CN106319066B

CN106319066B - 用于检测系统性红斑狼疮b细胞受体库的引物及试剂盒

Info

Publication number: CN106319066B
Application number: CN201610827404.7A
Authority: CN
Inventors: 曾小峰; 张恒辉; 陈真; 李梦涛; 陈红松; 张令令; 陈衍辉; 李国力; 曾辉
Original assignee: Beijing Ditan Hospital; Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Beijing Ditan Hospital; Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2016-09-14
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2036-09-14
Also published as: CN106319066A

Abstract

本发明提供用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物及检测试剂盒，所述试剂盒中包括的特异性引物序列分别如Seq ID No:1‑25所示。本发明的试剂盒产品具有高通量，多指标并行检测，检测快速、准确等优点。实验表明，利用本发明的试剂盒可以通过筛选BCR库来识别和量化扩增的B细胞及浆细胞克隆，对系统性红斑狼疮临床特征、亚型分析及个体化诊治的建立提供依据。

Description

用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地说，涉及用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物及试剂盒。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是最常见的自身免疫性疾病之一，致残、致死率高，血清中出现多种自身抗体和多系统受累是其主要临床特征。来自中国狼疮协作组的资料，目前中国SLE患者有一百多万，患病率居世界第二。经Meta分析得知，SLE患者5年生存率为94％，10年生存率为89％。作为一种多因素慢性风湿性疾病，SLE具有很强的遗传背景，存在多种自身免疫反应，以及多种自身抗体。虽然在狼疮中许多分子途径异常、多种细胞表型失调，但是B细胞是其核心角色，因为自身抗体是诊断SLE的关键，并且在免疫失调的其他证据出现之前自身抗体就已被发现。B细胞不但分泌自身抗体，也在抗原提呈和细胞因子分泌方面起关键作用。B细胞是正常免疫反应重要的启动者和效应者，在自身免疫反应过程中，B细胞执行同样的功能，只不过针对的是自身抗原。

机体体液免疫应答主要由B细胞介导，其通过产生特异性抗体来应答抗原，对机体起重要保护作用。产生自身抗体的B细胞是介导机体体液免疫应答的主要细胞群，其特异性是由B细胞受体(BCR)决定的，而BCR的多样性是由于VDJ基因重排。B细胞识别、结合抗原主要依赖互补决定区(CDR)，它决定着抗体的特异性。B细胞识别抗原主要依赖BCR，BCR是由两条重链(H)和两条轻链(κ或λ)组成的四聚体，其可变区和恒定区分别由不同染色体上的多个不连续基因片段重排所编码。人的κ链和λ链由“Vn-Jn-C”基因重排形成，H链由“Vn-Dn-Jn-Cn”基因重排形成，其可变区包含三个高变区，分别为：CDR1、CDR2、CDR3，CDR3比CDR1、CDR2更具多样性，而决定B细胞识别抗原肽的关键部位是最具多样性的重链CDR3区，其由“IGHV(51个功能性基因片段)末端-IGHD(23个功能性基因片段)--IGHJ前端(6个功能性基因片段)”基因重排及“V—D”和“D—J”连接时中间插入或剪接的核苷酸序列组成，类型转换和体细胞高频突变都能促成其多样性的形成。

由于BCR惊人的多样性，正常机体几乎能对所有侵入机体的异物产生应答。每种克隆B细胞BCR有着特定CDR3序列组成，当抗原进入机体，就会引起其特异性B细胞克隆扩增并产生相应抗体对抗原应答。由于B细胞BCR CDR3区是B细胞识别抗原的主要部位，其长度及多样性都会影响它对抗原的识别与亲和力，故B细胞的特异性可以认为是基因重组和体细胞高频突变形成特异CDR3的结果，CDR3序列多变的特征为抗原的选择提供一个多样化的B细胞受体库。

通过分析机体B细胞BCR CDR3受体库的多样性、重叠率的大小、CDR3区的基因/氨基酸组成特征、各亚家族的偏向取用等，可以观察生理及病理状态下机体免疫的相关情况，为监测和分析生理及病理状态下机体的免疫状况及B细胞的发生、发展机制提供新思路、新方法和手段。

SLE是临床表现高度异质性的自身免疫疾病，以淋巴细胞高反应性和致病性自身抗体形成为特征。引发这种疾病的免疫改变性质仍不清楚。B细胞显著活化和自身反应性的发生，提示掌控自身抗原识别BCR的一个或多个生理检查点，以及B细胞触发和成熟过程可能受影响。

在来自二级淋巴器官滤泡或自身免疫病患者异位滤泡的T辅助细胞和抗原的影响下，成熟初始B细胞经历生发中心反应，导致其克隆扩增、Ig基因重排和Ig重链类别转换重组等体细胞突变。这些分子过程对B细胞来说是独特的，可以保证与BCR高亲和力结合的特异性产生以及确定其最终效应功能。抗原激活B细胞易受到耐受诱导，然而克隆缺失不足以解释所有的耐受诱导，因为许多自身反应B细胞没有被清除，提示其他机制在发挥作用，阻止细胞更进一步发展成浆细胞或记忆B细胞，包括诱导无能和通过BCR特异性改变二级V(D)J重排。

高通量测序技术可通过筛选BCR库来识别和量化扩增的B细胞及浆细胞克隆，并有快速且可定量地纵向及横断面对比的优点，能实现克隆扩增与炎症的联动。

B细胞BCR CDR3受体库相关研究方法众多，如聚合酶链反应-单链构象多态性分析；伴随核酸末端标记技术的发展，用“免疫谱型分析技术”或“免疫扫描(指纹)技术”来研究CDR3序列；基于对相应探针进行各种标记(同位素、荧光素等)，用核酸杂交技术分析相应V或J基因家族组成的CDR3序列的表达频率等方法。上述方法均只能粗略地对序列多样性程度及高变区长度多态性分布或部分序列组成进行分析，所得数据局限且易出现偏差，要深入且动态地监测CDR3谱型，快速、全面观察个体B细胞BCR CDR3受体库序列的组成和特征，以及个体间的重叠率，研究其与疾病或与疾病活动情况的关联；对比分析同一疾病患者B细胞BCR CDR3受体库；比较患有某疾病的个体与正常个体B细胞BCR CDR3受体库的差异等问题，尚待进一步在基因水平对B细胞受体库进行深入研究。DNA测序技术的进展使生命研究的基本发生了转变，从单一、局部的基因或基因片段转变成整个基因组，要大批量、准确的检测序列组成变化需应用近年发展起来的高通量测序技术。

高通量测序技术又称“下一代测序技术”或“深度测序”或“第二代测序技术”，是对传统测序的一次革命性改变，一次能对几十万到几百万DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行全貌、细致的分析成为可能。它是一种高效、准确、灵敏度高、自动化的基因测序方法，它主要是应用特异性引物扩增目标序列，将扩增产物电泳，对目的区有条带者进行测序。目前，高通量测序是深入研究免疫受体库的快速高效的手段，应用于在肿瘤、自身免疫病、炎症性疾病和疫苗等方面的研究。通过大范围对B细胞受体基因进行分析，可发现某些基因位点与疾病存在关联；检测机体B细胞BCRCDR3受体库能发现其序列具单、寡克隆现象，为疾病的预防和早期诊断提供重要信息。

动物实验表明，大规模的克隆扩增是针对自身抗原形成的，自身反应性克隆常被认为是扩增的。编码BCR序列的几个特征可能指向自身反应性。比如，富含Ig重链基因V4-34(IGHV4-34)，这个基因是针对自身表位的反应，并似乎是受到严格调控以防止自身免疫应答。在SLE中，与健康个体和RA患者相比，这种IGHV4–34阳性且能产生自身抗体的浆细胞在外周血中广泛存在。另一个特异的表现(针对核抗原的反应)是BCR最主要的抗原结合区-重链CDR3区的氨基酸数目增加。这些通常是B细胞发育过程的反选择，但在自身免疫病中常发生。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物。

本发明的另一目的是提供含有上述引物的检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物，包括如下引物组合：

1)IgH特异性PCR扩增引物，序列如下(Seq ID No:1-10)：

2)IgK特异性PCR扩增引物，序列如下(Seq ID No:11-17)：

3)IgL特异性PCR扩增引物，序列如下(Seq ID No:18-25)：

其中，S为G或C，Y为T或C。

本发明还提供含有上述引物的用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的试剂盒。

优选地，所述试剂盒中还包括逆转录引物Oligo(dT)₂₀、逆转录酶、dNTP混合物、DEPC处理水、DTT、反应缓冲液等中的至少一种。

更优选地，所述试剂盒中还包括系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品。所述系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品来自健康对照人群BCR扩增产物TA克隆质粒。

所述试剂盒包括反转录合成cDNA第一链及PCR反应两个流程；

(1)反转录合成cDNA第一链

①配制如下体系I：总RNA 5μg，50μM Oligo(dT)₂₀ 1μL，10mMdNTP 1μL，DEPC处理水补至总体系10μL；

65℃孵育5min，然后冰上放置1min；

②配制如下体系II：10×RT反应缓冲液2μL，25mM MgCl₂ 4μL，0.1M DTT 2μL，40U/μL Rnase 1μL，200U/μL逆转录酶1μL；

50℃孵育50min，85℃5min终止反应，置冰上冷却；

(2)PCR反应

配制如下体系III：10×PCR反应缓冲液5μL，10mM dNTP 1.5μL，50mM MgSO₄ 0.5μL，cDNA第一链2μL，DNA聚合酶1U，10μM正向、反向引物各1.5μL，DEPC处理水补至总体系50μL；

IgH扩增引物的PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，60℃30s，68℃1min，50个循环；68℃5min；4℃保存；

IgK、IgL扩增引物的PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，59℃45s，68℃1min，50个循环；68℃5min；4℃保存。

本发明进一步提供上述引物或试剂盒在检测系统性红斑狼疮B细胞受体库中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)提取样品总RNA；

2)以步骤1)中提取的RNA为模板，进行逆转录获得cDNA第一链；

3)以步骤2)的cDNA为模板，分别PCR扩增IgH、IgK和IgL；

4)分析PCR扩增产物。

本发明基于高通量测序技术，通过大量实验开发出可用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物及检测试剂盒。本发明的试剂盒产品具有高通量，多指标并行检测，检测快速、准确等优点。实验表明，利用本发明的试剂盒可以通过筛选BCR库来识别和量化扩增的B细胞及浆细胞克隆，对系统性红斑狼疮临床特征、亚型分析及个体化诊治的建立提供依据。本发明所述的用于系统性红斑狼疮B细胞受体库的检测试剂盒具有无副作用、高通量、多指标并行检测、敏感度高、检测快速、重复性好等优点。

附图说明

图1为本发明实施例2中合成的cDNA第一链及PCR扩增结果；其中，1表示普通RT-PCR，2表示特异RT-PCR。

图2为本发明实施例1中系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例2中SLE患者BCR IgH V-J pairing分析结果。建立BCR IgH/IgK/IgL的PCR特异性扩增体系，并对扩增后的IgH/IgK/IgL通过Miseq二代测序平台进行深度测序，通过生物信息学分析明确在SLE组特异性扩增的BCR克隆。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品来自健康对照人群BCR扩增产物TA克隆质粒。

实施例1系统性红斑狼疮B细胞受体库的检测试剂盒的制备

1、试剂盒组成

(1)特异性PCR扩增IgH、IgK和IgL的引物

1)IgH特异性PCR扩增引物，序列如下：

2)IgK特异性PCR扩增引物，序列如下：

3)IgL特异性PCR扩增引物，序列如下：

其中，S为G或C，Y为T或C。

(2)系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品

(3)SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Cat.No:18080-051)

(4)

Pfx DNA聚合酶(Cat.No.11708-013)

2、试剂盒的应用

RT-PCR流程：

(一)试剂：SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System forRT-PCR(Cat.No:18080-051)

(二)RT-PCR流程：所有试剂使用前，需先震荡混匀，此次逆转录体系为20ul。(逆转录的RNA含量根据所提取的细胞RNA含量自行调整，并使各组逆转录的RNA含量相同，RT-PCR流程参考SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂说明书，具体流程如下：

(1)使用前混合并短暂离心每个样品。

(2)用0.2ml或0.5ml试管混合下列成分：

(3)试管在65℃孵育5min，置于冰上至少1min。

(4)准备下列cDNA Synthesis Mix，按既定顺序加入每种成分：

(5)加10μL cDNA Synthesis Mix至每个RNA/引物混合物中，轻微混匀，短暂离心富集。孵育条件如下：Oligo(dT)₂₀:50℃50min。

(6)85℃5min终止反应，在冰上冷却。

(7)cDNA合成反应产物可保存于-20℃或直接用于PCR反应。

PCR流程：

(一)试剂：

Pfx DNA Polymerase(Cat.No.11708-013)

(二)PCR流程：所有试剂使用前，需先震荡混匀，此次PCR体系为50μL。所有的引物浓度都是10μM(即10μmol/L)。

配制以下VH/VK/VL混合物：

注：A.Template DNA用>100ng RNA逆转时，PCR体系中50mM MgSO4:1μl。

B.Template DNA用<100ng RNA逆转时，PCR体系中50mM MgSO4:0.5μl。

C.PCR反应体系用VH/VK/VL单个引物或引物混合物按上述体系进行扩增。

将上述混合物震荡混匀，稍微离心使各试剂组分沉到管底。

PCR反应条件：

VH反应条件：94℃，2min；50个循环(94℃，30s；60℃，30s；68℃，1min)；68℃，5min；4℃∞

VK+VL反应条件：94℃，2min；50个循环(94℃，30s；59℃，45s；68℃，1min)；68℃，5min；4℃∞

对PCR产物进行电泳检测，PCR产物放于-20℃保存，并送测序。

实施例2系统性红斑狼疮患者BCR库检测

1、实验目的

对系统性红斑狼疮患者BCR库进行扩增及高通量测序检测。

2、实验对象

1)在知情同意及满足纳入条件的前提下，选择入组病例，记录个人基本信息。

2)对5例健康志愿者、5例系统性红斑狼疮的外周血CD8+T细胞的BCRα、β链受体库进行了测序。

3、试剂准备

采用实施例1中制备的试剂盒。

标准品对照(系统性红斑狼疮特异性T细胞受体库参考品)。

4、实验流程：

RT-PCR流程：

(一)试剂：SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Cat.No:18080-051)

(1)使用前混合并短暂离心每个样品。

(2)用0.2或0.5ml试管混合下列成分：

Component	Amount
Component	Amount	up to 5μg total RNA	nμL(80ng RNA)
Primer:50μM oligo(dT)20	1μL	up to 5μg total RNA	nμL(80ng RNA)
Primer:50μM oligo(dT)20	1μL	10mM dNTP mix	1μL
DEPC-treated water	to 10μL	10mM dNTP mix	1μL

(3)试管在65℃孵育5min，置于冰上至少1min。

(4)准备下列cDNA Synthesis Mix，按既定顺序加入每种成分：

(6)85℃5min终止反应，在冰上冷却。

(7)cDNA合成反应产物可保存于-20℃或直接用于PCR反应。

PCR流程：

(一)试剂：

Pfx DNA Polymerase(Cat.No.11708-013)

配制以下VH/VK/VL混合物：

注：A.Template DNA用>100ng RNA逆转时，PCR体系中50mM MgSO4:1μl。

B.Template DNA用<100ng RNA逆转时，PCR体系中50mM MgSO4:0.5μl。

将上述混合物震荡混匀，稍微离心使各试剂组分沉到管底。

PCR反应条件：

对PCR产物进行电泳检测，PCR产物放于-20℃保存，并送测序。合成的cDNA第一链及PCR扩增结果见图1。系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品的PCR扩增结果见图2。

用Nanodrop定量，以便下一步建库时计算起始量。纯化后DNA量一般在45ng/μl左右。

·纯化DNA建库及胶回收。

·Qubit Quantitation库定量。

·Real-Time PCR库定量。

·Hiseq2500P250测序。

通过生物信息分析，研究结果表明：1、系统性红斑狼疮患者BCR受体库水平上与健康志愿者存在较大差异；2、与健康志愿者相比，通过V-J paring分析系统性红斑狼疮患者存在极少部分的特征性的克隆型的B细胞扩增。(图3)

实验结果表明，采用本发明的试剂盒可以实现系统性红斑狼疮患者SLE进程中B细胞应答的规律检测，以及特异性系统性红斑狼疮患者的B细胞应答的分子特征判定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims

1.用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的引物，其特征在于，包括如下引物组合：

1)IgH特异性PCR扩增引物，序列如下：

正向引物5′-3′：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG

反向引物5′-3′：

GACSGATGGGCCCTTGGTGGA

2)IgK特异性PCR扩增引物，序列如下：

正向引物5′-3′：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCC

GATATTGTGATGACCCAGWCTCC

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC

GACATCGTGATGACCCAGTCTCC

GAAACGACACTCACGCAGTCTCC

GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC

反向引物5′-3′：

CGTTGGTGCAGCCACAGT

3)IgL特异性PCR扩增引物，序列如下：

正向引物5′-3′：

GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG

GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG

GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG

GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG

GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG

GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG

GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG

反向引物5′-3′：

AGAGGASGGYGGGAACAGAGTGAC

其中，S为G或C，Y为T或C。

2.含有权利要求1所述引物的用于检测系统性红斑狼疮B细胞受体库的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括逆转录引物Oligo(dT)₂₀、逆转录酶、dNTP混合物、DEPC处理水、DTT、反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括系统性红斑狼疮B细胞受体库标准品。