CN106478812A - 丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3及其功能、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3(Serpin‑3)的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。所述的Serpin‑3全序列的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的Serpin‑3成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了所述重组Serpin‑3的类似物或活性片段。本发明的天然、重组Serpin‑3及其类似物、部分片段在体内外对丝氨酸蛋白酶、对抗菌肽合成以及对激活酚氧化酶原激活系统具有抑制作用。且本发明所述的天然、重组Serpin‑3及其部分片段或类似物获得方法常规、简单、产量高。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。具体地说，本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、抑制昆虫血淋巴黑色素产生、抑制昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)超家族是蛋白酶抑制因子中最大的超家族，种类繁多，分布广泛，具有共同起源且氨基酸序列和空间结构相对保守，但功能却高度分化。绝大多数Serpin主要在生物体内通过抑制蛋白酶活性而起到负向调控作用，然而某些Serpin的功能并不局限于抑制蛋白酶，有些还可作为一种其他功能蛋白的辅蛋白，有些具有抑菌作用。
具有抑制活性的Serpin由蛋白质主体和活性中心环两部分组成，分子量约为40～50KDa。Serpin的主体结构域极为保守，通常具有3个β-折叠(命名为A，B，C)和8-9个α螺旋。其中最具有代表性的是A-sheet和活性中心部分。在A-sheet中包含两个β片层，包含了“Breach”和“Shutter”两个部分。Serpin的活性中心环(Reactive Centre Loop,RCL)主要由位于C末端的约20个氨基酸残基组成，暴露在Serpin的蛋白主体之外，带有能够被靶酶特异识别的位点，称之为P1，从P1的羧基端开始的氨基酸称为P1′。
Serpin的作用机制不同于常规酶与底物间的相互作用(锁钥机制)。它通过破坏靶酶的结构而使靶酶完全丧失活性。当Pl和P1靶在酶的作用下断裂时，Serpin首先与靶酶形成共价酯键，即形成酰基酶中间体。经过构型的改变酰基键水解，形成能量低的稳定产物。也有解释称：RCL牵引靶酶转向Serpin的另一侧从而引起靶酶构象改变，因此Serpin型抑制剂也被称为自杀性抑制剂。这一构象变化过程要比蛋白酶水解快几个数量级，所形成的复合物根据其形成的Serpin成员及环境的不同可保持稳定达数周甚至数年，但最终还可分解为有活性的蛋白酶和已断裂的Serpin。同时，有些Serpin的抑制活性还受辅助因子的调控。
Serpin是昆虫重要的负向调控因子。据文献报道，果蝇基因组中共含有29个Serpin基因片段，其中已有13个基因得到分离并确认相关功能。例如serpin-27A对于Toll通路具有重要负调控。2003年Hashimoto等人发现，当果蝇受到真菌侵染时，细胞外的Serpin 43Ac会调节Toll途径对其做出反应。2004年Riche等人发现果蝇Serpin 4A是一种细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂，在细胞分泌途径中起着调节的作用。美国白蛾血浆中发现一种可抑制酚氧化酶原激活系统的Serpin。而烟草天蛾的Serpin-1基因经可变剪切可产生12种蛋白形式，其中，serpin-7、serpin-6、serpin-3和serpin-1J可抑制PAP-3的活性；Serpin-5可调节HP6、proHP8和proPAP1的活性；Serpin-4对于HP6具有抑制作用。在黄粉虫中，SPN-40、SPN-55和SPN-48可分别特异性抑制SP级联中的三种丝氨酸蛋白酶来调节Toll信号通路和酚氧化酶级联反应。
经序列分析及生物学功能研究表明，果蝇SPN-43Ac、黄粉虫SPN48以及烟草天蛾Serpin-3序列同源性较高(在此统一命名为Serpin-3)，且生物学功能相似，均参与调节先天性免疫信号通路中丝氨酸蛋白酶级联系统。因此，对于Serpin-3抑制底物及其抑制机制的研究，为深入了解先天性免疫信号调节机制具有重要的研究意义。
目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫Serpin-3的结构、制备、生物学功能以及功能应用的研究。
发明内容：
本发明所解决的技术问题是提供一系列Serpin-3及其制备方法。
所述的Serpin-3全序列的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的Serpin-3成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了所述重组Serpin-3的类似物或活性片段。
所述的Serpin-3类似物或活性片段为包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，如SEQ ID：3-16所示。
本发明进一步提供了所述天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物或活性片段，以天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物或活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用，包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对Serpin-3、重组Serpin-3、重组Serpin-3类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.通过其抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的酚氧化酶原激活系统以及抗菌肽的合成，从而抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统，提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力；5.其对丝氨酸蛋白酶强烈的抑制活性的特点，且不易产生耐药性，可以作为制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的药物应用。
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的Serpin-3，研究天然Serpin-3的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组Serpin-3及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组Serpin-3及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然Serpin-3。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析Serpin-3的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现Serpin-3基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组Serpin-3。同时，利用基因重组技术，获得Serpin-3的类似物或部分片段。天然、重组Serpin-3以及其类似物或部分片段，能够特异性抑制丝氨酸蛋白酶的活性，这种抑制作用一方面能够抑制昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统，另一方面抑制昆虫细胞免疫而降低抗菌肽的合成。本发明的天然、重组Serpin-3以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗；鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的抗病以及针对基于丝氨酸蛋白酶抑制作用的肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的治疗。
本发明的Serpin-3，其氨基酸序列如SEQ ID：1所示。
其制备方法如下：
一、天然Serpin-3的制备
本发明所获得天然Serpin-3是通过如下技术方案实现的，包括：
以昆虫血淋巴作为原料，通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的Serpin-3。
其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到的抽提液；
Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)溶液的酸碱度在pH2～pH10，优选pH4-pH9；(2)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸及它们的溶液。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂及它们的溶液；(3)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；(4)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L～0.8mol/L，优选0.01mol/L～0.3mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响Serpin-3的生物活性。
昆虫血淋巴的收集：将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在4℃至～25℃条件下收集昆虫血淋巴。
本发明的分离分析方法包含如下中的一种或两种以上的组合：
1.离子交换层析分离纯化Serpin-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度为0.00mol/L～3mol/L。利用抗Serpin-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有Serpin-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析填料，如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析填料，如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响Serpin-3的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化Serpin-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析柱，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗Serpin-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有Serpin-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择Serpin-3抗体、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使Serpin-3发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得Serpin-3。
3.疏水层析分离纯化Serpin-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗Serpin-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有Serpin-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料或羟基磷灰石-疏水层析填料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化Serpin-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗Serpin-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有Serpin-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
5.盐析分离纯化Serpin-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到Serpin-3仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到Serpin-3沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；(3)在使Serpin-3处于溶解状态时，选择中性盐在5％—30％，优选15％—30％；(4)在使Serpin-3处于沉淀状态时，选择中性盐在30％—90％，优选30％—55％。
6.超滤分离纯化Serpin-3以及处理Serpin-3溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至Serpin-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化Serpin-3。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使Serpin-3透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使Serpin-3得以分离纯化；透过超滤膜的Serpin-3溶液，再选择一定规格的超滤膜，使Serpin-3被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使Serpin-3得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使Serpin-3先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使Serpin-3透过超滤膜，从而使Serpin-3得以分离纯化。
超滤处理Serpin-3溶液的目的，是除去Serpin-3溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对Serpin-3溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使Serpin-3被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：(1)透过Serpin-3的超滤膜选择分子量为30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选30kDa～60kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)截留Serpin-3的超滤膜选择是分子量为3kDa或10kDa或20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超滤膜，优选10kDa～30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(3)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按Serpin-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述任何一种方法所获得的Serpin-3纯度，有时无法满足相应需要。
本发明为了从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度Serpin-3，并达到电泳纯乃至HPLC纯度。本发明将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合或顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合或顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合或顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合或顺序重排组合，通过纯化方法自由组合或顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的重组Serpin-3、重组Serpin-3类似物或活性片段是利用基因工程表达获得，其表达形式包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备重组Serpin-3、重组Serpin-3类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
二、Serpin-3结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对Serpin-3进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然Serpin-3的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得Serpin-3进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得Serpin-3分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNApool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得Serpin-3基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得Serpin-3全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增Serpin-3染色体基因，通过基因序列测定分析获得Serpin-3染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述所获得Serpin-3的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得Serpin-3全长一级结构序列(参见SEQ ID NO:1)、天然Serpin-3或称成熟Serpin-3一级结构序列(参见SEQ ID NO:2)。
三、重组Serpin-3及其片段或类似物的制备
本发明还包含具有Serpin-3序列的重组Serpin-3及其部分片段或类似物。
所述的重组Serpin-3及其类似物或部分片段选自Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列(参见SEQ ID：3-16)。
本发明的重组Serpin-3及其部分片段或类似物通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将Serpin-3及其部分片段或类似物编码DNA重组至表达载体；(2)用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述重组Serpin-3及其部分片段或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
四、Serpin-3及其部分片段或类似物的生物学功能及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组Serpin-3及其类似物、部分片段在体内外对丝氨酸蛋白酶的抑制作用、对抗菌肽合成的抑制作用以及对激活酚氧化酶原激活系统的抑制作用，确定了天然、重组Serpin-3及其部分片段或类似物的生物活性。同时，考察Serpin-3在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组Serpin-3及其部分片段或类似物的应用。
此外，本发明也研究了天然、重组Serpin-3及其部分片段或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明所述的天然、重组Serpin-3及其部分片段或类似物获得方法常规、简单、产量高。
附图说明：
图1为分离纯化天然Serpin-3电泳图谱
泳道1：实施例1中方法-1所获天然Serpin-3的电泳图谱；
泳道2：实施例1中方法-2所获天然Serpin-3的电泳图谱；
泳道3：实施例1中方法-3所获天然Serpin-3的电泳图谱；
泳道4：实施例1中方法-4所获天然Serpin-3的电泳图谱。
图2为分离纯化重组Serpin-3(原核表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例3中方法-(1)所获得重组Serpin-3的电泳图谱；
泳道2：实施例3中方法-(2)所获重组Serpin-3类似物的电泳图谱；
泳道3：实施例3中方法-(3)所获重组Serpin-3类似物的电泳图谱；
泳道4：实施例3中方法-(4)所获重组Serpin-3类似物的电泳图谱。
图3为分离纯化重组Serpin-3(真核表达体系)电泳图谱
A：分离纯化重组Serpin-3(昆虫表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例4中方法-1所获得重组Serpin-3的电泳图谱；
泳道2：实施例4中方法-2所获重组Serpin-3类似物的电泳图谱。
B：分离纯化重组Serpin-3(酵母表达体系、哺乳动物细胞表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例5中方法所获得重组Serpin-3类似物的电泳图谱；
泳道2：实施例6中方法所获重组Serpin-3类似物的电泳图谱。
图4为Serpin-3及其类似物、活性片段对丝氨酸蛋白酶的抑制作用
A：天然Serpin-3对丝氨酸蛋白酶的抑制作用；
B：天然Serpin-3与丝氨酸蛋白酶形成共价复合物；
C：原核表达体系获得的重组Serpin-3及其类似物、活性片段对丝氨酸蛋白酶的抑制作用；
D：真核表达体系获得的重组Serpin-3及其类似物、活性片段对丝氨酸蛋白酶的抑制作用。
图5为Serpin-3在昆虫体内对抗菌肽合成的抑制作用
A：Serpin-3在金黄色葡萄球菌诱导下对抗菌肽合成的抑制作用；
B：不同微生物诱导下Serpin-3对抗菌肽Ceropin A表达的抑制作用；
C：不同微生物诱导下Serpin-3对抗菌肽attacin表达的抑制作用。
图6为Serpin-3及其类似物、活性片段对酚氧化酶原系统的抑制作用
A：天然Serpin-3对柞蚕幼虫黑化的抑制作用；
B：天然Serpin-3体内对酚氧化酶原激活的抑制作用；
C：重组Serpin-3及其类似物、活性片段体外对酚氧化酶原激活的抑制作用(PAMPs激活)；
D：重组Serpin-3及其类似物、活性片段体外对酚氧化酶原激活的抑制作用(微生物激活)。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1
天然Serpin-3的分离纯化
1.方法-1
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞，以不含有血细胞的柞蚕血淋巴作为纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的样品。将200ml样品进行硫酸铵分级沉淀，取35～50％沉淀组分用柠檬酸-磷酸缓冲体系溶解稀释，以此作为上样初始液上样于肝素亲和层析柱以去除杂蛋白的影响，将流出液上样于SP-Sepharose阳离子交换柱，并进行洗涤洗脱，将含有目的片段的组分上样于Q-Sepharose阴离子交换柱进行洗涤洗脱，然后用ConA柱对目的组分进行进一步的洗涤洗脱，得到具有天然活性的Serpin-3纯品。
试验结果如图1泳道1，目的蛋白达到电泳纯。
2.方法-2
将冰浴处理的样品首先经过截留分子量为150KDa滤膜以除去大分子量的蛋白，透过样品再次经过截留分子量为80kDa滤膜获得进一步纯化及浓缩的样品。将截留的样品溶于Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲溶液中，并以此为上样初始液样于用相同缓冲溶液平衡的Mono S HR 5/5阳离子交换柱(FPLC系统中),流速为0.5ml/min。用0-100％0.5M NaCl(醋酸缓冲溶液，20mM,pH5.0)梯度洗脱条件下洗涤洗脱，将经进一步纯化的含有目的蛋白的组分经过截留分子量为15KDa的滤膜，截留的蛋白用醋酸钠(20mM，pH5.0)缓冲溶液平衡并以此为上样初始液上样于DEAE sepharose CL-6B阴离子离子交换柱(Pharmacia 17-0710-01)，并在流速为0.5ml/min，Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲溶液洗涤色谱柱至A280<0.01。用含有0.5M NaCl的Tris-HCl(20mM,pH 7.5)缓冲溶液逐级洗脱结合蛋白，最终获得纯化的天然serpin-3。
试验结果如图1泳道2，目的蛋白达到电泳纯。
3.方法-3
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞，以不含有血细胞的柞蚕血淋巴作为纯化serpin-3的样品。将200ml样品进行硫酸铵分级沉淀，取35～50％沉淀组分作为上样初始液作用于反相疏水C8层析柱，利用有机溶剂进行洗涤洗脱，将含有目的蛋白的组分进行透析除有机溶剂，并将透析后样品上样于凝胶过滤层析柱TSK gel G2000SW进行进一步的分离纯化，获得天然serpin-3。
试验结果如图1泳道3，目的蛋白达到电泳纯。
4.方法-4
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞，以不含有血细胞的柞蚕血淋巴作为纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的样品。将200ml样品进行硫酸铵分级沉淀，取35～50％沉淀组分用柠檬酸-磷酸缓冲体系溶解稀释，以此作为上样初始液上样于SP-Sepharose阳离子交换柱进行洗涤洗脱，将含有目的蛋白的组分上样于肝素层析柱进行洗涤洗脱，将流出液上样于羟基磷灰石层析柱进行进一步的除杂后，流出液上样于Q-Sepharose阴离子交换柱进行洗涤洗脱，将含有目的片段的组分上样于凝胶过滤层析柱Sepharose CL-6B column进行进一步的分离纯化，获得天然serpin-3。
试验结果如图1泳道4，目的蛋白达到电泳纯。
实施例2：
Serpin-3结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对Serpin-3进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。
获得Serpin-3完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)。
获得Serpin-3成熟肽氨基酸序列及其核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。
实施例3：
利用原核生物表达系统获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明Serpin-3及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.Serpin-3的表达载体构建
根据天然Serpin-3的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建Serpin-3基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1.以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在Serpin-3的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在Serpin-3的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag等；5.可以在亲和层析标签与Serpin-3之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然Serpin-3蛋白结构一致的重组Serpin-3蛋白。
2.重组Serpin-3蛋白及其类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将Serpin-3基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导Serpin-3基因的表达，从而获得含有Serpin-3的培养液或菌体。含有Serpin-3的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组Serpin-3的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.Serpin-3基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的Serpin-3需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含Serpin-3的原料液中分离纯化重组Serpin-3及其类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pTYB11构建无标签Serpin-3表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，Serpin-3表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化Serpin-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化Serpin-3至电泳纯(图2-泳道1)。
(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的Serpin-3基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-Serpin-3表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化Serpin-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化Serpin-3至电泳纯(图2-泳道2)。
(3)采用pGEX-2T构建C端后融合GST标签的Serpin-3表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，Serpin-3-GST表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化Serpin-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化Serpin-3至电泳纯(图2-泳道3)。
(4)采用pET20b构建C端后融合Flag标签的Serpin-3基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，Serpin-3-Flag表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化Serpin-3至电泳纯(图2-泳道4)。
上述表达重组的Serpin-3结构如ID：3所示，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图2所示。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得Serpin-3，该重组Serpin-3的结构与天然Serpin-3的结构相同。
实施例4：
利用昆虫细胞表达系统获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明Serpin-3及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
将Serpin-3及其类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-Serpin-3重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组Serpin-3在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗Serpin-3抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0.2mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3A-泳道1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
将Serpin-3及其类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-Serpin-3重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组Serpin-3在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)和0.5mol/L咪唑(pH 8.0)分别进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3A-泳道2。
实施例5：
利用酵母表达系统获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述酵母细胞表达系统表达本发明Serpin-3及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
酵母细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pPIC9K表达载体、毕赤酵母GS115为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将Serpin-3基因连接到pPIC9K表达载体中，构建pPIC9K-His6-Serpin-3(或pPIC9K-Serpin-3)重组表达质粒，转化大肠杆菌，挑取阳性重组菌中重组质粒，经酶切形成线性分子，利用电转化方法将其转入毕赤酵母GS115中与基因组同源重组，经过初筛、复筛及Mut表型鉴定，筛选出阳性重组子，进行发酵及诱导表达，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组Serpin-3为分泌型表达。
将重组菌GS115/pPIC9K-His6-Serpin-3(或GS115/pPIC9K-Serpin-3)接种于50mlBMGY液体培养基中，于30℃，250rpm/min，震荡培养过夜。3000g、4℃离心5min，收集菌体。用10ml BMMY培养基重悬菌体并开始甲醇诱导表达6h，重组蛋白以分泌表达形式存在于培养基中，12,000g、4℃离心4min，得上清液，并以此为纯化初始液。
如果表达产物是His6-Serpin-3或Serpin-3-His6，直接将纯化初始液上样于0.05MTris-HCl(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-Serpin-3或Serpin-3-His6。表达产物的结构如ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3B-泳道1。
如果表达产物是Serpin-3，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组Serpin-3。
实施例6：
利用哺乳动物细胞表达系统获得重组Serpin-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述哺乳动物表达系统表达本发明Serpin-3及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
哺乳动物细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pCDNA3.0(neo+)质粒、CHO-K1细胞为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将Serpin-3基因连接到pCDNA3.0(neo+)质粒中，构建pCDNA3.0(neo+)-His6-Serpin-3(或pCDNA3.0(neo+)-Serpin-3)重组表达质粒。将其转染哺乳动物细胞株CHO-K1，对转染成功细胞株于5％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h，收集细胞及培养液，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组Serpin-3得以表达。
用15ul重组质粒pCDNA3.0(neo+)-His6-Serpin-3(或pCDNA3.0(neo+)-Serpin-3)转染8ml IMDM medium(含有CHO-K1cell，2X105cell/ml)，于37℃，15％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h。用0.25％胰蛋白酶消化细胞2～3min，使细胞悬浮，收集细胞。用5ml裂解液(NP40)使细胞裂解，12,000g、4℃离心5min，得上清液作为纯化初始液。
如果表达产物是His6-Serpin-3或Serpin-3-His6，直接将纯化初始液上样于0.05MTris-HCl(pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分别充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-Serpin-3或Serpin-3-His6。表达产物的结构如ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3B-泳道2。
如果表达产物是Serpin-3，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组Serpin-3。
实施例7：
Serpin-3及其类似物、活性片段的抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4、5获得的各种天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物、活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中Serpin-3抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了Serpin-3抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有Serpin-3抗体的血清中分离纯化不同纯度的Serpin-3抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的Serpin-3抗体，以适于不同要求的应用。
实施例8：
重组以及天然Serpin-3及其类似物、活性片段的生物活性
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中天然Serpin-3、重组Serpin-3及其衍生物、类似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物、活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物、活性片段的应用范围。
1.Serpin-3及其类似物、活性片段对丝氨酸蛋白酶的抑制作用
将天然serpin-3与丝氨酸蛋白酶在25℃条件下孵育10min，随后加入靶酶相应底物，以测定的450nm处吸光度来衡量丝氨酸蛋白酶催化底物的活性，并以此间接考天然serpin-3对丝氨酸蛋白酶的抑制作用。结果如图4-A所示，单独的缓冲体系、BSA和天然serpin-3对底物无催化作用；丝氨酸蛋白酶可对其进行切割，引起吸光度上升；BSA对丝氨酸蛋白酶的催化活性无影响；但在加入天然serpin-3后，丝氨酸蛋白酶对底物的催化作用显著降低，说明天然serpin-3对丝氨酸蛋白酶的催化活性具有明显的抑制作用。
为进一步考察天然serpin-3是否通过与丝氨酸蛋白酶形成共价复合物的自杀性形式产生抑制作用，本实验将两者按1:16的浓度比混合后，分别于4℃孵育过夜、25℃孵育10min和37℃孵育10min的条件下。利用SDS-PAGE检测各反应条件下，孵育组分分子量的变化情况。如图4-B所示：在25℃孵育条件下，电泳泳道中检测到约68KD的新形成蛋白条带，经质谱鉴定，该条带新条带为两者形成的共价复合物。
将利用大肠杆菌表达体系获得的重组Serpin-3、重组His6-Serpin-3、重组Serpin-3-Flag、重组Serpin-3-GST以及利用昆虫表达体系、酵母表达体系、哺乳动物表达体系获得的重组Serpin-3、重组His6-Serpin-3，分别重复上述实验。实验结果如图4-C、D，上述体系中所获得的Serpin-3类似物及活性片段均与天然Serpin-3一样，可显著抑制丝氨酸蛋白酶的催化活性。
2.Serpin-3体内对抗菌肽合成的抑制作用
首先利用RNAi技术从基因水平封闭Serpin-3的表达。选取四龄期柞蚕幼虫，注射预先合成的Serpin-3 dsRNA(0.2μg/只)约24h后，分为三组分别继续注射大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌(2*108cells/ml，10μl)，诱导8h后收取脂肪体并提取RNA后进行qRT-PCR实验，发现注射dsRNA后，脂肪体几乎不再表达Serpin-3mRNA。
在成功封闭Serpin-3的基因后，利用qRT-PCR检测在不同病原微生物诱导下，柞蚕体内抗菌物质的表达情况。结果如图5A，在降低Serpin-3表达的前提下，用金黄色葡萄球菌诱导柞蚕抗菌肽的表达时发现，抗菌肽Gloverin、Moricin、Lysozyme、Ceropin A、attacin、Lebocin以及PPO的表达量均有显著上调，说明Serpin-3能够显著抑制柞蚕体内多种抗菌肽以及抗菌活性物质的合成。
相同实验结果出现在大肠杆菌、白色念珠菌、藤黄微球菌等多种病原菌诱导的情况下，如图5B、C。
3.Serpin-3及其类似物、活性片段对酚氧化酶原激活系统的抑制作用
按照实施例8-2方法封闭Serpin-3的基因，考察柞蚕幼虫在病原菌刺激下体表黑化情况。图6-A结果显示，相较于注射昆虫生理盐水与注射dsEGFP的对照组，Serpin-3干扰组幼虫在混合型微生物诱导情况下，体表更易变黑并有伴死亡现。说明Serpin-3能够抑制幼虫的黑化反应。
收集Serpin-3 dsRNA干扰后四龄期柞蚕血淋巴，以微生物典型病原体相关分子模式(laminarin，LTA和LPS)替代不同类型的微生物，诱导刺激柞蚕幼虫，考察血淋巴中酚氧化酶(PO)的活力。结果显示，Serpin-3基因封闭后血淋巴中PO的活性显著增强(图6-B)，结合上述黑化反应实验结果，说明Serpin-3在体内对柞蚕pro-PO系统具有负向调控作用。
体外实验考察Serpin-3及其类似物、活性片段对不同病原体诱导的柞蚕pro-PO系统的影响。首先通过体外酚氧化酶活性实验考察天然Serpin-3、重组Serpin-3、重组His6-Serpin-3、重组Serpin-3-Flag、重组Serpin-3-GST对酚氧化酶原激活系统的抑制作用：以重组His6-Serpin-3为例，将不同类型重组蛋白分别与血淋巴混合后，分别加入六种病原菌刺激激活血淋巴中的pro-PO系统，通过检测PO活力判定pro-PO系统的激活情况。实验结果(图6-C)显示，单纯重组蛋白对血淋巴PO系统没有明显的激活作用，但与六种病原菌(大肠杆菌，藤黄微球菌，枯草杆菌，白色念球菌，酵母菌，金黄色葡萄球菌)刺激激活的PO活力相比，重组蛋白的存在对病原体激活的PO系统具有明显的抑制作用。相同实验结果出现在不同类型的微生物典型病原体相关分子模式刺激下的PO系统中(图6-D)。利用重组Serpin-3、重组Serpin-3-Flag、重组Serpin-3-GST也可获得相同实验结果。
实施例8：
天然、重组Serpin-3以及其类似物、活性片段及其抗体的应用
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以Serpin-3的生物活性为代表进行描述，Serpin-3类似物、活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以Serpin-3及其类似物、活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展Serpin-3及其类似物、活性片段及其抗体的应用范围。
1.Serpin-3及其类似物、活性片段抑制丝氨酸蛋白酶的活性
如实施例8中所描述，Serpin-3及其类似物、活性片段可以显著抑制丝氨酸蛋白酶的活性，且不易产生耐药性，可以作为制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的治疗及其保健药物的应用。
2.Serpin-3及其类似物、活性片段抑制抗菌肽的产生
如实施例8中所描述，Serpin-3及其类似物、活性片段可以抑制昆虫产生抗菌肽，基于此，能够通过提高Serpin-3及其类似物、活性片段的含量，提高柞蚕的抗病能力。与此同时，利用Serpin-3及其类似物、活性片段的抗体封闭Serpin-3，能够显著提高昆虫体内多种抗菌肽的表达，基于此，可从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
3.Serpin-3及其类似物、活性片段抗体的应用
针对实施例6获得的Serpin-3及其衍生物、类似物、活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过Serpin-3及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的Serpin-3免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备Serpin-3过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组Serpin-3及其衍生物、类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
如实施例8中所描述，Serpin-3及其类似物、活性片段可以抑制昆虫产生抗菌肽，而利用Serpin-3及其类似物、活性片段的抗体封闭Serpin-3，能够显著提高昆虫体内多种抗菌肽的表达。基于此，可从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
Serpin-3及其类似物、活性片段的抗体，通过与Serpin-3及其类似物、活性片段的结合而屏蔽了Serpin-3及其类似物、活性片段原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
Claims (11)
1.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3，其特征在于：氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3，其特征在于：成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的序列或全序或片段；优选：Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的制备方法，其特征在于：利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液；该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂-3；再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合，分离纯化获得纯度达到电泳纯乃至HPLC纯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH10，优选pH4-pH9；(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液，碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的鳞翅目天蚕蛾科昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
7.权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物或活性片段的重组表达产物的基因表达方法，其特征在于，它包括(1)利用基因工程技术表达丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段(2)从上述表达体系中分离纯化重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段，(3)上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物活性组分，(4)上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯至HPLC纯度的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段。
8.如权利要求7所述的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞；上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的来源。
9.权利要求1或2所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的抗体，其特征在于，以丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段作为抗原。
10.权利要求1或2所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物的生物学功能，所述的功能为：(1)抑制丝氨酸蛋白酶的活性，(2)抑制昆虫多种抗菌肽的合成，(3)抑制酚氧化酶原系统，(4)抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统，提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力的应用，(5)制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病药物的应用。
11.权利要求所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段作为抗原所产生抗体的应用，所述的应用为：(1)丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的检测与追踪，(2)促进昆虫多种抗菌肽的表达，提高抗菌肽在医药领域的应用，(3)所述的抗体在特异性识别结合并屏蔽抗原中的应用。
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