10-50％总固体，并且可具有2-8的pH。酱汁可冷加工或热加工。将成分混合并且然后热加工。根据需要，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。典型的加热可以为170-200°F(77-93℃)并持续1-30分钟。
汤更典型地为20-50％固体并且处于更中性的pH范围(4-8)。它们可以为干混合物，可向其添加包含本发明葡聚糖纤维的干燥组合物，或者将液体汤罐装并且然后蒸馏。在汤中，可使用最高达50％固体的抗性玉米糖浆，但更典型的用途是可以递送5g纤维/份。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是咖啡奶精。其可用于其中的咖啡奶精包括液体奶精和干奶精两者。干共混的咖啡奶精可与以下脂肪类型的商业奶精粉末共混：大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油、或乳脂。这些脂肪可以为非氢化的或氢化的。包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物可作为纤维源，任选地与果寡糖、聚右旋糖、菊糖、麦芽糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常规玉米糖浆固体一起添加。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如蔗糖素、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、或它们的组合。可将这些成分干共混以制备期望的组合物。
喷雾干燥的奶精粉末为脂肪、蛋白质和碳水化合物、乳化剂、乳化盐、甜味剂和抗结块剂的组合。脂肪源可以为大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油或乳脂中的一种或多种。蛋白质可以为酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙、乳蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白或大豆蛋白。碳水化合物可以为单独包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物的组合物，或包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物与果寡糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麦芽糊精、蔗糖、玉米糖浆或它们的任意组合的组合的组合物。乳化剂可以为甘油单酯和甘油二酯、乙酰化甘油单酯和甘油二酯、或丙二醇单酯。所述盐可以为柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠、焦磷酸四钠、磷酸二氢钾、和/或磷酸二钾。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如上述那些。适宜的抗结块剂包括硅铝酸钠或二氧化硅。产品可混合于浆料中，任选地均化，并且以颗粒或附聚形式喷雾干燥。
液体咖啡奶精仅是脂肪(乳脂或氢化植物油)、一些乳固体或酪蛋白酸盐、玉米糖浆和香草风味剂或其它风味剂的经匀化和巴氏灭菌的乳液，以及稳定化共混物。产品通常在185°F(85℃)下经由HTST(高温短时)巴氏灭菌30秒，或在285°F(141℃)下UHT(超高温)巴氏灭菌4秒，并且在两塔板均化器中以第一塔板500-3000psi(3.45-20.7MPa)，和第二塔板200-1000psi(1.38-6.89MPa)均化。通常将咖啡奶精稳定化使得其在加入咖啡中时不分解。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是食物包衣诸如糖衣、糖霜、糖浆。在糖衣和糖霜中，包含纤维的糖浆可用作甜味剂替代物(完全或部分的)以降低含热量并增加纤维含量。糖浆通常为约70-90％的糖，其中剩余的大部分为水，并且包含纤维的糖浆可用于完全或部分替代糖.糖霜通常包含约2-40％的液体/固体脂肪组合、约20-75％甜味剂固体、颜料、风味剂和水。包含纤维的糖浆可用于替换完全或部分的甜味剂固体，或作为低脂肪体系中的增量剂。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是宠物食物，诸如干或湿的狗粮。宠物食物以各种方式制备，诸如挤出、成形、和配制成肉汁。包含纤维的糖浆可以0-50％的含量用于这些类型的每一种中。
其中可使用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如糖浆)的另一食物产品类型是鱼和肉。在一些肉中已经使用了常规的玉米糖浆，所以包含纤维的糖浆可用作部分或完全的替代物。例如，糖浆可在其真空翻滚或注入肉中之前，加入盐水中。其可与盐和磷酸盐，以及任选地与水结合成分诸如淀粉、角叉菜胶或大豆蛋白一起添加。这可用于增加纤维，典型的含量可以为5g/次，这可满足对优异纤维源的要求。
包含本发明可溶性纤维的个人护理和/或药物组合物
本发明葡聚糖纤维和/或包含本发明葡聚糖纤维的组合物可用于个人护理产品中。例如，可能够使用此类材料作为湿润剂、水解胶体或可能的增稠剂。如果需要，本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物可与一种或多种其它类型的增稠剂结合使用，诸如在美国专利8,541,041中所公开的那些，该专利以引用方式全文并入本文。
本文个人护理产品没有具体的限制，并且包括例如皮肤护理组合物、美容组合物、抗真菌组合物、和抗菌组合物。本文的个人护理产品可为例如洗剂、霜剂、糊剂、油膏、膏剂、润发油、凝胶、液体以及它们的组合等的形式。本文公开的个人护理产品可包含至少一种活性成分。活性成分公认为产生期望药理效果或美容效果的成分。
在某些实施方案中，可将皮肤护理产品施用于皮肤，以解决与缺乏水分相关的皮肤损伤。皮肤护理产品也可用于改善皮肤的视觉外观(例如减少片状、破裂和/或红皮肤的外观)和/或皮肤的触感(例如，降低皮肤的粗糙度和/或干燥度，同时增加皮肤的柔滑度和细腻度)。皮肤护理产品通常可包含至少一种活性成分以治疗或预防皮肤疾病，提供美容效果，或向皮肤提供保湿益处，所述活性成分如氧化锌、凡士林、白凡士林、矿物油、鱼肝油、羊毛脂、聚二甲基硅氧烷、硬脂肪、维生素A、尿囊素、菱锌矿、高岭土、甘油、或胶状燕麦、以及这些的组合。例如，皮肤护理产品可包含一种或多种天然的增湿因子，例如神经酰胺、透明质酸、甘油、角鲨烷、氨基酸、胆固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亚油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸钠或吡咯烷酮羧酸钠。可包含在皮肤护理产品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、芥花籽油、角鲨烷、角鲨烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蜡、卵磷脂、橄榄油、红花油、芝麻油、牛油树脂、豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶树油、牛油树脂、棕榈油、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯、脂肪酸和橙油。
本文的个人皮肤护理产品还可以是化妆品或其它产品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红。眼线膏、唇线笔、唇彩、其它化妆品、防晒霜、防晒剂(sunblock)、指甲油、摩丝、喷发剂、定型凝胶、指甲调理剂、洗浴凝胶、淋浴凝胶、身体洗涤剂、洗脸剂、洗发剂、皮肤调理剂(免洗型或清洗型)、营养发水、染发剂、染发产品、亮发产品、护发精华素、头发防卷曲产品、头发分叉端修复产品、唇膏、皮肤调理剂、冷霜、保湿剂、身体喷剂、肥皂、身体擦洗剂、去死皮剂、收敛剂、紧肤洗剂、脱毛剂、烫发液、去屑制剂、止汗剂组合物、除臭剂、剃须产品、剃须前产品、剃须后产品、清洁剂、皮肤凝胶、漂洗剂、牙膏或漱口剂。
本文的药学产品可例如呈乳液、液体、酏剂、凝胶、混悬液、溶液、霜剂、胶囊、片剂、香囊或膏剂的形式。此外，本文的药物产品可以是本文所公开的任意个人护理产品的形式。药物产品还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或药学上可接受的盐。本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物还可用于胶囊、包封材料、片剂包衣中，并作为赋形剂用于药剂和药物。
气体产生
在下消化道中的快速气体产生速率引起胃肠道不适，诸如肠胃气胀和胃气胀，然而如果气体产生是渐进的和少的，则身体可以更容易地应付。例如，当在当量剂量(克可溶性纤维)下与本发明葡聚糖纤维组合物相比时，菊糖产生快速且高的气体产生增加，然而本发明的葡聚糖纤维组合物优选在当量剂量下具有低于菊粉的气体释放速率。
在一个实施方案中，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含对于食物应用而言良好耐受的气体产生速率。在一个实施方案中，在当量剂量下，气体产生的相对速率不大于在类似条件下对于菊粉所观察到的速率，优选地与菊粉相同或小于菊粉，更优选地小于菊粉，并且最优选地远小于菊粉。在另一个实施方案中，使用本文所用的方法，经过3小时或24小时，测量气体形成的相对速率。在优选的方面，在相同反应条件下，气体制剂形成速率比对于菊粉所观察到的速率小至少1％，优选的2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或至少30％。
有益的生理特性
短链脂肪酸产生
使用根据本发明的化合物可有利于通过结肠发酵产生产能代谢物。使用根据本发明的化合物可有利于制备短链脂肪酸，诸如丙酸盐和/或丁酸盐。已知SCFA降低胆固醇。因此，本发明的化合物可降低形成高胆固醇的风险。在发酵研究中，本发明的葡聚糖纤维组合物可以促进短链脂肪酸，尤其是丙酸盐和/或丁酸盐的产生。因为短链脂肪酸(SCFA)的产生或SCFA与乙酸盐的比例的增加有利于在有需要的哺乳动物中控制胆固醇含量，所以本发明对营养学家和消费者用于预防和/或治疗心血管风险是特别有意义的。因此，本发明的另一方面提供用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量向受试者施用包含本发明α-葡聚糖纤维组合物的组合物，以对所述受试者的健康施加益处，诸如治疗胆固醇相关疾病。此外，通常已知短链脂肪酸降低肠道中的pH，并且这有助于钙吸收。因此，根据本发明的化合物还可影响矿物质吸收。这是指通过由于肠道中SCFA增加而降低pH，它们还可改善骨骼健康，或预防或治疗骨质疏松症。产生SCFA可增加小肠中的粘度，这减少了胆汁酸的再吸收；增加由胆固醇合成胆汁酸并减少了低密度脂蛋白(LDL)胆固醇循环。
考虑有益的生理效应，化合物或组合物的“有效量”是指在各种剂量下并对于必要的时间段而言，有效实现期望的有益生理效应，诸如降低血液胆固醇、增加短链脂肪酸产生或者预防或治疗胃肠道疾病的量。例如，施用于受试者的组合物的量将根据各种因素而变化，诸如受试者的病症、受试者的体重、受试者的年龄、以及组合物是否是唯一营养来源。有效量可由执业医师或营养师容易地设定。一般来讲，施用足量的组合物以向受试者提供最高达约50g的膳食纤维(不溶性和可溶性)/天；例如约25g至约35g的膳食纤维/天。受试者接收的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量优选在约0.1g至约50g/天的范围内，更优选地以0.5g至20g/天，并且最优选地1至10g/天的范围内。如本文所限定的，化合物或组合物可以多剂量摄取，例如1至5次，分散于一天中或急性地，或可以单剂量摄取。如本文所限定的，化合物或组合物还可在期望的时间段内连续喂食。在某些实施方案中，期望的时间段为至少一周或至少两周或至少三周或至少一个月或至少六个月。
在优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来降低有需要的受试者的血甘油三酯水平的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来降低有需要的受试者的低密度脂蛋白水平的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于有需要的受试者来增加有需要的受试者的高密度脂蛋白水平的方法。
血糖浓度/血糖应答的减弱
在本发明α-葡聚糖纤维组合物中存在不是α-(1，4)主链键的键，提供改善的耐消化性，因为人类消化道中的酶可难以水解此类键和/或支化键。支链的存在向葡聚糖纤维提供部分或完全的不消化性，并且因此实质上没有葡聚糖吸收到体内或葡聚糖更慢地吸收到体内，这导致较低的血糖应答。因此，本发明提供用于制备导致较低血糖应答的食物和饮料组合物的α-葡聚糖纤维组合物。例如，这些化合物可用于代替糖或其它可快速消化的碳水化合物，从而降低食物的血糖负荷、减少热量、和/或减低食物的能量密度。因此，具有这些类型的键的本发明α-葡聚糖纤维组合物的稳定性使得它们容易地通过进入大肠中，其中它们可用作对结肠微生物菌群具有特异性的底物。
改善肠道健康
在另一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗和/或改善肠道健康。本发明α-葡聚糖纤维组合物优选在肠道中通过肠道微生物群缓慢发酵。优选地，本发明化合物表现出在体外肠道模型中不差于菊粉或其它可商购获得的纤维诸如(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、(可溶性玉米纤维或抗性糊精，Roquette)、或(耐消化麦芽糊精，Archer Daniels Midland Company&MatsutaniChemical)的耐受性，(即相似的气体产生水平)，优选地优于一种或多种可商购获得的纤维的改善的耐受性，即本发明葡聚糖纤维的发酵导致在3小时或24小时内比菊粉更少的气体产生，从而减少由于气体形成的不适，诸如肠胃气胀和胃气胀。在一个方面，本发明还涉及通过将如本文所限定的化合物或组合物施用于有需要的受试者来减轻受试者胃肠道中气体形成的方法，以便减少由于肠胃气胀和胃气胀的肠道疼痛或肠道不适。在另一个实施方案中，本发明的组合物向受试者提供对食物发酵的改善的耐受性，并且可与纤维，诸如菊粉或FOS、GOS、或乳果糖混合以通过减少气体产生来改善耐受性。
在另一个实施方案中，可施用本发明的化合物以通过增加大便体积来改善排便或改善排便规律。
益生元和益生菌
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用作益生元，或当益生菌组合使用时用作“合生素”，如下所述。所谓“益生元”，是指通过选择性地刺激胃肠道，特别是结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性，从而改善宿主的健康来有益地影响受试者的食物成分。益生元的示例包括果寡糖、菊粉、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纤维、低聚葡萄糖和半乳糖寡糖、阿拉伯木寡糖、乳糖醇和乳果糖。
在另一个实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物还包含至少一种益生生物。所谓“益生生物”是指通过它们在消化道中的功能向受试者提供益处的活微生物膳食补充剂。为了有效，益生微生物必须能够在消化条件下存活，并且它们必须能够至少暂时移植于胃肠道而对受试者没有任何伤害。仅某些微生物的菌株具有这些特性。优选地，益生微生物选自：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichiaspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和酵母属(Saccharomyces spp.)。特定微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、双歧杆菌(Bifidobacterium bificum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、球拟酵母(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和链霉菌(Streptomyces)等，包括它们的营养孢子、非营养孢子(芽孢杆菌(Bacillus))和合成衍生物。更优选的益生菌微生物包括但不限于三种细菌属的成员：乳杆菌属、双歧杆菌属和酵母属。在优选的实施方案中，益生微生物是乳杆菌属、双歧杆菌属、以及它们的组合。
可将益生微生物作为在益生菌保持存活的水或其它液体或半固体培养基中的培养物掺入组合物中。在另一种技术中，可通过混合或共混将包含益生生物的冻干粉末掺入特定材料或液体或半固体材料中。
在优选的实施方案中，组合物包含益生生物，其含量足以递送至少1至200亿活益生菌(菌落形成单位数；“CFU”)，优选1至100亿，最优选1至50亿活益生菌。如上所述益生生物递送量可按剂量和/或按天计，其中多剂量/天可适用于一些应用。可将两种或更多种益生生物用于一种组合物中。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物的酶促合成
提供酶促制备包含α-(1，2)糖苷键的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。更具体地，在蔗糖存在下，将具有α-(1，2)支化活性的多肽用于将α-(1，2)糖苷键加入具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物主链上。
在一个实施方案中，所述具有α-(1，2)支化活性的多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，前提条件是所述多肽不包括能够合成不是α-(1，2)糖苷键的α-糖苷键的第二催化域。
α-葡聚糖底物主链的合成
本发明可溶性纤维通过将α-(1，2)糖苷键加至在主链中包含有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物(“主链”)中获得。在一个实施方案中，α-(1，6)葡聚糖底物主链中的α-(1，6)键的有效量为以分子计，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％或所有α-糖苷键。多种酶可用于由蔗糖和/或麦芽糊精制备合适的α-葡聚糖底物主链(即，具有适用于酶促添加α-(1，2)支链的有效量的α-(1，6)糖苷键)。用于制备葡聚糖主链的酶可包括葡糖基转移酶(通常来自葡糖苷水解酶的GH70家族)、糊精右旋糖酐酶、4，6-α-葡糖基转移酶(来自家族GH70的“Gtf-B型”)、以及它们的组合，其任选地与至少一种α-葡糖苷酶组合，优选地其中所述α-葡糖苷酶为右旋糖酐酶、突变酶、或它们的组合。
葡糖苷水解酶家族70
葡糖苷水解酶家族70酶(“GH70”)是由乳酸菌如链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌或乳杆菌属产生的转葡糖苷酶(参见Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。重组表达的葡糖基转移酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。取决于GTF酶的特异性，可形成包含各种糖苷键诸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表可包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。所得葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。
在一个实施方案中，D-吡喃葡萄糖基供体是蔗糖。因此，反应为：
主要形成的糖苷键类型用于命名/分类葡糖基转移酶。示例包括右旋糖酐蔗糖酶(α-(1，6)键；EC 2.4.1.5)、变聚糖蔗糖酶(α-(1，3)键；EC 2.4.1.-)、交替糖蔗糖酶(交替的α(1，3)-α(1，6)主链；EC 2.4.1.140)和罗伊糖蔗糖酶(α-(1，4)和α-(1，6)键的混合物；EC2.4.1.-)。
在一个实施方案中，可溶性α-葡聚糖底物由可得自甘蔗和/或糖用甜菜的蔗糖(α-D-吡喃葡萄糖基β-D-呋喃果糖苷；CAS#57-50-1)酶促合成。在一个实施方案中，所述方法包括使用至少一种重组产生的葡糖基转移酶，其属于葡糖苷水解酶70型(E.C.2.4.1.-)，能够催化使用蔗糖作为底物的可溶性α-葡聚糖底物主链的合成。在一个优选的方面，所得的α-葡聚糖底物主链为水溶性的。
在一个方面，主链合成的葡糖基转移酶(GTF)能够形成具有至少50％或更多的α-(1，6)糖苷键的葡聚糖，前提条件是所述葡聚糖产物不是交替糖(即所述酶不是交替蔗糖酶)。
在一个方面，葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：7，9，10，11，12，13，14或16具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在另一个方面，葡糖基转移酶包含与选自SEQ ID NO：7，9，10，11，12、和13的氨基酸序列具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，适用的葡糖基转移酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含衍生自全长野生型氨基酸序列的序列。
GH70葡糖基转移酶/α-葡聚糖水解酶组合以制备α-葡聚糖底物主链
在另一个实施方案中，葡糖基转移酶(GH70)和α-葡聚糖水解酶(例如，右旋糖酐酶或突变酶)的组合用于制备合适的α-葡聚糖底物主链。在一个优选的方面，葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶同时用于制备α-葡聚糖底物主链。
用于合成的α-葡聚糖水解酶(与至少一种葡糖基转移酶组合)优选为右旋糖酐酶或突变酶；优选为内切突变酶或内切右旋糖酐酶。在一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶(EC 2.1.1.11)、突变酶(EC 3.1.1.59)或它们的组合。在一个实施方案中，右旋糖酐酶是来自毛壳菌的食物级右旋糖酐酶。在另一个实施方案中，来自毛壳菌的右旋糖酐酶为 PLUS L，购自Novozymes A/S，Denmark。
在另一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为至少一种突变酶(EC 3.1.1.59)。在一个实施方案中，突变酶为可得自青霉菌属(Penicillium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)的突变酶。在另一个实施方案中，突变酶来自马尼埃青霉ATCC 18224或ATCC 18224或Paenibacillus Humicus。在另一个实施方案中，突变酶包含与选自SEQ ID NO：21、23的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸。在另一个实施方案中，上述突变酶可以为催化活性的截短形式，至少保留突变酶活性即可。在另一个优选的实施方案中，突变酶包含SEQ ID NO：21、23或它们的组合。
在另一个实施方案中，具有与SEQ ID NO：14或16的至少90％同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的葡糖基转移酶的组合与具有与SEQ ID NO：21或23的至少90％同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的突变酶同时使用。在优选的实施方案中，具有氨基酸SEQ ID NO：14或16的葡糖基转移酶的组合与具有氨基酸序列SEQ ID NO：21或23的突变酶同时使用。在另外优选的实施方案中，具有氨基酸SEQ ID NO：16的葡糖基转移酶的组合与SEQ ID NO：21的突变酶同时使用以制备期望的α-葡聚糖底物主链(即，GTF0544/MUT3264)。
由麦芽糊精制备α-葡聚糖底物主链
α-葡聚糖底物主链可由麦芽糊精底物合成。在一个实施方案中，至少一种具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽(E.C.2.4.1.2)用于合成α-葡聚糖底物主链。麦芽糊精底物/麦芽寡糖得自经加工的淀粉或可使用淀粉蔗糖酶(例如，示例以SEQ ID NO：71提供)由蔗糖酶促获得。
具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽可与至少一种α-葡聚糖水解酶组合使用以制备α-葡聚糖底物主链。在一个实施方案中，具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽与至少一种α-葡聚糖水解酶同时使用以制备合适的α-葡聚糖底物主链。在优选的实施方案中，α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶，优选地内切右旋糖酐酶。所用的酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
在一个方面，所述具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：26具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，适用的糊精右旋糖酐酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含衍生自SEQ ID NO：26的序列。
在一个方面，内切右旋糖酐酶得自毛壳属(Chaetomium)，优选地毛壳菌(Chaetomium erraticum)。在另一优选的方面，内切右旋糖酐酶是来自毛壳菌的右旋糖酐酶L。在一个优选的实施方案中，内切右旋糖酐酶不具有显著的麦芽糖水解活性，优选地不具有麦芽糖水解活性。
糊精右旋糖酐酶活性与α-葡聚糖水解酶(即内切右旋糖酐酶)活性的比率可根据选择的酶变化。在一个实施方案中，糊精右旋糖酐酶活性与α-葡聚糖水解酶活性的比率在1∶0.01至0.01∶1.0的范围内。
在一个实施方案中，至少一种具有4，6-α-葡糖基转移酶活性的多肽(“Gtf-B型”GH70)用于合成α-葡聚糖底物主链。麦芽糊精底物/麦芽寡糖得自经加工的淀粉或可使用淀粉蔗糖酶(示例以SEQ ID NO：71提供)由蔗糖酶促获得。
具有4，6-α-葡糖基转移酶活性的多肽可与至少一种α-葡聚糖水解酶组合使用以制备α-葡聚糖底物主链。在一个实施方案中，具有4，6-α-葡糖基转移酶活性的多肽与至少一种α-葡聚糖水解酶同时使用以制备合适的α-葡聚糖底物主链。在优选的实施方案中，α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶，优选地内切右旋糖酐酶。所用的酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
在一个方面，所述具有4，6-α-葡糖基转移酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：68、69、或70具有至少90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，4，6-α-葡糖基转移酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的4，6-α-葡糖基转移酶包含衍生自SEQ ID NO：68、69或70的序列。
在一个方面，内切右旋糖酐酶得自毛壳属，优选地毛壳菌。在另一优选的方面，内切右旋糖酐酶是来自毛壳菌的右旋糖酐酶L。
4，6-α-葡糖基转移酶活性与α-葡聚糖水解酶(即内切右旋糖酐酶)活性的比率可根据选择的酶变化。在一个实施方案中，4，6-a-葡糖基转移酶活性与α-葡聚糖水解酶活性的比率在1∶0.01至0.01∶1.0的范围内。
当将反应组分混合时，最初存在的麦芽糊精底物浓度(当合成α-葡聚糖底物主链时)为至少10g/L，优选地50g/L至500g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且更优选地250g/L至450g/L。麦芽糊精底物将通常具有在3至40，优选地3至20范围内的DE；对应于3至约40，优选地6至40，并且最优选地6至25的DP范围)。
当存在于α-葡聚糖底物主链合成反应中时，用于α-葡聚糖水解酶的底物将为由主链合成酶(葡糖基转移酶、糊精右旋糖酐酶、4，6-α-葡糖基转移酶等)形成的葡萄糖低聚物群体的成员。存在于反应体系中的每种物质的实际浓度将变化。
α-(1，2)支化的可溶性葡聚糖纤维组合物的酶促合成
提供一种通过将α-(1，2)支链酶促添加到具有至少50％的α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物主链来合成本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。上文描述了制备α-葡聚糖底物主链的方法。
在一个方面，合适的反应组分包括至少一种具有α-(1，2)支化活性的多肽、蔗糖、和至少一种具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物。在“主链”中具有有效量的α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物可由下列合成：(1)使用至少一种葡聚糖蔗糖酶由蔗糖合成，(2)由接触至少一种糊精右旋糖酐酶、至少一种“Gtf-B型”4，6-α-葡糖基转移酶、以及它们的组合的经加工的淀粉或蔗糖获得的麦芽糊精，或者(3)它们的任意组合。具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物“主链”可在酶促添加α-(1，2)支链之前合成或可在包含至少一个具有α-(1，2)支链的多肽的相同反应混合物中同时合成，前体条件是具有α-(1，2)支化活性的多肽与用于合成具有有效量α-(1，6)糖苷键的α-葡聚糖底物“主链”的酶不同。在另一个方面，使用以下物质制备向其中添加α-(1，2)支链的α-葡聚糖底物“主链”：单一葡聚糖蔗糖酶、葡聚糖蔗糖酶的组合、至少葡聚糖蔗糖酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、右旋糖酐糊精酶、“GtfB型”葡糖基转移酶(即，4，6-α-葡糖基转移酶；Kralj等人，Appl.Env.Microbiol.(2011)77(22)：8154-8163)、糊精右旋糖酐酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、“GtfB-型”葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合、以及它们的任意组合。
在一个实施方案中，具有α-(1，2)支化活性的多肽为截短的葡糖基转移酶，其包含能够将α-(1，2)支链加入α-葡聚糖底物主链的催化域。在一个实施方案中，能够增加α-(1，2)支化的催化域还包含至少一个葡聚糖结合域。优选地，具有α-(1，2)支化活性的多肽是截短的葡糖基转移酶，其中不存在能够合成不是α-(1，2)糖苷键的键(即，主链合成域或“CD1”域存在于下列酶中：诸如来自肠膜明串珠菌肠膜亚种的GtfJ18葡糖基转移酶，参见 gi：356644413(SEQ ID NO：1)和来自肠膜明串珠菌NRRL B-1299的DsrE葡糖基转移酶，如 gi：23320943中报道的；SEQ ID NO：2)。在一个优选的实施方案中，具有α-(1，2)支化活性的多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同一性的氨基酸序列。在另一个优选的方面，具有α-(1，2)支化活性的多肽基本上由与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同一性的氨基酸序列组成。含水反应制剂中催化剂的浓度取决于每种催化剂的特定催化活性，并且对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。每种催化剂的重量通常在0.0001mg至20mg/mL总反应体积，优选地0.001mg至10mg/mL的范围内。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性支持体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂可为下列形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶以及它们的混合物。
最终反应制剂的pH值为约3至约8，优选约4至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约5.5至约7.5，甚至更优选约5.5至约6.5。可通过添加合适的缓冲液，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应的pH值。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至300mM，最优选10mM至100mM。
α-葡聚糖底物主链浓度的范围可根据主链是在酶促α-(1，2)支化之前合成还是主链与酶促α-(1，2)支化同时合成。在一个实施方案中，在引发α-(1，2)支化时α-葡聚糖底物主链浓度为至少10g/L，优选地50g/L至500g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且最优选地250g/L至450g/L。
在α-(1，2)支化反应期间所用的蔗糖底物浓度可变化。在一个实施方案中，当将反应组分混合时，最初存在的蔗糖浓度为至少50g/L，优选地50g/L至600g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且更优选地250g/L至450g/L。如果α-(1，2)支化反应与α-葡聚糖主链合成反应同时进行，则较高的蔗糖浓度可能是必要的。
在支化反应期间蔗糖与α-葡聚糖底物主链的重量比可变化。在一个实施方案中，蔗糖与α-葡聚糖底物主链的重量比在0.01∶1.0至1.0∶0.01的范围内。
反应的长度可变化并且可通常通过使用所有可获得的蔗糖底物所花费的时间量来测定。在一个实施方案中，进行反应直至消耗至少90％，优选地至少95％，并且最优选地至少99％的最初存在于反应混合物中的蔗糖。在另一个实施方案中，反应时间为1小时至168小时，优选地1小时至72小时，并且最优选地1小时至24小时。
当将反应组分混合时，最初存在的麦芽糊精底物浓度(在使用蔗糖酶促添加α-(1，2)直链的同时由麦芽糊精合成α-葡聚糖底物主链时)为至少10g/L，优选地50g/L至500g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且更优选地250g/L至450g/L。麦芽糊精底物将通常具有在3至40，优选地3至20范围内的DE；对应于3至约40，优选地6至40，并且最优选地6至25的DP范围)。
反应的长度可变化并且可通常通过使用所有可获得的蔗糖底物所花费的时间量来测定。在一个实施方案中，进行反应直至消耗至少90％，优选地至少95％，并且最优选地至少99％的最初存在于反应混合物中的麦芽糊精底物。在另一个实施方案中，反应时间为1小时至168小时，优选地1小时至120小时，并且最优选地1小时至72小时。
可选择酶促反应系统的温度以控制反应速率和所用酶催化剂的稳定性两者。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约60℃，优选的范围为5℃至约55℃，更优选的反应温度范围为约20℃至约47℃。
在“第一”实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.蔗糖；
ii.具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物主链包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；
iii.具有α-(1，2)支链活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列；所述多肽能够催化α-葡聚糖底物主链上的α-(1，2)糖苷键的合成；和
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
c.任选地，分离α-葡聚糖纤维组合物。
在上文的另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(d)将α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，α-葡聚糖底物包含1％至50％的α-(1，3)糖苷键。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，α-葡聚糖底物主链包含大于10％但少于40％的α-(1，4)糖苷键。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，α-葡聚糖纤维组合物包括：
a.在水中12重量％下小于10cps的粘度；
b.如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量的小于20％的消化度；
c.在25℃下，水中至少20％(w/w)的溶解度；和
d.小于5的多分散性指数。
在另一个实施方案中，提供了一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的反应条件下使蔗糖与至少一种葡糖基转移酶或至少一种葡糖基转移酶和至少一种葡聚糖水解酶的组合接触，从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物主链包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物主链与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.具有α-(1，2)支化活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将(b)的反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，步骤(a)的至少一种葡糖基水解酶包含具有与选自SEQ IDNO：7，9，10，11，12，13，14和16的氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，其中步骤(a)的至少一种葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合为：
a.至少一种葡糖基转移酶，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：14、16或它们的组合；以及
b.至少一种α-葡聚糖水解酶，其包含选自SEQ ID NO：21、23或它们的组合的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，提供了一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的含水反应条件下使麦芽糊精底物与以下物质接触：
i.糊精右旋糖酐酶或
ii.糊精右旋糖酐酶与至少一种α-葡聚糖水解酶的组合；从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物主链包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物主链与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物主链上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将(b)的反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供了一种在合适的含水反应条件下，制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.4，6-α-葡糖基转移酶或4，6-α-葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
iv.蔗糖；和
v.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将(a)的反应组分的系列混合，从而产生α-葡聚糖纤维组合物，其包含1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合；以及
c.任选地，分离步骤(b)的α-葡聚糖纤维组合物。
在对上述方法中任一个的另一个实施方案中，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物分离包括离心、过滤、分级、色谱分离、渗析、蒸发、稀释、或它们的任意组合中的任一个。
识别具有期望活性的基本上相似的酶的方法
本领域技术人员认识到，基本上相似的酶序列也可以用于本发明的组合物和方法中，只要保留期望的活性(即，能够形成具有期望的糖苷键的葡聚糖的葡糖基转移酶活性或α-葡聚糖水解酶具有针对一个或多个目标糖苷键的内切水解酶活性)即可。例如，已经展示了可制备和使用催化活性截短形式，只要保留期望的活性(或甚至在特定活性方面改善)即可。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行定义。在另一个实施方案中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。
如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Iaboratorv Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高度严格的杂交条件是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且2X SSC，0.1％SDS洗涤，之后是0.1X SSC，0.1％SDS的最终洗涤。
杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook，J.和Russell，D.，T.，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，甚至更优选至少30个核苷酸，甚至更优选至少300个核苷酸，最优选至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
如本文所用，术语“百分比同一性”为两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的核苷酸或氨基酸的匹配数确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，编辑)，Oxford University出版社，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic出版社，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.与Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic出版社(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.与Devereux，J.编辑)Stockton出版社，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends inGenetics 16，(6)：276-277(2000))。可使用比对的CLUSTAL方法(诸如CLUSTALW；例如版本1.83)利用默认参数来进行序列的多重比对(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)以及Chenna等人，Nucleic AcidsRes 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自EuropeanMolecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existencepenalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1，protein GAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。另选地，可将使用CLUSTALW方法(例如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、WINDOW＝5、以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在一个方面，合适的分离核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。在另一方面，合适的分离核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％与本文报道的氨基酸序列相同；前提条件是所述多肽维持了相应活性(即葡糖基转移酶或α-葡聚糖水解酶活性)。
获得酶促制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法
可将任何数量的常用纯化技术用于从反应体系中获得本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其包括但不限于离心、过滤、分级、色谱分离、渗析、蒸发、沉淀、稀释或它们的任意组合，优选地通过渗析或色谱分离，最优选地通过渗析(超滤)。
重组微生物表达
本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。酶可在细胞内、细胞外或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的示例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，真菌宿主细胞是木霉属，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属以及假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。
大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，例如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能源)来影响生长速率的调节。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区和控制转录终止的DNA片段3′区。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。
可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实质上能够驱动这些基因的任何启动子均适用于本发明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母菌中表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)、以及amy、apr、npr启动子和用于在芽孢杆菌中表达的各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含的终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产
多种培养方法可用来制备酶。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且示例可见于Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)的Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和Julian E.Davis(编辑)，(ASM出版社，Washington，DC(2010))。
所需酶的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。另选地，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支持体进行，所述固体支持体由天然材料和/或合成材料组成。
从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内产生酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，产生出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。另选地，可通过加入多元醇如麦芽糊精、山梨醇或丙二醇，任选向其中加入防腐剂如山梨酸、山梨酸钠或苯甲酸钠，将所得部分纯化的酶催化剂溶液稳定为液体制剂。
可溶性α-葡聚糖纤维的制备可以通过在任何合适的水性反应条件下将所得的一种或多种酶混合来进行，所述反应条件导致可溶性α-葡聚糖纤维的产生，诸如本文所公开的条件。反应可在水溶液中进行，或者在某些实施方案中，反应可在食物产品内原位进行。使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法是本领域所熟知的。在某些实施方案中，将酶催化剂加入包含蔗糖的液体食物产品中。酶催化剂可减少液体食物产品中蔗糖的量，同时增加可溶性α-葡聚糖纤维和果糖的量。适于使用多肽材料(即酶催化剂)在食物产品内原位产生纤维的方法可见于WO2013/182686，其内容以引用方式并入本文，用于对使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法的公开。
当含量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点以及在该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。
特定实施方案的描述
在第一实施方案中(“第一实施方案”)，提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.下列的范围：
i.0％至50％，优选地3％至50％的α-(1，3)糖苷键，或
ii.0至少于40％的α-(1，4)糖苷键；优选地15至35％的α-(1，4)糖苷键；或
iii.(i)和(ii)的任意组合；
b.1至50％，优选地1至40％，更优选地2至30％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合；
c.0-25％的α-(1，3，6)糖苷键；优选地其中α-(1，3)糖苷键和α-(1，3，6)糖苷键的组合为3％至50％；
d.少于99％的α-(1，6)糖苷键；
e.小于300000道尔顿，优选地在1500至300000Da，更优选地1500至150000Da，更优选地1500至40000Da，并且甚至更优选地1500至20000Da范围内的重均分子量；
f.水中在12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)，优选地0.01帕斯卡秒(Pa·s)；优选地小于0.007帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
g.如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量的小于20％，优选地小于15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的消化度；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)，优选地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度；和
i.小于26，优选小于5的多分散性指数。
在第二实施方案中，提供一种碳水化合物组合物，其包含0.01至99重量％(基于干固体)，优选地10至90重量％的上文第一实施方案中所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在第三实施方案中，提供一种食物产品、个人护理产品或药学产品，其包含第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或包含第二实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
在第四实施方案中，提供一种低龋性组合物，其包含第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
在第五实施方案中，提供一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.蔗糖；
ii.具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；优选地其中所述α-葡聚糖底物主链还包含1％至50％的α-(1，3)糖苷键；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物主链上的α-(1，2)糖苷键的合成；和
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键；优选地1至40％，并且最优选地2至30％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
c.任选地，分离α-葡聚糖纤维组合物。
在对上述实施方案的另一个实施方案中，α-葡聚糖底物主链包含大于10％但少于40％的α-(1，4)糖苷键。
在对上述实施方案中任一个的另一个实施方案中，由上述实施方案形成的α-葡聚糖纤维组合物包括：
a.在20℃下，在水中12重量％下小于0.01 10cps帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
b.如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量的小于20％的消化度；
c.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
d.小于5的多分散性指数。
在第六实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的反应条件下使蔗糖与至少一种葡糖基转移酶或至少一种葡糖基转移酶和至少一种葡聚糖水解酶的组合接触，从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在第七实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.在适当的含水反应条件下使麦芽糊精底物与以下物质接触：
i.糊精右旋糖酐酶或
ii.糊精右旋糖酐酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合；
从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物主链，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物主链与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而所述多肽催化包含1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
在另一个实施方案中，提供一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.麦芽糊精底物；
ii.糊精糊精酶；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
iv.蔗糖；和
v.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合，从而形成包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物；以及
c.任选地，分离步骤(b)的α-葡聚糖纤维组合物。
在所述方法中任一个的一些实施方案中，在适当的含水反应条件下将反应组分的系列混合的步骤包括将食物产品中的反应组分的系列混合。
除了上述方法实施方案中的任一个，制备α-葡聚糖纤维组合物的方法还包括步骤(d)，浓缩α-葡聚糖纤维组合物。
除了上述方法实施方案中的任一个，当将反应组分的系列混合时，所述蔗糖浓度最初还为至少50g/L；优选地至少200g/L。
除了上述方法实施方案中的任一个，存在于反应中的α-葡聚糖底物主链与蔗糖的重量比还在0.01∶1至1∶0.01的范围内。
在另一个实施方案中，提供一种制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与以下物质混合：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供一种制备食物产品、个人护理产品或药学产品的方法，所述方法包括，将一种或多种可食用食物成分、美容上可接受的成分或药学上可接受的成分分别与第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物、第二实施方案的碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食物或饮料中。
在另一个实施方案中，提供一种抑制哺乳动物中血糖水平升高、降低活体中脂质、治疗便秘、或减少通过肠胃时间的方法，所述方法包括将第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供一种改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括将本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加和/或支链脂肪酸产生减少。
在另一个实施方案中，还提供第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中α-葡聚糖纤维组合物包含小于10％，优选地小于5重量％，并且最优选地小于1重量％或更小的还原糖。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于介于1500和90,000g/mol之间，优选地1500至30,000g/mol，更优选地1500至20,000，并且更优选地3000至16000g/mol之间的数均分子量(Mn)。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中碳水化合物组合物还包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中所述碳水化合物组合物呈液体、糖浆、粉末、颗粒、成形球、成形棒，成形板、成形立方体、片剂、粉末、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
根据上述实施方案中任一个所述的组合物或方法，其中所述食物产品为：
a.焙烤食物，其选自：蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团、挤出谷物片和包衣谷物片；
b.乳制品，其选自：酸奶、酸奶饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、脱脂凝乳和打发的慕斯型产品
c.糖果，其选自：硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖、焦糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖、太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果干；
d.饮料，其选自：碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物、清水、以及饮料干混合物；
e.小吃棒、烤酥饼、甜甜圈或曲奇的高固体填充物；
f.挤出和成片的小吃，其选自：膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片；
g.小吃棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒；
h.奶酪、奶酪酱和其它可使用的奶酪制品；
i.可食用膜；
j.水溶性汤、糖浆、酱汁、调味品、或咖啡奶精；或者
k.膳食补充剂；优选地呈片剂、粉末、胶囊或香囊的形式。
一种组合物，其包含0.01至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物和以下物质：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生生物或它们的任意组合。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中分离步骤包括离心、过滤、分级、色谱分离、渗析、蒸发、稀释、或它们的任意组合中任一个。
根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中当不与α-葡聚糖水解酶一起使用时，用于合成α-葡聚糖底物主链的葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：7，9，10，11，12，13，14或16；优选地7，9，10，11，12或13具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶或突变酶。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中当将反应组分的系列混合时，所述麦芽糊精底物浓度最初为至少20g/L。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中糊精右旋糖酐酶活性与内切右旋糖酐酶活性的比率在0.01∶1至1∶0.01的范围内。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括介于0℃和45℃之间的反应温度。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括介于3至8之间，优选地4至8之间的pH范围。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中合适的含水反应条件包括缓冲液，其选自磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐和柠檬酸盐。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中所述具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：26具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中所述至少一种包含α-葡聚糖水解酶活性的多肽包含糊精酶活性，优选地内切右旋糖酐酶活性，优选地来自毛壳菌的内切右旋糖酐酶，更优选地来自毛壳菌的糊精酶L，并且最优选地 Plus L。在优选的实施方案中，右旋糖酐酶适用于食物中并且公认为是安全的(GRAS)。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中包含α-葡聚糖水解酶活性的至少一种多肽包含突变酶活性，优选的内切突变酶活性，优选地包含与SEQ ID NO：21或23具有至少90％同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ IDNO：14或16具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且所述内切突变酶包含与21或23具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中α-葡聚糖基底主链使用4，6-α-葡糖基转移酶(Gtf-B型)由麦芽糊精合成，所述4，6-α-葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：68、69或70具有至少90％同一性，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
根据上述实施方案中任一个所述的方法，其中使用具有麦芽蔗糖酶活性的多肽合成麦芽糊精底物，所述多肽优选地包含与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性，更优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
通过上述方法实施方案中任一个制备的产物；优选地，其中所述制备的产物为第一实施方案的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
实施例
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D版，John Wiley和Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为本领域技术人员提供了用于本发明的许多术语的通用字典。
本发明在以下实施例中进一步限定。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写的含义如下：“sec”或“s”表示秒，“ms”表示毫秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mL/min”是毫升每分钟，“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是LB培养基；“μm”是微米，“nm”是纳米；“OD”是光学密度；“IPTG”是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是重力；“mM”是毫摩尔；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是标称；“w/v”是重力/体积；“DTT”是二硫苏糖醇；“BCA”是二喹啉甲酸；“DMAc”是N，N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化锂，“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亚砜；“SEC”是尺寸排阻色谱；“GI”或“gi”表示GenInfo标识符，由和其它序列数据库使用的系统以唯一地识别相应数据库内的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指在长度内具有“x”个单元的葡聚糖聚合物度；“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“DSMZ”和“DSM”将是指莱布尼茨研究所-德国微生物菌种保藏中(Braunschweig，Germany)；“EELA”是芬兰食物安全局(Helsinki，Finland)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大学文化收藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；并且“Rxn”是指反应。
一般方法
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY (2001)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press Cold Spring Harbor，NY (1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols and John Wiley andSons，Inc.，N.Y.，2002。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于如下实施例的技术可见于如下文献列出的内容中：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society forMicrobiology，Washington，DC.(1994))，Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和Julian E.Davis(编辑)，(American Society of Microbiology出版社，Washington，DC(2010))。
除非另外说明，所有用于培养并维持细菌细胞的试剂、限制性酶和材料均获取自BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)，Invitrogen/Life Technologies Corp.(Carlsbad，CA)，Life Technologies(Rockville，MD)，QIAGEN(Valencia，CA)，Sigma-AldrichChemical Company(St.Louis，MO)或Pierce Chemical Co.(Thermo Fisher ScientificInc.的分公司(Rockford，IL)。IPTG(目录号I6758)和三苯基四唑氯化物得自Sigma Co.(St.Louis，MO)。BELLCO旋转烧瓶得自Bellco Co.(Vineland，NJ)。LB培养基得自Becton，Dickinson and Company(Franklin Lakes，New Jersey)。BCA蛋白质测定得自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。
用于生产GTF酶的重组大肠杆菌菌株的生长
在37℃和220rpm下，使用具有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基，使表达功能性GTF酶的大肠杆菌菌株在摇瓶中生长至OD600nm＝0.4-0.5，此时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.5mM，并且在37℃下继续温育2-4小时。通过在5,000xg下离心15分钟收获细胞并且重新悬浮于pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液中(20％-25％湿细胞重量/v)。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)以确保＞95％的细胞裂解。细胞裂解物在12,000xg和4℃下离心30分钟。通过BCA蛋白质测定和SDS-PAGE分析所得上清液(细胞提取物)以确认GTF酶的表达，并将细胞提取物储存在-80℃。
pHYT载体
pHYT载体主链是包含枯草芽孢杆菌aprE启动子的复制性枯草芽孢杆菌表达质粒。其衍生自大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY320PLK(登录号D00946，并且可从Takara Bio Inc.(Otsu，Japan)商购获得)。大肠杆菌和氨苄青霉素抗性基因的复制起点是从pACYC177( X06402，并且可从New England Biolabs Inc.(Ipswich，MA)商购获得)枯草芽孢杆菌和四环素抗性基因的复制起点是从pAMalpha-1(Francia等人，J Bacteriol.2002年9月；184(18)：5187-93)。
为构建pHYT，在四环素抗性基因之后插入来自噬菌体λ的终止子序列：5’-ATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO：32)。使用破坏HindIII位点的BamHI-HindIII接头，将包含aprE启动子-编码感兴趣的酶的序列(例如，编码各种GTF的序列)的AprE信号肽序列-BPN’终止子的整个表达盒(EcoRI-BamHI片段)克隆到pHYT的EcoRI和HindIII位点中。接头序列为5’-GGATCCTGACTGCCTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：33)。aprE启动子和AprE信号肽序列(SEQ ID NO：34)对于枯草芽孢杆菌是天然的。BPN′终止子来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在使用天然信号肽的情况下，用经表达基因的天然信号肽替换AprE信号肽。
里氏木霉的生物转化
将里氏木霉孢子悬浮液涂布在直径为～6cm的乙酰胺酶转化平板(150μL的5×107-5×108个孢子/mL悬浮液)的中心上。然后将板在生物罩中空气干燥。将停止屏(BioRad165-2336)和大载体支架(BioRad 1652322)浸泡在70％乙醇中并空气干燥。将干燥剂(硫酸钙干燥剂；W.A.Hammond Company(Xenia，OH)置于小培养皿(6cm Pyrex)中并用Whatman滤纸(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA)覆盖。将包含大载体(BioRad 165-2335；Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA))的大载体支架平放在滤纸的顶部上并更换培养皿盖。通过将60mg钨M-10颗粒(微载体，0.7微米，BioRad # 1652266，Bio-Rad Laboratories)加入到Eppendorf管中来制备钨颗粒悬浮液。加入乙醇(1mL)(100％)。将钨在乙醇溶液中涡旋并使其浸泡15分钟。将Eppendorf管以最大速度短暂地微离心以使钨成丸状。滗出乙醇并利用无菌蒸馏水洗涤三次。在第三次滗出洗涤水之后，将钨重新悬浮于1mL的无菌50％甘油中。通过向1.5mL-Eppendorf管中加入25μL悬浮的钨准备转化反应用于每个转化。后续添加按如下顺序进行：2μL DNA pTrex3表达载体(SEQ ID NO：24；参见美国专利6,426,410)、25μL 2.5M CaCl2、10μL 0.1M亚精胺。将反应连续涡旋5-10分钟，从而保持钨悬浮。然后将Eppendorf管短暂微离心并且滗出。将钨粒料利用200μL的70％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗析。所述粒料用200μL的100％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗析。将钨粒料重新悬浮于24μL 100％乙醇中。将Eppendorf管置于超声水浴中并持续15秒，并将8μL等分试样转移到经干燥的大载体的中心上。将大载体保留在经干燥的培养皿中干燥。
将氦气罐打开至1500psi(～10.3MPa)。将1100psi(～7.58MPa)破裂盘(BioRad165-2329)用于型号PDS-1000/HeTM 颗粒递送体系(BioRad)中。当将钨溶液干燥时，加工停止屏和大载体支架插入PDS-1000中。将包含目标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板放置在停止屏下6cm处。对室抽29英寸Hg(～98.2kPa)的真空并保持。将He颗粒递送体系焙烧。将所述室放气，取出乙酰胺酶平板以在28℃下温育，直至出现菌落(5天)。
改性的amdS Biolistic琼脂(MABA)/升
第I部分，在500mL蒸馏水(dH2O)中制备
1000x盐1mL
Noble琼脂20g
pH至6.0，高压釜
第II部分，在500mL dH2O中制备
乙酰胺0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖 20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
pH至4.5，0.2微米过滤灭菌；置于50℃烘箱中加热，加入琼脂，混合，倾注平皿。在室温下贮存(～21℃)
1000x盐/升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
CoCl2·6H2O 1g
达到1L dH2O。
0.2微米过滤灭菌
测定葡糖基转移酶活性
葡糖基转移酶活性测定通过以下过程进行：在存在或不存在25g/L右旋糖苷(MW～1500，Sigma-Aldrich，目录号31394)的情况下，在37℃和125rpm轨道摇动下，用含200g/L蔗糖的25mM或50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5下)温育包含GTF酶的1-10％(v/v)粗蛋白提取物。在1h、2h和3h时取出一份反应混合物的等分试样并在90℃加热5min以使GTF失活。通过在13,000xg下离心5分钟来去除不溶性材料，之后使其过滤通过0.2μm RC(再生纤维素)膜。在85℃下采用两个串联Aminex HPX-87C柱通过HPLC分析所得滤液(Bio-Rad，Hercules，CA)来定量蔗糖浓度。相对于反应时间绘出各个时间点的蔗糖浓度并由线性曲线的斜率确定初始反应速率。一个GTF活性单位定义为在测定条件下每分钟消耗一微摩尔的蔗糖所需的酶量。
测定α-葡聚糖水解酶活性
使用由远缘链球菌33478TM产生的分泌的酶来制备测定突变酶活性所需的不溶性变聚糖聚合物。具体地，将远缘链球菌33478TM的甘油原液的一个环在BHI琼脂板(Brain Heart Infusion agar，Teknova(Hollister，CA)上划线，并且将板在37℃下温育2天；使用环挑取几个菌落以接种来自Teknova的原始培养基瓶中的2X 100mL BHI液体培养基，并且将培养物在37℃下温育，静置24h。通过离心移除所得的细胞并且通过0.2μm无菌过滤器将所得的上清液过滤；收集2X 101mL的滤液。向滤液中添加2X 11.2mL的200g/L蔗糖(最终蔗糖20g/L)。在未搅拌情况下，使反应于37℃温育67h。通过在5000xg下离心10min来收集所得多糖聚合物。小心地滗出上清液。用40mL的无菌水将不溶性聚合物洗涤4次。使所得的变聚糖聚合物冻干48h。使变聚糖聚合物(390mg)悬浮于39mL的无菌水中以制备10mg/mL悬浮液。通过超声处理(40％幅值直至较大团块消失，总计～10min)均化变聚糖悬浮液。将匀化的悬浮液分成等份并在4℃储存。
通过在pH 5.5和37℃下用含有0.5mg/mL变聚糖聚合物(如上所述制备的)的25mMKOAc缓冲液温育合适量的酶，开始突变酶测定。在各个时间点，取出等分试样的反应混合物并用等体积的100mM甘氨酸缓冲液(pH 10)淬灭。通过在14,000xg下离心5min移除各个经淬灭样本中的不溶性材料。通过对羟基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(Lever M.，Anal.Biochem.，(1972)47：273-279)测定对各个时间点产生的寡糖和多糖聚合物的还原端进行定量，并且初始速率由时间过程中最初三个或四个时间点的线性曲线图的斜率来确定。通过将10μL的反应样本上清液添加至100μL的PAHBAH工作溶液中进行PAHBAH测定并在95℃加热5min。通过混合一份试剂A(0.05g/mL对羟基苯甲酸酰肼和5体积％的浓盐酸)与四份试剂B(0.05g/mL NaOH、0.2g/mL酒石酸钾钠)来制备工作溶液。记录410nm处的吸光度，并且通过减去适当的背景吸收并使用各种浓度的葡萄糖(作为标准物)产生的标准曲线来计算还原端的浓度。
测定糖苷键
在使用高灵敏度冷冻探针以500MHz操作的Varian Unity Inova系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)上采集一维1H NMR数据。通过将观测发射器频率小心地置于“普氏(presat)”实验的残余水信号的共振处，并然后使用具有完整相位循环(32多次)和10ms的混合时间的“tnnoesy”实验获得水抑制。
通常，将干燥的样本溶解在1.0mL的D2O中并超声处理30分钟。从样本的可溶部分中，将100μL连同350μL D2O和包含15.3mM DSS(4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐)作为内标和0.29％NaN3作为杀菌剂的100μLD2O一起加入5mm NMR管中。通过将相应的化学位移处的峰面积积分来测量每种类型的异头键的丰度。每种类型的异头键的百分比由特定键的丰度和来自寡糖的异头键总丰度计算。
甲基化分析
葡聚糖中糖苷键的分布通过通常称为“甲基化分析”或“部分甲基化分析”的公知技术来测定(参见：F.A.Pettolino等人，Nature Protocols，(2012)7(9)：1590-1607)。所述技术具有多个细微变化但常常包括：1.将葡萄糖单元的所有游离羟基基团甲基化，2.将甲基化的葡聚糖水解成独立的单体单元；3.还原开环以消除异头物并形成甲基化的葡萄糖醇；异头碳通常用氘原子标记以形成不同的质谱；4.游离羟基乙酰化(通过水解和开环形成)以产生部分甲基化的乙酸葡萄糖醇酯，也被称为部分甲基化产物，5.通过与质谱法和/或火焰离子化检测偶联的气相色谱分析所得的部分甲基化产物。
部分甲基化产物包括非还原性末端葡萄糖单元、连接单元和支化点。单独的产物通过保留时间和质谱来识别。部分甲基化产物的分布是每种产物占所有部分甲基化产物的总峰面积的百分比(面积％)。气相色谱条件如下：RTx-225柱(30m×250μm ID×0.1μm膜厚度，Restek Corporation，Bellefonte(PA，USA)，氦载气(0.9mL/min恒定流量)，烘箱温度程序在80℃下起始(保持2分钟)，然后30℃/min至170℃(保持0分钟)，然后4℃/min至240℃(保持25分钟)，1μL进样量(分成5∶1)，使用电子轰击质谱(全扫描模式)检测。
粘度测量
使用配备有锥体和板状几何形状的TA Instruments AR-G2控制应力旋转流变仪(TA Instruments-Waters，LLC(New Castle，DE)测量可溶性纤维的12重量％水性溶液的粘度。该几何形状由两者均具有光滑表面的40mm 2°的上锥体和peltier下板组成。在测试期间，配备有经水饱和海绵的环境室用于使溶剂(水)蒸发最小化。在20℃下测量粘度。将peltier设置为期望的温度，并使用Eppendorf移液管(Eppendorf North America，Hauppauge，NY)将0.65mL的样本加载到板上。将锥体降低至锥体底部和板之间50μm的间隙。将样本热平衡3分钟。在500-10s-1的剪切速率范围内进行剪切速率扫描。通过在测试结束时运行重复剪切速率点来确认样本稳定性。
测定蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的浓度
通过利用两个串联的Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)的HPLC定量蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖。所用的色谱条件为在柱和检测器隔室处85℃，在样本和注射器隔室处40℃，流量为0.6mL/min，并且进样量为10μL。用于数据还原的软件包是来自Waters(Waters Corp.，Milford，MA)的EMPOWERTM版本3。用各种浓度的标准品对每种单独的糖进行校准。
测定寡糖的浓度
可溶性寡糖通过利用两个串联Aminex HPX-42A柱(Bio-Rad)的HPLC来定量。所用的色谱条件为85℃柱温和40℃检测器温度，水作为移动相(流量为0.6mL/min)，并且进样量为10μL。用于数据还原的软件包为来自Waters Corp.的EMPOWERTM版本3。DP2至DP7的寡糖样本得自Sigma-Aldrich：麦芽七糖(DP7，目录号47872)、麦芽六糖(DP6，目录号47873)、麦芽五糖(DP5，目录号47876)、麦芽四糖(DP4，目录号47877)、麦芽三糖(DP3，目录号47884)和麦芽糖(DP2，目录号47288)。利用各种浓度的标准品对每种单独的寡糖进行校准。
测定消化度
消化度测试方案改编自Megazyme Integrated总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应的总体积为1mL，而不是由初始方案建议的40mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样本。详细方案描述如下：
通过将来自Integrated总膳食纤维测定盒的20mg纯化的猪胰腺α-淀粉酶(150,000单位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的马来酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0加2mM CaCl2)中并搅拌5分钟，之后从添加来自相同试剂盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300单位/mL)来制备酶原液。然后在玻璃小瓶中将0.5mL酶原液与0.5mL可溶性纤维样本(50mg/mL)混合，并将消化反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16H。对于每种纤维样本平行进行重复反应。通过将0.5mL马来酸盐缓冲液(50m，pH 6.0加上2mM CaCl2)和0.5mL可溶性纤维样本(50mg/mL)混合，并且反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16H，一式两份进行对照反应。在16h之后，从培养箱中移除所有样本并且立即加入75μL的0.75M碱性溶液以终止反应。将小瓶立即置于95-100℃的加热块中，并且温育20分钟，偶尔振摇(用手)。淬灭之后，每种反应混合物的总体积为1.075mL。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每个反应中释放的葡萄糖量。将麦芽糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照。为计算消化度，使用下式：
消化度＝100％*[用酶处理后释放的葡萄糖量(mg)-酶不存在时释放的葡萄糖量(mg)]/1.1*总纤维量(mg)″
可溶性寡糖纤维的纯化
通过尺寸排阻柱层析(SEC)纯化和分离存在于产物混合物中的可溶性寡糖纤维，所述产物混合物通过在具有或不具有添加的突变酶的情况下使用葡糖基转移酶转化蔗糖制备，如以下实施例中所述。在典型的程序中，将产物混合物在60℃至90℃下热处理15分钟至30分钟，并且然后在4000rpm下离心10分钟。将所得的上清液注入纯化系统(SEC；GE Healthcare Life Sciences)(10mL-50mL注入量)中，所述纯化系统连接至装填有1.1L的Bio-Gel P2凝胶(Bio-Rad，细，45-90μm)的GE HK 50/60柱，其使用水作为洗脱剂以0.7mL/min洗脱。使用Bio-Rad HPX-47A柱，通过HPLC分析寡糖的SEC级分(～5mL/管)。将包含＞DP2寡糖的级分混合，并通过旋转蒸发混合的级分来分离可溶性纤维，以产生包含3重量/重量％至6重量/重量％固体的溶液，其中将所得溶液冻干以产生可溶性纤维作为固体产物。
纯培养物在特定碳源上的生长
为测试微生物在特定碳源(寡糖或多糖可溶性纤维)上生长的能力，选择的微生物在不含除了研究下的碳源之外的碳源的适当培养基中生长。通过在无氧环境(80％N2、10％CO2、10％H2)中在600nm下定期(每30分钟)测量光学密度来评价生长。生长表示为曲线下面积并且与阳性对照(葡萄糖)和阴性对照(不添加碳源)比较。
寡糖可溶性纤维的原液(10％w/w)在脱矿质水中制备。所述溶液通过UV辐射或过滤(0.2μm)来灭菌。将原液冷冻储存直至使用。适当的不含碳源培养基由单一成分制备。测试生物体在具有标准碳源的测试培养基中厌氧预生长。将20μL原液移入蜂窝孔中，并加入180μL不含碳源的培养基与1％测试微生物。作为阳性对照，将葡萄糖用作碳源，并且作为阴性对照，不使用碳源。为确认原液的无菌性，使用未接种的孔。每次运行使用至少三个平行孔。
将蜂窝板置于Bioscreen中，通过测量600nm下的吸光度来测定生长。每30分钟进行测量，并且在测量之前，将板振摇以确保微生物的均匀悬浮。允许生长24小时。结果计算为曲线下面积(即，OD600/24h)。测试的生物体(以及它们的相应生长培养基)为：产气荚膜梭菌3626TM(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid MicrobiologyProducts，ThermoScientific)、艰难梭菌DSM 1296(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturen DSMZ，Braunschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid Microbiology Products，Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，MA)、大肠杆菌11775TM(不具有葡萄糖的厌氧胰蛋白酶大豆肉汤)、鼠伤寒沙门氏菌EELA(购自DSMZ，Brauchschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧胰蛋白酶大豆肉汤)、嗜酸乳杆菌NCFM 145(不具有葡萄糖的厌氧(de Man、Rogosa和Sharpe)培养基(得自DSMZ))、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi-07(厌氧的Deutsche Sammlung vomMikroorgnismen und Zellkulturen培养基58(得自DSMZ)，不具有葡萄糖)。
体外气体产生
为了测量由肠道微生物群形成气体，将预调理的粪便浆液与测试益生元(寡糖或多糖可溶性纤维)一起温育，并测量形成的气体体积。新鲜粪便材料通过用3份(重量/体积)厌氧模拟培养基稀释，在厌氧条件下搅拌1小时并通过0.3-mm金属网过滤，此后将其在37℃厌氧温育24小时来预调理。
模拟器培养基如G.T.Macfarlane等人所述组成(Microb.Ecol.35(2)：180-7(1998))，其包含在蒸馏水中的以下成分(g/L)：淀粉(BDH Ltd.)，5.0；蛋白胨，0.05；胰蛋白胨，5.0；酵母提取物，5.0；NaCl，4.5；KCl，4.5；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；酪蛋白(BDHLtd.)，3.0；果胶(柑橘)，2.0；木聚糖(oatspelt)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(落叶松木)，2.0；NaHCO3，1.5；MgSO4，1.25；瓜耳胶，1.0；菊粉，1.0；半胱氨酸，0.8；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；胆汁盐3号，0.4；CaCl2×6H2O，0.15；FeSO4×7H2O，0.005；血红素，0.05；和Tween 80，1.0；半胱氨酸盐酸盐，6.3；Na2S×9H2O和作为持续厌氧条件的指示的0.1％刃天青。将模拟培养基通过0.3mm金属网过滤，并分入密封的血清瓶中。
将测试益生元从10％(w/w)原液添加至最终浓度为1％。在37℃下进行温育，同时维持厌氧条件。在使用带刻度的气密玻璃注射器，在24小时温育后手动测量由于微生物活性的气体产生，从而也从模拟单元释放过压。
实施例1
截短的葡糖基转移酶在具有α-(1，2)支化活性的大肠杆菌中的表达
以下实施例描述了全长葡糖基转移酶和该酶的截短型式在大肠杆菌中的表达，并且测试它们在葡聚糖主链上的α-(1，2)支化活性。全长葡糖基转移酶产生具有很少α-(1，2)支链的葡聚糖。葡糖基转移酶的截短型式产生具有足量α-(1，2)支链的葡聚糖。
来自肠膜明串珠菌J18的推定的葡糖基转移酶( gi：356644413)(命名为GtfJ18)具有2771个氨基酸(SEQ ID NO：1)。其由从Kimchi分离的J18菌株的完全基因组测序被识别为葡糖基水解酶(Jung等人，J.Bacteriol.194：730(2012))。GtfJ18的全长序列(长度为2771个氨基酸)具有与来自肠膜明串珠菌NRRL B-1299( gi：23320943)的DsrE蛋白质(长度为2835个氨基酸；SEQ ID NO：2)68.6％氨基酸同一性。DsrE蛋白之前是葡糖基转移酶的GH70家族中唯一的酶，其显示为具有两个催化域的双功能蛋白质(Bozonnet等人，J.Bacteriol.184：5763(2002))。第一催化域“CD1”催化α-(1，6)键的合成并且第二催化域“CD2”催化α-(1，2)键的合成。CD1和CD2域被葡聚糖结合域“GBD”分开(Fabre等人，J.Bacteriol.187：296(2005))。DsrE和GtfJ18的CD1域共享79.3％氨基酸同一性并且两个蛋白质的CD2域共享76.6％氨基酸同一性。
GtfJ18的N末端20个氨基酸片段由SignalP 4.0程序(Nordahl等人，(2011)NatureMethods，8：785-786)推导为信号肽。为构造全长gtfJ18表达质粒，编码不具有信号肽(SEQID NO：4)的成熟蛋白质的DNA(SEQ ID NO：3)由GenScript USA Inc.(Piscataway，NJ)合成。将合成基因亚克隆到pET23D+载体(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)的NheI和HindIII位点中。将包含C末端CD2域和GBD域的部分(SEQ ID NO：1的氨基酸残基1664-2771)的gtfJ18的截短版本(SEQ ID NO：6)的多肽(SEQ ID NO：5)也亚克隆到pET23D+载体中。将表达全长gtfJ18基因和截短的gtfJ18Tl基因的质粒转化到大肠杆菌BL21 DE3宿主中，从而制备菌株EC0059和EC0059T1。EC0059和EC0059T1的细胞生长至OD～0.5并且在37℃下用1mM IPTG诱导3小时，或者另选地将它们在23℃下诱导过夜。细胞通过在4000xg下离心10min来收集，并且重新悬浮于pH 6.8的PBS缓冲液中。通过在14,000psi(～96.53MPa)下通过French细胞压碎机两次破碎细胞，并且通过在15,000xg下离心20分钟来将细胞碎片造粒。将粗酶提取物的上清液等分并在-80℃下冷冻。
每种酶(EC0059；SEQ ID NO：4)和EC0059T1(SEQ ID NO：6)的活性利用由SG1018制备的葡聚糖主链独立地测试。SG1018为具有9个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌BG6006菌株(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)，其表达来自仓鼠链球菌HS-6(GtfHS-6)的葡糖基转移酶( gi：357235604)。来自仓鼠链球菌HS-6(表示为GtfHS-6)的推定的葡糖基转移酶( gi：357235604；SEQ ID NO：7)具有1338个氨基酸，其具有由SignalP 4.0程序推定为信号肽的N末端36个氨基酸。带其天然信号肽编码序列的全长天然编码序列(SEQ ID NO：8)通过GenScript合成并且在枯草芽孢杆菌aprE启动子下，克隆到复制性芽孢杆菌表达质粒pHYT(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)的SpeI和HindIII位点。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在氨苄青霉素(100ug/mL)板上进行选择。然后将确认的克隆体pDCQ918转化到枯草芽孢杆菌BG6006菌株中，并在四环素(12.5μg/mL)板上选择。SG1018菌株首先在包含10μg/mL四环素的LB中生长，然后传代培养到包含12.5μg/mL四环素的GrantsII培养基中，在37℃下生长2-3天。在15,000xg和4℃下使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22μm过滤器。使用10％的SG1018上清液与100g/L蔗糖、pH 5的10mM柠檬酸钠和1mM CaCl2建立葡聚糖主链反应。所有蔗糖在37℃下6小时之后消耗并且由来自SG1018(SEQ ID NO：7)的葡糖基转移酶GtfHS-6产生的葡聚糖具有约3000的分子量并且由几乎100％的α-(1，6)键组成。支化反应在使GtfHS-6在95℃下加热灭活30min之后利用70％的葡聚糖主链建立。以10％(v/v)的来自EC0059或EC0059T1的粗细胞提取物形式提供的支化酶与40g/L蔗糖一起添加。支化反应在37℃或30℃下温育22小时，并且由HPLC分析产物的蔗糖消耗，由NMR分析键特征。
在使用5-mm低温三联共振脉冲场梯度探头的于500MHz(对于1H)下工作的AgilentDD2光谱仪(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)上采集NMR数据。通过将观测发射器频率小心地置于“普氏(presat)”实验的残余水信号的共振处，并然后使用具有完整相位循环(32多次)和10ms的混合时间的NOESY实验的第一数据片(slice)获得水抑制。以6410Hz的光谱宽度，5.1s的采集时间，65536个数据点，4s预饱和和90度观察脉冲采集一维1H谱。信号平均通常涉及64次扫描的累积。将样本温度保持在25℃。
通过将50或100μL连同包含12.4mM的4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐(DSS)作为内部化学位移参考的60μL D2O一起加入5mm NMR管中，并且加入剩余的(450或400μL)的D2O以获得560μL的总体积。将DSS甲基共振设定为0ppm。
不同异头键的化学位移定位得自Goffin等人，(Bull Korean Chem.Soc.30：2535(2009))。在α-(1，6)主链上α-(1，2)支化的特异性定位从Maina等人(Carb.Res.343：1446(2008))获得。(1，6)主链上的α-(1，2)取代(α-1-2，6键)导致邻近取代位点的异头H的特征化学位移(5.18ppm)。(1-2)连接的糖的异头H(5.10ppm)在反应混合物中被明串珠菌二糖掩盖，但在纯化的样本中直接观察到。
具有EC0059提取物(包含GtfJ18；SEQ ID NO：4)的产物包含97％的α-(1，6)键和仅0.6％的α-(1，2)键。具有EC0059T1提取物的产物包含82％的α-(1，6)键和18％的α-(1，2)键。EC0059T1中的截短的GtfJ18T1(SEQ ID NO：6)示出与EC0059中的全长GtfJ18相比更高的α-(1，2)支化活性。虽然不受理论的束缚，但全长GtfJ18中的CD1域可非常有活性并且与CD2支化域竞争所需的蔗糖。
实施例2
α-(1，2)支化活性的优化
以下实施例描述了EC0059T1(SEQ ID NO：6)的α-(1，2)支化活性关于温度和蔗糖浓度的优化。
利用由SG1018(包含GTF5604；SEQ ID NO：7)制备的葡聚糖主链的上述支化酶反应在30℃和37℃下利用40g/L蔗糖建立。由HPLC分析支化产物的糖浓度并由NMR分析键。表1示出在30℃下几乎所有蔗糖均消耗并且在由SG1018产生的主链上实现27％的α-(1，2)支化，然而在37℃下约一半蔗糖未消耗并且在SG1018主链上实现18％的α-(1，2)支化。蔗糖对照是具有除了支化酶之外的所有反应组分的阴性对照。数据指示支化酶GTFJ18T1(SEQ IDNO：6)在30℃比在37℃下更具有活性。
另一个实验利用在30℃下在支化反应中，范围为2.5g/L至40g/L的各种蔗糖浓度建立。表2示出较高百分比的α-(1，2)支化由支化反应中较高的蔗糖浓度来实现。在40g/L蔗糖的情况下，实现21.4％的α-(1，2)支化，尽管在反应结束时仍然留有14.7g/L蔗糖。由EC0059T1(SEQ ID NO：6)制备新批次的更具活性的支化酶，并且利用40g/L和80g/L蔗糖重复支化反应。表3示出当40g/L蔗糖全部消耗时，利用SG1018衍生的(即，使用SEQ ID NO：7产生的葡聚糖背景)葡聚糖主链实现24.5％的α-(1，2)支化。当使用80g/L蔗糖时，实现高达40％的α-(1，2)支化。
实施例3
将α-(1，2)支链加入由蔗糖产生的不同葡聚糖主链中
以下实施例描述了EC0059T1(SEQ ID NO：6)对由蔗糖产生的不同葡聚糖主链的α-(1，2)支化活性的评价。葡聚糖主链由葡糖基转移酶产生并且葡糖基转移酶/突变酶的组合具有宽范围的不同键和分子量。α-(1，2)支化酶对主要具有α-(1，6)键的不同分子量的葡聚糖以及包含α-(1，6)和α-(1，3)键的混合物的葡聚糖是活性的。α-(1，2)支化酶对于主要具有α-(1，3)键的葡聚糖不具有活性。
使用衍生自如表4中所列的 gi编号的葡糖基转移酶产生六种葡聚糖主链。葡糖基转移酶的序列如下提供：SG1006(“GTF1729”；SEQ ID NO：9)、SG1018(“GTF1428”；本文中也称为“GTF5604”；SEQ ID NO：7)；SG1031(“GTF6831”；SEQ ID NO：10)；SG1051(“GTF8845”；SEQ ID NO：11)；SG1066(“GTF0088”；SEQ ID NO：12)；和SG1115-GTF8117(SEQ ID NO：13)。葡糖基转移酶在枯草芽孢杆菌BG6006中表达并且葡聚糖主链合成反应如实施例1对于SG1018所述建立。除了具有N末端截短形式的GTF0088之外，所有GTF均表达为全长成熟蛋白质。GTF1729(SEQ ID NO：9)(SG1006)和GTF1428(SEQ ID NO：7)(SG1018)由其天然信号序列表达。其它四个GTF由枯草芽孢杆菌衍生的AprE信号序列(SEQID NO：34)表达。反应在37℃下由200g/L蔗糖起始并且监测1-3天直至蔗糖完全消耗。主链反应的HPLC分析示于表4中。主链反应产物也通过NMR分析键并且通过尺寸排阻色谱法来分析分子量。如表4中所示，产生的主链范围为约1kD至40kD。一些主链主要包含α-(1，6)键和α-(1，6)和α-(1，3)键的一些特定混合物。
使用包含至少一种葡糖基转移酶和至少一种突变酶的组合(同时GTF/突变酶)的反应混合物产生两种葡聚糖主链。由这些葡糖基转移酶反应产生的葡聚糖包含显著量的α-(1，3)键并且通常是不溶的。具有内切水解活性的突变酶用于将含α-(1，3)葡聚糖的分子量减小至DP＜10以有助于使它们溶于水。将包含α-(1，3)键的可溶性DP＜10寡糖纯化并用作用于α-(1，2)支化反应的主链。
用于GTF/突变酶反应的两种葡糖基转移酶在大肠杆菌中表达。使用经优化以在大肠杆菌中表达的密码子((DNA 2.0Inc.，Menlo Park，CA)合成在 gi：290580544中识别的葡糖基转移酶的截短型式(来自变异链球菌NN2025的GtfB；以SEQ IDNO：14提供的全长序列)以及 gi：47527的成熟形式(具有信号肽的全长序列，以SEQ ID NO：17提供)(来自唾液链球菌25975的GtfJ)；移除信号序列并添加起始密码子)。将编码衍生自 gi：290580544(“GTF0544”；SEQ ID NO：16)的截短蛋白质的多肽(SEQ ID NO：15)和编码衍生自 gi：47527(“GTF7527”；SEQ ID NO：19)的蛋白质的多肽(SEQ ID NO：18)亚克隆到质粒中以产生分别识别为pMP67和pMP52的质粒。质粒pMP67用于转化大肠杆菌TOP10(Thermo FisherScientific Inc.，Waltham，MA)。在37℃下，在振摇情况下，使表达GTF酶“GTF0544”的大肠杆菌菌株TOP10/pMP67在具有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中生长至OD600mm＝0.4-0.5，此时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.5mM，并且在37℃下继续温育2-4小时。通过在5,000xg下离心15分钟收获细胞并且重新悬浮于(20％重量/体积)pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液中。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)以确保＞95％的细胞裂解。在12,000xg和4℃下将裂解的细胞离心30min。将所得的上清液储存在-80℃。将pMP52质粒转移到大肠杆菌MG1655中并且使所得的MG1655/pMP52在发酵罐中生长以如下产生GtfJ：
由发酵制备重组的GTF
在发酵罐中产生重组成熟葡糖基转移酶Gtf-J起始于制备表达成熟Gtf-J酶(GI：47527；“GTF7527”；SEQ ID NO：19)的大肠杆菌菌株MG1655/pMP52的前种子培养物)。将种子培养基的10mL等分试样加入125mL一次性带挡板烧瓶中并用1.0mL在20％甘油中的大肠杆菌MG1655/pMP52培养物接种。使该培养物在37℃、300rpm振荡条件下生长3小时。
发酵罐中起始的种子培养物通过将0.5L种子培养基加到2-L振荡烧瓶中进行制备。将1.0mL的前种子培养物无菌转移到烧瓶中的0.5L种子培养基中，并在37℃和300rpm下培养5小时。在37℃下，以光密度＞2(OD550)将种子培养物转移到包含8L的上述发酵罐培养基的14-L发酵罐(Braun，Perth Amboy，NJ)中。
使大肠杆菌MG1655/pMP52细胞在发酵罐中生长并当培养基中的葡萄糖浓度降至0.5g/L时开始补充葡萄糖(包含1％w/w MgSO4·7H2O的50％w/w葡萄糖溶液)。以0.36克进料每分钟(g进料/min)开始进料并且每小时分别渐进式增大至0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、1.63、1.92、2.2g进料/min。之后速率保持恒定。使用YSI葡萄糖分析仪(YSI，Yellow Springs，Ohio)监测培养基中的葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度超过0.1g/L时，进料速率下降或暂时中止进料。当细胞达到OD550为70时，通过加入9mL 0.5M IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)开始诱导葡糖基转移酶活性。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速率(400至1200rpm)并且随后通过通风速率(2至10标准升/分钟，slpm)控制DO。将pH控制在6.8。NH4OH(14.5％重量/体积，w/v)和H2SO4(20％w/v)用于pH控制。将回压保持在0.5巴。在不同的间隔(20、25和30小时)下，将5mL的Suppressor 7153消泡剂(Cognis Corporation，Cincinnati，OH)加入到发酵罐中以抑制发泡。在加入IPTG后通过离心8小时收获细胞并将其储存在-80℃作为细胞浆。
突变酶
编码在 gi：257153264中识别的腐殖质类芽孢杆菌的突变酶由基因由GenScript(Piscataway，NJ)合成。将编码蛋白质序列(SEQ ID NO：21)的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)亚克隆到pET24a中(Novagen；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。将所得的质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以产生识别为“SGZY6”的菌株。在以220rpm振摇的情况下，使菌株在37℃下生长至OD600为～0.7，然后使温度降低至18℃并添加IPTG至0.4mM的最终浓度。在通过在4000g下离心收获之前，使培养物生长过夜。将来自600mL培养物的细胞团块悬浮在22mL 50mM KPi缓冲液(pH7.0)中。通过French细胞压碎器(2通道@15,000psi(～103.4MPa))破碎细胞；通过离心(SorvallTMSS34转子，@13,000rpm)40分钟移除细胞碎片。通过SDS-PAGE分析上清液以确认突变酶的表达并且将粗提取物用于活性测定。将粗提取物储存在-80℃下。
编码马尔内菲青霉18224突变酶(在中鉴定为gi：212533325)的基因由GenScript(Piscataway，NJ)合成。将编码蛋白质序列(SEQ ID NO：23)的多核苷酸序列(SEQ ID NO：22)在SacII和AscI限制性位点处亚克隆进质粒pTrex3(SEQID NO：24)中，被设计成在CBHI启动子和终止子的控制下，用黑曲霉乙酰胺酶进行选择，在里氏木霉属中表达感兴趣的基因的载体。通过基因枪注入将所得的质粒转化到里氏木霉中。基因枪转化的具体方法描述于国际PCT专利申请公布WO2009/126773 A1中。使用具有来自稳定克隆的孢子的1cm2琼脂棒TRM05-3来接种制备培养基(以下所述)。在28℃和220rpm下，使培养物在摇瓶中生长4-5天。为了收获得到分泌的蛋白质，首先通过在4000xg下离心10分钟去除细胞群，并使上清液过滤通过0.2μM无菌过滤器。突变酶“MUT3325”(SEQ ID NO：23)的表达由SDS-PAGE确定。
以下列出了制备培养基组分。
定义的NREL-Trich乳糖
里氏木霉痕量元素
通过发酵制备MUT3325
通过在2-L带挡板的烧瓶中用1.0mL的MUT3325表达菌株TRM05-3的冷冻孢子悬浮液接种0.5L的基本培养基来制备发酵种子培养物(基本培养基由5g/L硫酸铵、4.5g/L磷酸二氢钾、1.0g/L七水硫酸镁、14.4g/L无水柠檬酸、1g/L二水氯化钙、25g/L葡萄糖，以及痕量元素包括0.4375g/L柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.008g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰和0.002g/L硼酸组成。pH为5.5)。在转移到14-L发酵罐中的8L制备培养基之前，使培养物在32℃和170rpm下生长48小时。制备培养基由75g/L葡萄糖、4.5g/L磷酸二氢钾、0.6g/L二水合氯化钙、1.0g/L七水硫酸镁、7.0g/L硫酸铵、0.5g/L无水柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.00175g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰、0.002g/L硼酸和0.3mL/L foam blast 882组成。
对于在34℃和500rpm下于葡萄糖上生长24h的批次，首先运行发酵。在24h结束时，使温度降低至28℃并使搅拌速度增大至1000rpm。然后在0.030g葡萄糖-槐糖固体/g生物质/小时的特定进料速率下，用葡萄糖和槐糖的混合物(62％w/w)进料发酵罐。在运行结束时，通过离心去除生物质，并且使用10-kD分子量截留超滤芯(UFP-10-E-35；GEHealthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)通过过滤将含有突变酶的上清液浓缩约10倍。使浓缩蛋白质于-80℃储存。
使用包含葡糖基转移酶和突变酶组合的反应混合物产生的葡聚糖主链
包含蔗糖(100g/L)、GTF0544(SEQ ID NO：16)(10％v/v)和MUT3264(SEQ ID NO：21)(10％v/v)的200mL总体积的去离子水溶液的GTF0544/MUT3264反应在125rpm振摇的情况下在37℃下进行。包含蔗糖(210g/L)、发酵罐中产生的浓缩GTF7527(0.3％v/v)以及振摇瓶中产生的MUT3325(SEQ ID NO：23)(20％v/v)的100mL总体积的去离子水溶液的GTF7527/MUT3325反应在125rpm振摇的情况下在37℃下进行。反应通过在24h之后，在95℃下加热5min来淬灭。通过在13,000xg下离心10分钟并且过滤通过0.2μm RC膜过滤器来去除不溶性材料。由HPLC分析可溶性产物混合物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和寡糖的浓度(表5)。纯化可溶性产品并且通过1HNMR分析纯化的样本以测定寡糖的键。
α-(1，2)支化反应利用来自葡糖基转移酶反应的六个粗主链和来自葡糖基转移酶/突变酶反应的两个纯化主链来构建。支化反应利用酶的加热灭活之后的70％葡聚糖主链来构建。以10％(v/v)的EC0059T1粗细胞提取物形式提供的支化酶与80g/L蔗糖一起添加。就由以下4种菌株(SG1006、SG1018、SG1031和SG1115)产生的，全部具有α-(1，6)键的四种葡聚糖主链而言，蔗糖几乎全部消耗并且实现约40％的α-(1，2)支化。就包含大量α-(1，3)或α-(1，3，6)键的三种主链(来自GTF反应的SG1051和SG1066，来自GTF/突变酶反应的GTF0544/MUT3264)而言，蔗糖被部分消耗并且实现约20-30％的α-(1，2)支化。就主要为α-(1，3)键的来自GTF7527/MUT3325(GTF/突变酶反应)的主链而言，不消耗蔗糖并且不实现α-(1，2)支化。表6总结了支化反应产物的HPLC和NMR分析。这些数据展示α-(1，2)支化酶对主要包含α-(1，6)键以及α-(1，6)和α-(1，3)键的混合物的不同分子量的葡聚糖是活性的。α-(1，2)支化酶对于主要包含α-(1，3)键的葡聚糖不具有活性。
实施例4
来自氧化葡糖杆菌的糊精右旋糖酐酶在大肠杆菌中的表达
以下实施例描述了来自氧化葡糖杆菌NCIMB4943的糊精右旋糖酐酶(DD酶)在大肠杆菌BL21 DE3中的表达。天然大肠杆菌中的编码淀粉麦芽糖酶的malQ基因主要有助于麦芽糊精转化的背景活性。糊精右旋糖酐酶随后在大肠杆菌BL21 DE3 ΔmalQ宿主中表达)。
糊精右旋糖酐酶(DD酶)(SEQ ID NO：26)使用α-(1，4)连接的麦芽糊精作为底物以通过从非还原端顺序转移葡萄糖单元来制备α-(1，6)连接的右旋糖酐。来自来自氧化葡糖杆菌NCIMB4943的DD酶编码序列(SEQ ID NO：25)通过PCR扩增并克隆到pET23D载体的NheI和HindIII位点。由质粒pDCQ863上的T7启动子表达的确认DD酶基因的序列转化到大肠杆菌BL21DE3宿主中。所得的菌株连同BL21DE3宿主一起在37℃并以220rpm振荡下生长至OD600为～0.5，并且将IPTG添加至最终浓度0.5mM用于诱导。在通过在4000xg下离心收获之前，使培养物生长附加的2-3小时。将来自1L培养物的细胞团块悬浮在30mL 20mM KPi缓冲液(pH6.8)中。细胞通过French细胞压碎器(2通道@15,000psi)破碎；通过离心(Sorvall SS34转子，13,000rpm)40分钟除去细胞碎片。将上清液(10％)与16g/L最终浓度的麦芽四糖(DP4)底物(Sigma)的25mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)在37℃下温育过夜。在HPLC上分析寡糖特征。麦芽四糖(DP4)底物在没有表达质粒的BL21DE3宿主中转化，表明宿主中利用DP4的背景活性。
为了检查哪种酶主要对背景活性有贡献，在如上所述麦芽四糖测定中，测试具有单个基因缺失的来自“Keio collection”的一组菌株(Baba等人，(2006)Mol.Syst.Biol.，article number 2006.0008；第1-11页)(表7)。大肠杆菌K-12菌株BW25113是Keiocollection的亲代菌株。JW3543包含编码周质-淀粉酶的malS(SEQ ID NO：28)的缺失。JW1912包含编码细胞质-淀粉酶的amyA(SEQ ID NO：31)的缺失。JW3379包含编码淀粉淀粉麦芽糖酶的malQ(SEQ ID NO：27)的缺失。JW5689包含编码麦芽糊精磷酸化酶的malP(SEQID NO：29)的缺失。JW0393包含编码麦芽糊精葡糖苷酶的malZ(SEQ ID NO：30)的缺失。麦芽四糖对照(G4对照)不包含任何细胞提取物，当添加BW25113细胞提取物时，大多数麦芽四糖转化，这指示在BW25113中的背景活性。对于测试的五种Keio缺失菌株而言，其中四个仍然示出作为BW25113亲代菌株的背景活性。只有具有malQ缺失的JW3379示出大部分背景活性被消除，并且麦芽四糖作为G4对照保留。该实验表明malQ主要负责背景活性。通过标准P1转导将JW3379中的malQ：kanR缺失转移到BL21 DE3菌株以制备BL21 DE3ΔmalQ表达宿主。
将表达DD酶的pDCQ863和pET23D载体对照转化到BL21 DE3ΔmalQ表达宿主中，产生EC0063表达宿主。制备细胞提取物并且如上所述利用麦芽四糖底物测定。表8中的结果示出pET23D在BL21 DE3中具有用于麦芽四糖转换的背景活性，但在BL21 DE3 ΔmalQ宿主中不具有背景活性。当编码DD酶的pDCQ863在BL21 DE3ΔmalQ宿主中表达时，由于DD酶的活性，麦芽四糖被转化。表达DD酶的EC0063用作用于葡聚糖生产的DD酶的源。
实施例5
将α-(1，2)支链加入由麦芽糊精产生的不同葡聚糖主链中
以下实施例描述了EC0059T1(SEQ ID NO：6)对由麦芽糊精(MD)产生的葡聚糖主链的α-(1，2)支化活性的评价。所得结果展示，α-(1，2)支化酶也对具有使用DD酶反应由麦芽糊精底物产生的α-(1，6)和α-(1，4)键的混合物的葡聚糖具有活性。支化反应可在葡聚糖主链反应之后顺序进行或与葡聚糖主链反应同时进行。
表达活性DD酶(SEQ ID ON：26)的EC0063菌株用于将麦芽糊精转换成不可消化的葡聚糖纤维。将具有DE13-17和DE 4-7的两种类型的麦芽糊精用作底物。在37℃下，在pH4.8的25mM乙酸钠缓冲液中，将10％(v/v)的EC0063提取物与100g/L MD底物温育。产物的键特征通过NMR分析。产物的消化度通过Megazyme消化度分析来分析。两种类型的底物表现相似，在底物中存在约95％的α-(1，4)键和5％的α-(1，6)键。麦芽糊精底物的未消化度为约5-10％(即，约90-95％的消化度)。在麦芽糊精底物与DD酶反应之后，DD酶的反应产物具有约65-75％的α-(1，6)键，其中剩余为α-(1，4)键。产物的未消化度也增加至约65-75％。
就DD酶产物的支化而言，支化酶提取物可顺序或同时加入DD酶反应中。在顺序反应中，包含DD酶的10％EC0063提取物首先与如上所述的100g/L麦芽糊精底物反应。然后反应在95℃下热灭活5min。通过加入40g/L蔗糖和10％的包含GtfJ18T1支化酶的EC0059T1提取物，百分之八十的DD酶反应产物用于构建支化反应。该支化反应在30℃下温育24-48小时，并且然后热灭活，用于通过HPLC、NMR和Megazyme消化度进行分析。在同时反应中，80g/L麦芽糊精底物(DEl3-17)与同时在pH4.8的25mM乙酸钠缓冲液中的10％含DD酶的EC0063提取物和10％含GtfJ18T1的EC0059T1提取物以及40g/L蔗糖反应。将反应在30℃下温育24-48小时并且以与顺序反应产物相同的方式分析反应产物。表9中的数据示出顺序反应和同时反应产生相似的产物。两种反应产生具有约15％的α-(1，2)键的葡聚糖。产物的未消化度也随引入支化而增加。
表9：使用麦芽糊精DE13-17作为底物的DD酶和支化酶GtfJ18T1的顺序反应和同时 反应的产物的分析
反应 酶1 酶2 ％不可消化 1，4 1，2，6 1，3 1，6
仅主链 DD酶 无 75.3％ 24.8 0.0 0.0 75.2
顺序 DD酶 GtfJ18T1 81.3％ 22.6 15.8 0.0 61.6
同时 DD酶 GtfJ18T1 83.1％ 24.8 13.5 0.0 61.6
MD对照 无 无 11.1％ 95.2 0.0 0.0 4.8
实施例6
由α-(1，2)支化反应产生的可溶性纤维的纯化和分离
α-(1，2)支化反应利用来自葡糖基转移酶反应的六个粗主链和如实施例3所述的来自葡糖基转移酶/突变酶反应的一个纯化主链来构建。400-mL反应由200g/L蔗糖和5％(v/v)酶溶液(经0.22微米无菌过滤的)的10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)溶液以及0.1mM氯化钙在振摇情况下在37℃下开始。反应由HPLC监测1-3天，直至蔗糖全部消耗。在完成蔗糖转化时，酶通过将反应混合物加热至95℃并持续30分钟，然后冷却至室温来灭活。将所得的混合物离心以移除任何沉淀，并且将包含葡聚糖主链的上清液用于支化反应中。
建立600-mL支化反应，其由如上所述制备的420mL(70％v/v)的含葡聚糖主链的上清液开始。以5％(v/v)的EC0059T1粗细胞提取物(30mL，(经0.22微米无菌过滤的)形式提供的支化酶与120mL的40重量％蔗糖水溶液(80g/L蔗糖的最终浓度)和30mL的去离子水一起添加。反应在30℃和介于pH 5.0-6.0之间，在180-200rpm振摇情况下运行，并且蔗糖转化通过HPLC监测。在完成蔗糖转化时，酶通过将反应混合物加热至95℃并持续30分钟，然后冷却至室温来灭活。将反应混合物离心以移除任何沉淀，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液。将包含寡糖≥DP3的SEC级分混合并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC分析(表10)。
实施例7
由α-(1，2)支化反应产生的可溶性纤维的异头键分析
将如实施例6中所述通过SEC纯化的可溶性纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性寡糖纤维混合物中每一个的异头键记录在表11和12中。
表11：通过 1 H NMR谱对可溶性寡糖的异头键分析。
实施例8
由α-(1，2)支化反应产生的可溶性纤维的粘度
将如实施例6中所述由SEC纯化的可溶性纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-s(mPa-s))(表13)。
表13：在20℃下测量的12％(w/w)可溶性寡糖纤维溶液的粘度。
实施例9
由α-(1，2)支化反应产生的可溶性纤维的消化度
将如实施例6中所述由色谱纯化的可溶性纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。消化度测试方案改编自Megazyme总和综膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应的总体积为1mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样本。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量释放的葡萄糖量。将麦芽糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照(表14)。
表14：可溶性寡糖纤维的消化度。
实施例10
由α-(1，2)支化反应产生的可溶性纤维的分子量
如一般方法部分中所述，将如实施例6中所述制由SEC纯化的可溶性纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过SEC色谱分析所得固体的数均分子量a(Mn)、重均分子量(Mw)、峰值分子量(Mp)、z均分子量(Mz)、和多分散性指数(PDI＝Mw/Mn)(表15)。
表15：通过SEC表征可溶性寡糖纤维。
实施例11
使用可溶性寡糖/多糖纤维作为碳源的体外气体产生
将经色谱纯化的可溶性寡糖/多糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。随后，使用如一般方法中所述的方法，评估作为碳源的单独的可溶性寡糖/多糖可溶性纤维样本的体内气体产生。包括如下物质作为对照碳源：85(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、 FM06(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、600F(耐消化麦芽糊精，Archer Daniels Midland Company&Matsutani Chemical)、 GR(菊粉，得自Beneo，Mannheim，Germany)、 UltraTM(聚右旋糖，Danisco)、GOS(半乳糖寡糖，Clasado Inc.，Reading，UK)、 P95(低聚果糖(果寡糖，FOS，Beneo)，LACTITOL MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和葡萄糖。表16列出了在3h和24h下由肠道微生物群产生的体外气体产量。
表16：由肠道微生物群产生的体外气体。
实施例12
结肠发酵模拟和脂肪酸的测量
使用半连续结肠模拟器模拟结肠发酵，如由等人所述(Nutri.Cancer(2005)52(1)：94-104)；简单来说，结肠模拟器由包含模拟回肠液的四个玻璃容器组成，如Macfarlane等人所述的(Microb.Ecol.(1998)35(2)：180-187)。模拟器用新鲜的人粪便微生物群接种，并且每三个小时用新的回肠液喂养，内容物中部分从一个容器转移到下一个容器。回肠液包含浓度为1％的所述测试组分中的一种。所述模拟持续48h，此后收获四个容器的内容物用于进一步分析。进一步分析涉及微生物代谢物诸如短链脂肪酸(SCFA)(也称为挥发性脂肪酸(VFA))和支链脂肪酸(BCFA)的测定。分析如Holben等人(Microb.Ecol.(2002)44：175-185)所述进行；简单来说，将模拟器内容物离心并且将上清液用于SCFA和BCFA分析。将新戊酸(内标)和水与上清液混合并离心。离心后，向上清液中加入草酸溶液，并且然后将混合物在4℃下温育，并且然后再次离心。通过使用火焰离子化检测器和氦气作为载气的气相色谱来分析所得的上清液。还提供由 ULTRATM(聚葡聚糖，Danisco)、 P95(低聚果糖；果寡糖，“FOS”，Beneo)、乳糖醇(LactitolMC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和阴性对照的样本产生的比较数据。测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度(表17)。
表17：模拟代谢和脂肪酸产生的测量。
实施例13
制备酸奶-可饮用沙冰
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备酸奶-可饮用沙冰。
表18：
实施例14
纤维水制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维制备纤维水。
表19：
成分 重量％
水，去离子的 86.41
淡黄绿色#06509 0.00
本发明可溶性纤维样本 8.00
蔗糖 5.28
柠檬酸 0.08
风味剂(M748699M) 0.20
维生素C，抗坏血酸 0.02
总计 100.00
实施例15
可勺性酸奶制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备可勺性酸奶。
表20：
成分 重量％
脱脂乳 84.00
糖 5.00
酸奶(6051) 3.00
培养物(添加至pH断点)
本发明可溶性纤维 8.00
总计 100.00
实施例16
模拟小吃棒制剂的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备模拟小吃棒。
表21：
实施例17
高纤维片的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备高纤维片。
表22：
1-Danisco.
实施例18
软巧克力碎片曲奇的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备软巧克力碎片曲奇。
表23：
成分 重量％
塔板1
乳糖醇，C 16.00
糕点用人造奶油 17.70
盐 0.30
烘焙粉末 0.80
鸡蛋，整体干燥 0.80
苏打的碳酸氢盐 0.20
香草风味剂 0.26
焦糖风味剂 0.03
蔗糖素粉末 0.01
塔板2
本发明纤维溶液(70 Brix) 9.50
水 4.30
塔板3
面粉，酥皮点心用 21.30
面粉，高比率蛋糕用 13.70
塔板四
巧克力碎片，100％乳糖醇，无糖 15.10
实施例19
减脂油酥松饼的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备减脂油酥松饼。
表24：
成分 重量％
面粉，清蛋白液 56.6
水 15.1
人造奶油 11.0
酥油 11.0
本发明纤维 6.0
盐 0.3
实施例20
低糖谷物簇的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维中的一种制备低糖谷物簇。
表25：
成分 重量％
糖浆粘合剂 30.0
乳糖醇，MC 50％
本发明纤维溶液(70 Brix)25％
水25％
谷物混合物 60.0
燕麦片70％
片状燕麦10％
酥脆米10％
燕麦片10％
植物油 10.0
实施例21
果冻的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备果冻。
表26：
成分 重量％
组分A
木糖醇 4.4
果胶 1.3
组分B
水 13.75
柠檬酸钠 0.3
柠檬酸，无水的 0.3
组分C
本发明纤维溶液(70Brix) 58.1
木糖醇 21.5
组分D
柠檬酸 0.35
风味剂、颜料 适量
实施例22
橡皮糖的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备橡皮糖。
表27：
成分 重量％
本发明葡聚糖纤维 35
木糖醇 35
水 10
植物脂肪 4.0
甘油单硬脂酸酯(GMS) 0.5
卵磷脂 0.5
明胶180块(40％溶液) 4.0
木糖醇，CM50 10.0
风味剂、颜料和酸 适量
实施例23
咖啡-樱桃冰淇淋的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备咖啡-樱桃冰淇淋。
表28：
1-Danisco.

Claims (13)

1.一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.下列的范围：
i.0％至50％的α-(1，3)糖苷键；或
ii.0％至40％的α-(1，4)糖苷键；或
iii.i)和ii)的任意组合；
b.1至50％的α-(1，2)糖苷键和α-(1，2，6)糖苷键的组合；
c.0-25％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.少于99％的α-(1，6)糖苷键；
e.小于300kDa的重均分子量；
f.在20℃下，在水中12重量％下小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
g.如分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量的小于20％的消化度；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
i.小于26的多分散性指数。
2.根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其中所述α-(1，3)糖苷键和所述α-(1，3，6)糖苷键的总和在3至50％的范围内。
3.一种碳水化合物组合物，包含：0.01至99重量％(基于干固体)的权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
4.根据权利要求3所述的碳水化合物组合物，还包含：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、安赛蜜钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、蔗糖素、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、麦芽糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糊精、支链麦芽糊精、菊粉、聚右旋糖、果寡糖、半乳糖寡糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽寡糖、填料、赋形剂、粘合剂或它们的任意组合。
5.一种食物产品、个人护理产品或药学产品，包含权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或权利要求3所述的碳水化合物组合物。
6.一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，包括：
a.提供一系列的反应组分，其包括：
i.蔗糖；
ii.具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；
iii.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化所述α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；和
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列混合，从而所述多肽催化所述包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
c.任选地，分离所述α-葡聚糖纤维组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列混合的步骤包括将食物产品中的反应组分的系列混合。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.在20℃下，在水中12重量％下小于0.01帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
b.如分析化学师协会(AOAC)方法2009.01所测量的小于20％的消化度；
c.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
d.小于26的多分散性指数。
9.一种制备α-葡聚糖纤维组合物的方法，包括：
a.在适当的反应条件下使蔗糖与至少一种葡糖基转移酶或至少一种葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的组合接触，从而产生具有至少0.5kDa的重均分子量的α-葡聚糖底物，所述α-葡聚糖底物包含至少50％的α-(1，6)糖苷键；其中所述α-葡聚糖底物包含少于1％的α-(1，2)糖苷键；
b.使(a)中产生的α-葡聚糖底物与包含以下物质的反应组分的系列接触：
i.包含与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽能够催化所述α-葡聚糖底物上的α-(1，2)糖苷键的合成；
ii.蔗糖；和
iii.任选地一种或多种受体；
c.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列混合，从而所述多肽催化所述包含1至50％的α-(1，2)糖苷键的α-葡聚糖纤维组合物的合成；以及
d.任选地，分离步骤(c)的α-葡聚糖纤维组合物。
10.一种减小食物或饮料的血糖指数的方法，包括向所述食物或饮料中掺入权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
11.一种抑制血糖水平升高、降低脂质、治疗便秘、或改变哺乳动物中脂肪酸产生的方法，包括向所述哺乳动物施用权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的步骤。
12.一种低龋性组合物，包含权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
13.权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适于包括人类在内的动物食用的食物组合物中的用途。
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