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CN106153811A - 美洲大蠊冻干粉质量控制方法 - Google Patents

美洲大蠊冻干粉质量控制方法 Download PDF

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CN106153811A
CN106153811A CN201610627319.6A CN201610627319A CN106153811A CN 106153811 A CN106153811 A CN 106153811A CN 201610627319 A CN201610627319 A CN 201610627319A CN 106153811 A CN106153811 A CN 106153811A
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freeze
dried powder
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ethanol
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CN201610627319.6A
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张丹
刘明华
余昕
陈斯玮
周洁
孙琴
傅超美
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Original Assignee
Southwest Medical University
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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊冻干粉质量控制方法，包括利用薄层色谱法进行氨基酸鉴别、利用紫外‑可见分光光度法对氨基酸和多肽进行含量测定、利用高效液相色谱法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐进行含量测定。本发明的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，从氨基酸定性鉴别、氨基酸、多肽、核苷类成分含量测定、氨基酸组成分析、多肽分子量测定等几个方面对美洲大蠊冻干粉质量进行检测控制。对美洲大蠊冻干粉的质量提供了有力的保证，保障了以美洲大蠊冻干粉为中间体的后期制剂的质量和疗效。

Description

美洲大蠊冻干粉质量控制方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体地说，涉及一种美洲大蠊冻干粉质量控制方法。
背景技术
美洲大蠊(Periplaneta americana(L.))为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫的干燥虫体，又名蟑螂、石姜、滑虫、偷油婆、茶婆子，入药始载于《神农本草经》，谓“味咸，寒。主血瘀、症坚、寒热，破积聚，喉咽痹，内寒，无子”，具有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效，用于治疗小儿疳积、疔疮、痈肿、喉蛾、无名肿毒、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬伤等疾病。含有蛋白质、氨基酸、肽类、糖类等多种有效成分，现代研究表明，在抗癌、提高免疫力、治疗心血管疾病、修复皮肤等方面具有显著的作用。
癌症是仅次于心血管疾病的人类第二大杀手，严重危害人类健康，已逐渐成为重大的社会公共卫生问题。西医对肿瘤的治疗仍以手术、放疗和化疗为主，毒副作用严重和广泛，导致病人机体状况的恶化及生命质量的下降，多数患者因不能忍受而放弃治疗，甚至死于过度治疗。中医药对肿瘤的治疗起着不可估量的作用，恶性肿瘤属于中医“癌”、“岩”、“恶肿”、“积聚”等范畴，中药治疗恶性肿瘤立足于整体观念，扶正与祛邪相结合，标本兼治，从而增强疗效，具有西医不可比拟的独特优势(多途径、多靶点和多环节的共同作用)，逐渐成为抗肿瘤研究的热点。
美洲大蠊具有高蛋白的资源优势，其体内粗蛋白质含量在20％-70％之间，远远高于猪肉、牛肉、鸡肉等肉类。美洲大蠊还富含氨基酸18种以上，包括人体半必需氨基酸2种和人体必需氨基酸7种。文献报道现已从美洲大蠊中分离鉴定出50多种神经肽，如神经肽原肛肽、昆虫抗菌肽等。其中昆虫抗菌肽是具有生物活性短链多肽，具对热稳定、广谱抗菌等特点，能抑制多种肿瘤细胞及动物实体瘤的生长，且不会对正常细胞造成伤害。廖吉在“蜚蠊油脂在保健食品和医药上的应用及制备方法”(CN1500495A)中指出：“蜚蠊含油酸，亚油酸，亚麻酸等不饱和脂肪酸，其含量高达71.903％，具有抗菌和修复创伤，增强免疫力等作用”。蒙松年、焦春香等采用GC-MS对美洲大蠊的提取物进行分析，发现含有较多烯醇、烯酸类和烷烃、多元醇、大环内酯类物质。此外，美洲大蠊体内还含有信息素、糖类(如粘多糖等)，酶，酯酶，辅酶A及丰富的矿物质和微量元素。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种美洲大蠊冻干粉质量控制方法。
本发明公开了一种美洲大蠊冻干粉质量控制方法，包括利用薄层色谱法进行氨基酸鉴别、利用紫外-可见分光光度法对氨基酸和多肽进行含量测定、利用高效液相色谱法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐进行含量测定。
进一步的，所述氨基酸鉴别方法为称取0.5g美洲大蠊冻干粉，加70％的乙醇10ml，超声10min，过滤，收集滤液，水浴挥干，残渣加70％的乙醇5ml溶解，作为供试品溶液；
分别取丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加70％的乙醇制成1mg/ml的对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为75:15:10的正丁醇-甲酸-水溶液为展开剂，饱和30min后展开，取出，晾干，喷以0.2％茚三酮乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰；
观察硅胶G薄层板，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在日光下显相同颜色的斑点。
进一步的，所述多肽含量测定方法为：
精密称取牛血清白蛋白对照品(BSA)51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，配成每1ml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液；
精密称取冻干粉0.2g，置容量瓶中，加入70％的乙醇2.0ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
取供试品溶液和对照品溶液各1ml，分别加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55℃水浴15min，取出冷却至室温，显色后，照分光光度法，在740nm处测定吸光度，计算即得。
进一步的，所述氨基酸含量测定方法为：
精密称取16.08mg丙氨酸对照品，置100ml容量瓶中，加10％的异丙醇溶解，并稀释至刻度，作为母液；精密量取所述母液4ml，至50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成每1ml含12.86μg丙氨酸的对照品溶液；
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％的乙醇10ml，精密称定重量，超声提取15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇均，滤过，取续滤液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
取供试品溶液和对照品溶液各2ml至10ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至2ml，加0.1ml新鲜配制的1％Vc溶液，3ml茚三酮醇溶液，混匀，在100℃水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60％乙醇至刻度，在570nm处测定吸光度，计算即得。
进一步的，所述尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐进行含量测定方法为
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A，0.7％冰乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温30℃，流速0.7ml/min；
洗脱梯度为：
0-15min 100％的0.7％冰乙酸溶液-99％的0.7％冰乙酸溶液，
15-40min 99％的0.7％冰乙酸溶液-92％的0.7％冰乙酸溶液，
40-50min 92％的0.7％冰乙酸溶液-45％的0.7％冰乙酸溶液；
对照品溶液的制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品，精密称定，置量瓶中，加超纯水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黄嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，蒸馏水10ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇均，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水定容至10ml量瓶中，0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算即得，冻干粉每克含尿嘧啶不得少于0.22％、次黄嘌呤不得少于0.77％、肌酐不得少于4.62％。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，从氨基酸定性鉴别、氨基酸、多肽、核苷类成分含量测定、氨基酸组成分析、多肽分子量测定等几个方面对美洲大蠊冻干粉质量进行检测控制。对美洲大蠊冻干粉的质量提供了有力的保证，保障了以美洲大蠊冻干粉为中间体的后期制剂的质量和疗效。
2)本发明的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，进一步完善美洲大蠊饮片、提取物及其制剂的质量标准，对美洲大蠊饮片、提取物及其制剂有一定的参考价值。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1所示为本发明实施例1中美洲大蠊冻干粉薄层色谱图；
图2所示为本发明实施例2中美洲大蠊冻干粉紫外扫描图(对照品)；
图3所示为本发明实施例2中美洲大蠊冻干粉紫外扫描图(供试品)；
图4所示为本发明实施例2中牛血清白蛋白标准曲线图；
图5所示为本发明实施例3中美洲大蠊冻干粉紫外扫描图(对照品)；
图6所示为本发明实施例3中美洲大蠊冻干粉紫外扫描图(供试品)；
图7所示为本发明实施例3中丙氨酸对照品标准曲线图；
图8所示为本发明实施例4中混合对照品高效液相色谱图；
图9所示为本发明实施例4中美洲大蠊冻干粉高效液相色谱图；
图10所示为本发明实施例4中尿嘧啶标准曲线图；
图11所示为本发明实施例4中次黄嘌呤标准曲线图；
图12所示为本发明实施例4中肌酐标准曲线图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1氨基酸鉴别
称取0.5g美洲大蠊冻干粉，加70％的乙醇10ml，超声10min，过滤，收集滤液，水浴挥干，残渣加70％的乙醇5ml溶解，作为供试品溶液。
分别取丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加70％的乙醇制成1mg/ml的对照品溶液。
照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-甲酸-水(75:15:10)为展开剂，饱和30min后展开，取出，晾干，喷以0.2％茚三酮乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，在日光下检视。
结果如图1所示，图中1为丙氨酸、3为苯丙氨酸、5为甘氨酸；2、4、6均为美洲大蠊冻干粉。图中供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，在日光下显相同颜色的斑点。
实施例2多肽含量测定
美洲大蠊冻干粉中主要有效成分为多肽类成分，照2010年版《中国药典》一部附录VA紫外-可见分光光度项下有关规定，参照文献资料以牛血清白蛋白为对照品测定总多肽含量。
2.1对照品溶液制备
精密称取牛血清白蛋白对照品(BSA)51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，配成每1ml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液。
2.2检测波长的选择
精密量取对照品溶液，样品溶液各1ml于10ml具塞刻度试管中，加碱性铜试剂5.0ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55℃水浴15min，取出冷却至室温，显色后，在400-800nm范围内进行扫描，见下图2和3。
由图2和3可知，对照品溶液、供试品溶液均在740nm处有最大吸收，故选740nm为美洲大蠊多肽的测定波长。
2.3线性范围考察
精密吸取BSA对照品溶液0(空白)，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，加蒸馏水补足至1.0ml。加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55℃水浴15min，取出冷却至室温，显色后，照分光光度法(中华人共和国药典2010年版I部，附录VA)，在740nm处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，多肽浓度X为横坐标，绘制标准曲线，结果见图4。直线回归方程为：Y＝0.0071X+0.087(r＝0.9993)，表明牛血清白蛋白在15.938μg/ml～79.692μg/ml内，样品浓度与吸光度线性关系良好。
2.4供试样品溶液制备
2.4.1提取方法的选择
精密称取冻干粉0.02g，置容量瓶中，加入70％的乙醇2.0ml，精密称定重量，用不同的方式提取15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，照2.3项下的方法，自“加碱性铜试剂5.00ml”起，依法测定吸光度，计算，结果见表1。
表1提取方法的比较
提取方法 振摇 超声
多肽含量(％) 65.25 67.89
由表1可知，超声法要好于振摇，故选择超声提取。
2.4.2提取溶剂的考察
精密称取冻干粉0.02g，分别加水、70％乙醇、90％乙醇各2.0m1，精密称定重量，超声15min，放冷，用相应的溶剂补足减失的重量，同2.3项下方法，自“加碱性铜试剂5.00ml”起，依法测定吸光度，计算，结果见表2。
表2提取溶剂的比较
提取溶剂 蒸馏水 70％乙醇 90％乙醇
多肽含量(％) 66.78 68.35 67.55
由表2可知，70％乙醇提取比蒸馏水和90％乙醇多一些，故选用70％乙醇作为提取溶剂。
2.4.3提取溶剂用量的考察
精密称取冻干粉0.02g，分别加入2ml、3ml、4ml的70％乙醇，精密称定重量，超声15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，同2.3下方法，依法测定吸光度，计算多肽含量，结果见表3。
表3提取溶剂用量的考察
溶剂用量(ml) 2 3 4
多肽含量(％) 68.31 68.46 68.24
由表3可知，溶剂用量对多肽的提取影响不大，故确定溶剂用量为2ml。
2.4.4提取时间的考察
精密称取冻干粉0.02g，加70％乙醇2.0ml，精密称定重量，分别超声10min、15min、20min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，同2.3下方法，依法测定吸光度，计算，结果见表4。
表4提取时间的考察
提取时间(min) 10 15 20
多肽含量(％) 68.33 68.37 67.30
由表4可知，超声10min时，多肽已基本提出，故将超声时间定为10min。
2.5精密度试验
取同一对照品溶液，重复测定6次，计算RSD值，结果见表5。
表5精密度试验
由表5可知，6次测定对照品溶液的吸光度，其RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
2.6稳定性试验
取供试品溶液分别于0h，0.5h，1h，1.5h，2h测定吸光度，计算其RSD，结果见表6。
表6稳定性试验
由表6可知：供试品溶液吸光度的RSD＜3％，供试品液在2h内稳定。
2.7重复性试验
精密称取同一批供试品6份，按供试品溶液的制备方法制备样品供试液，分别进行测定，计算含量，结果见表7。
表7重复性试验
由表7可知：RSD<3％，该法有良好的重复性。
2.8加样回收率试验
精密取已知含量的供试品适量0.01g，加一定量的牛血清白蛋白对照品(浓度：6.52mg/ml)，制备新的供试品溶液，照上述测定方法测定吸光度，结果见表8。
表8加样回收试验结果
由表8可知，加样回收率在95％～105％之间，RSD<3％，表明该法测定多肽含量准确可行。
2.9最终确定的多肽含量测定方法
精密称取牛血清白蛋白对照品(BSA)51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，配成每1ml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液。
精密称取冻干粉0.2g，置容量瓶中，加入70％的乙醇2.0ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
取供试品溶液和对照品溶液各1ml，分别加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55℃水浴15min，取出冷却至室温，显色后，照分光光度法，在740nm处测定吸光度，计算即得。
按上述方法测定三批冻干粉多肽含量，结果见表9。
表9冻干粉多肽含量的测定
由表9可知，冻干粉中平均多肽含量为67.43％，考虑到饮片的来源，加工，制剂生产等因素，暂定冻干粉每克含多肽以牛血清白蛋白计不得少于53.94％。
实施例3氨基酸含量测定
美洲大蠊冻干粉中，氨基酸为有效成分之一，照2010年版《中国药典》一部附录VA紫外-可见分光光度项下有关规定，以丙氨酸为对照品测定总氨基酸含量。
3.1对照品溶液的配制
精密称取16.08mg丙氨酸对照品，置100ml容量瓶中，加10％的异丙醇溶解，并稀释至刻度，作为母液。精密量取4ml，至50ml容量瓶中，用水至刻度，配制成每1ml含12.86μg丙氨酸的对照品溶液。
3.2检测波长的选择
精密量取对照品溶液、样品溶液于10ml具塞刻度试管中，加入0.lml新鲜配制的1％Vc溶液，3m1茚三酮醇溶液，混匀，在100℃水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60％乙醇至刻度，在400-700nm范围内进行扫描，见图5和6。
由图5和6可知，在570nm处，对照品溶液和供试品均有最大吸收，故选570nm为检测波长。
3.3线性范围考察
精密吸取丙氨酸对照品溶液(12.86μg/ml)0(空白)、0.4、0.8、1.2、1.6、2ml至10ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至2ml，加0.lml新鲜配制的1％Vc溶液，3m1茚三酮醇溶液，混匀，在100℃水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60％乙醇至刻度，在570nm处测定吸光度，以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图7。直线回归方程为：Y＝0.249X+0.1137(r＝0.9996)，表明丙氨酸在0.5146μg/ml～2.5728μg/ml内，样品浓度与吸光度线性关系良好。
3.4供试品溶液的制备
3.4.1提取方法的选择
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％的乙醇10ml，精密称定重量，用不同的方式提取15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇均，滤过，取续滤液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，照3.3项下的方法，依法在570nm处测定吸光度，计算，结果见表10。
表10提取方法的比较
提取方法 振摇 超声
氨基酸(％) 5.58 5.32
由表10可知，超声提取比振摇能提取出更多的氨基酸，超声法更简单，故选择超声处理。
3.4.2提取溶剂的考察
精密称取冻干粉0.2g，分别加水、70％乙醇、90％乙醇各10m1，精密称定重量，超声15min，放冷，分别用相应的溶剂补足减失的重量，同3.3项下方法，依法测定吸光度，计算，结果见表11。
表11提取溶剂的比较
提取溶剂 90％乙醇 70％乙醇 蒸馏水
氨基酸(％) 5.61 5.66 5.43
由表11可知，70％乙醇与90％乙醇提取效果相差不大，70％乙醇略多一些，选用70％乙醇作为提取溶剂。
3.4.3提取溶剂用量的考察
精密称取冻干粉0.2g，分别加入5ml、10ml、15ml的70％乙醇，精密称定重量，超声15min，用70％乙醇补足减失的重量，同3.3项下方法，依法测定吸光度，计算，结果见表12。
表12提取溶剂用量的考察
溶剂用量(ml) 5 10 15
氨基酸(％) 5.34 5.63 5.67
由表12可知，加入15ml时，氨基酸的含量最大，但与用10ml乙醇没有多大差别，10ml乙醇也能提取完全，故确定溶剂用量为10ml。
3.4.4提取时间的考察
精密称取冻干粉0.2g，加70％的乙醇10ml，精密称定重量，分别超声提取10min、15min、20min，用70％乙醇补足减失的重量，同3.3项下方法，依法测定吸光度，计算，结果见表13。
表13提取时间的考察
提取时间(min) 10 15 20
氨基酸(％) 5.58 5.71 5.64
由表13可知，超声处理15min时，能将冻干粉中的氨基酸完全提出，故确定超声时间为15min。
3.5精密度试验
取同一对照品溶液，重复测定6次，计算RSD值，结果见表14。
表14精密度试验结果
由表14可知，6次测定对照品溶液的吸光度，其RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
3.6稳定性试验
取供试品溶液分别于0h，0.5h，1h，1.5h，2h测定吸光度，计算其RSD，结果见表15。
表15稳定性试验结果
由表15可知：供试品溶液吸光度的RSD＜3％，供试品液在2h内稳定。
3.7重复性试验
精密称取同一批供试品6份，按供试品溶液的制备方法制备样品供试液，分别进行测定，计算含量，结果见表16。
表16重复性试验结果
由表16可知：RSD<3％，该法有良好的重复性。
3.8加样回收率试验
精密取已知含量的供试品0.1g九份，分别精密加入丙氨酸对照品(浓度：5.082mg/ml)0.3、0.4、0.5ml，制备新的供试品溶液，照上述测定方法测定吸光度，结果见表17。
表17加样回收率试验
由表17可知，加样回收率在95％～105％之间，RSD<3％，表明该法测定氨基酸含量准确可行。
3.9最终确定的氨基酸含量测定方法
精密称取16.08mg丙氨酸对照品，置100ml容量瓶中，加10％的异丙醇溶解，并稀释至刻度，作为母液；精密量取所述母液4ml，至50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成每1ml含12.86μg丙氨酸的对照品溶液；
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％的乙醇10ml，精密称定重量，超声提取15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇均，滤过，取续滤液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
取供试品溶液和对照品溶液各2ml至10ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至2ml，加0.1ml新鲜配制的1％Vc溶液，3ml茚三酮醇溶液，混匀，在100℃水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60％乙醇至刻度，在570nm处测定吸光度，计算即得。
按上述方法测定三批冻干粉氨基酸含量，结果见表18。
表18冻干粉氨基酸含量的测定
由表18可知，冻干粉中氨基酸含量为5.64％，考虑到饮片的产地来源，制剂生产等因素，暂定冻干粉每克氨基酸含量以丙氨酸计不得少于4.51％。
实施例4核苷类成分含量测定
美洲大蠊中含有较多的核苷类成分，是生物氧化、抗肿瘤药物的中间体，具有重要的生物活性，参照有关文献报道，采用HPLC-UV法测定美洲大蠊冻干粉中主要核苷类成分尿嘧啶、次黄嘌呤及肌苷的含量。
4.1色谱条件的选择
色谱柱：Sepax HP-C18柱(250×4.6mm，5μm)
流动相：色谱条件：流动相：甲醇(A)-0.7％冰乙酸溶液(B)梯度洗脱：0～15min，100％的0.7％冰乙酸溶液～99％的0.7％冰乙酸溶液；15～40min，99％的0.7％冰乙酸溶液～92％的0.7％冰乙酸溶液；40～50min，92％的0.7％冰乙酸溶液～45％的0.7％冰乙酸溶液；检测波长254nm；进样量10μl；温度30℃，体积流量0.7ml/min。
4.2对照品溶液的制备
取尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品适量，精密称定，置量瓶中，加超纯水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黄嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合对照品溶液，即得。
4.3线性范围考察
分别精密吸取上述混合对照品溶液4、6、8、10、12、14μl按照上述色谱条件依次进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，结果见表19，混合对照品对照品、美洲大蠊冻干粉高效液相色谱图分别见图8和9，标准曲线见图10-12。
表19线性范围的考察
如图10-12所示，尿嘧啶直线回归方程为：Y＝59.2789X+10.7480(r＝0.9997)；次黄嘌呤直线回归方程为：Y＝53.0102X-24.1614(r＝0.9999)；肌苷直线回归方程为：Y＝25.1879X-29.6832(r＝0.9998)，表明尿嘧啶在2.008×10-2～7.028×10-2μg；次黄嘌呤内在10.08×10-2～35.28×10-2μg；肌苷在51.00×10-2～178.50×10-2μg，呈良好的线性关系。
4.4.供试品溶液的制备
4.4.1提取方法的选择
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水10ml，精密称定重量，用不同的方式提取10min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水定容至10ml量瓶中，0.45μm滤膜过滤，取续滤液按4.1项下的方法进行测定，结果见表20。
表20提取方法的比较
提取方法 振摇 超声
尿嘧啶(％) 0.26 0.28
次黄嘌呤(％) 0.95 0.97
肌酐(％) 5.63 5.75
由表20可知，超声法要好于振摇，且更为简单，故选择超声提取。
4.4.2提取溶剂的考察
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水10ml，70％乙醇各10m1，精密称重，超声提取10min，放冷，用相同溶剂补足减失的重量，照4.4.1下方法制备样品和4.1项下的方法进行测定，结果见表21。
表21提取溶剂的考察
提取溶剂 蒸馏水 70％乙醇
尿嘧啶(％) 0.28 0.27
次黄嘌呤(％) 0.97 0.94
肌酐(％) 5.75 5.58
由表21可知，蒸馏水提取效果要优于70％乙醇，故选用蒸馏水作为提取溶剂。
4.4.3提取溶剂用量的考察
精密称取冻干粉0.2g，分别加入5ml、10ml、15ml蒸馏水，精密称重，超声15min，照4.4.1下方法制备样品和4.1项下的方法进行测定，结果见表22。
表22提取溶剂用量的考察
溶剂用量(ml) 5 10 15
尿嘧啶(％) 0.27 0.28 0.27
次黄嘌呤(％) 0.88 0.97 0.96
肌酐(％) 5.63 5.75 5.77
由表22可知，溶剂用量10ml和15ml对核苷类成分含量影响不大，故确定溶剂用量为10ml。
4.4.4提取时间的考察
精密称取冻干粉0.2g，加蒸馏水10ml，精密称重，分别超声5min、10min、15min，照4.4.1下方法制备样品和4.1项下的方法进行测定，结果见表23。
表23提取时间的考察
提取时间(min) 5 10 15
尿嘧啶(％) 0.26 0.28 0.27
次黄嘌呤(％) 0.93 0.97 0.95
肌酐(％) 5.57 5.75 5.59
由表23可知，超声10min时，已基本能提出核苷类成分，故确定超声时间为10min。
4.4.5验证试验
综合上述试验结果，制备3批供试品，其方法如下：精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水10ml，精密称重，超声提取10min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水定容至10ml量瓶中，0.45μm滤膜过滤，取续滤液按4.1项下的方法进行测定，结果见表24。
表24验证试验结果
试验序号 1 2 3
尿嘧啶(％) 0.28 0.29 0.28
次黄嘌呤(％) 0.97 0.96 0.95
肌酐(％) 5.75 5.79 5.71
由表24可知，该供试品的制备方法合理可行。
4.5精密度试验
取同一混合对照品溶液，重复测定6次，计算RSD值，结果见表25。
表25精密度试验结果
试验序号 尿嘧啶(mAU) 次黄嘌呤(mAU) 肌酐(mAU)
1 312.35 1323.08 3209.46
2 309.01 1306.34 3173.34
3 315.48 1328.43 3211.53
4 314.98 1327.01 3216.83
5 310.86 1302.45 3168.58
6 310.04 1316.36 3194.76
平均峰面积 312.12 1317.28 3195.75
RSD(％) 0.85 0.83 0.64
由表25可知，6次测定对照品溶液的吸光度，其RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
4.6稳定性试验
取同一批供试品，按供试品溶液的制备方法制备样品供试液，分别于0h，2h，4h，8h，16h，24h进样，按照4.1测定峰面积，考察稳定性，计算其RSD，结果见表26。
表26稳定性试验结果
测定时间(h) 尿嘧啶(mAU) 次黄嘌呤(mAU) 肌酐(mAU)
0 338.81 1010.4 2901.08
2 340.11 1023.09 2910.66
4 332.34 1015.38 2894.09
8 329.13 1008.73 2881.53
16 325.43 991.31 2873.53
24 320.85 983.52 2863.76
平均峰面积 331.11 1005.41 2887.44
RSD(％) 2.27 1.49 0.61
由表26可知：供试品溶液吸光度的RSD＜3％，供试品液在2h内稳定。
4.7重复性试验
精密称取同一批供试品6份，按供试品溶液的制备方法制备样品供试液，按照4.1进行测定，计算含量，结果见表27。
表27重复性试验结果
由表27可知：RSD<3％，该法有良好的重复性。
4.8加样回收率试验
精密取已知含量的供试品适量0.1g，分别加一定量的尿嘧啶(浓度：0.2813mg/ml)、次黄嘌呤(浓度：1.05mg/ml)、肌苷(浓度：5.51mg/ml)对照品，按供试品溶液的制备方法制备新的样品供试液，按照4.1进行测定，计算含量，结果见表28。
表28加样回收试验结果
由表28可知，加样回收率在95％～105％之间，RSD<3％，表明该法准确可行。
4.9最终确定的核苷类成分的含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A，0.7％冰乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温30℃，流速0.7ml/min。
洗脱梯度为：
对照品溶液的制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品，精密称定，置量瓶中，加超纯水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黄嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，蒸馏水10ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇均，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水定容至10ml量瓶中，0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算即得，冻干粉每克含尿嘧啶不得少于0.22％、次黄嘌呤不得少于0.77％、肌酐不得少于4.62％。
按上述方法测定三批冻干粉多肽含量，结果见表29。
表29冻干粉核苷类成分的含量测定
试验号 尿嘧啶(％) 次黄嘌呤(％) 肌酐(％)
1 0.28 0.96 5.79
2 0.27 0.95 5.74
3 0.28 0.97 5.81
平均含量(％) 0.28 0.96 5.78
RSD(％) 2.09 1.04 0.62
由表29可知，冻干粉中平均尿嘧啶含量为0.28％、平均次黄嘌呤含量为0.96％、平均肌苷含量为5.78％，考虑到饮片的来源，加工，制剂生产等因素，暂定冻干粉每克含尿嘧啶不得少于0.22％、次黄嘌呤不得少于0.77％、肌酐不得少于4.62％。
本发明的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，从氨基酸定性鉴别、氨基酸、多肽、核苷类成分含量测定、氨基酸组成分析、多肽分子量测定等几个方面对美洲大蠊冻干粉质量进行检测控制。对美洲大蠊冻干粉的质量提供了有力的保证，保障了以美洲大蠊冻干粉为中间体的后期制剂的质量和疗效。本发明的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，进一步完善美洲大蠊饮片、提取物及其制剂的质量标准，对美洲大蠊饮片、提取物及其制剂有一定的参考价值。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.美洲大蠊冻干粉质量控制方法，其特征在于，包括利用薄层色谱法进行氨基酸鉴别、利用紫外-可见分光光度法对氨基酸和多肽进行含量测定、利用高效液相色谱法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐进行含量测定。
2.如权利要求1所述的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，其特征在于，所述氨基酸鉴别方法为称取0.5g美洲大蠊冻干粉，加70％的乙醇10ml，超声10min，过滤，收集滤液，水浴挥干，残渣加70％的乙醇5ml溶解，作为供试品溶液；
分别取丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加70％的乙醇制成1mg/ml的对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为75:15:10的正丁醇-甲酸-水溶液为展开剂，饱和30min后展开，取出，晾干，喷以0.2％茚三酮乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰；
观察硅胶G薄层板，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在日光下显相同颜色的斑点。
3.如权利要求1所述的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，其特征在于，所述多肽含量测定方法为：
精密称取牛血清白蛋白对照品51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，配成每1ml含0.5180mg牛血清白蛋白的对照品溶液；
精密称取冻干粉0.2g，置容量瓶中，加入70％的乙醇2.0ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
取供试品溶液和对照品溶液各1ml，分别加碱性铜试剂5.00ml，混匀，快速加入酚试剂0.5ml，快速摇匀，55℃水浴15min，取出冷却至室温，显色后，照分光光度法，在740nm处测定吸光度，计算即得。
4.如权利要求1所述的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，其特征在于，所述氨基酸含量测定方法为：
精密称取16.08mg丙氨酸对照品，置100ml容量瓶中，加10％的异丙醇溶解，并稀释至刻度，作为母液；精密量取所述母液4ml，至50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成每1ml含12.86μg丙氨酸的对照品溶液；
精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％的乙醇10ml，精密称定重量，超声提取15min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇均，滤过，取续滤液1ml用70％乙醇定容于100ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液；
取供试品溶液和对照品溶液各2ml至10ml具塞刻度试管中，分别加入蒸馏水至2ml，加0.1ml新鲜配制的1％Vc溶液，3ml茚三酮醇溶液，混匀，在100℃水浴中加热15min，取出迅速冷至室温，加入60％乙醇至刻度，在570nm处测定吸光度，计算即得。
5.如权利要求1所述的美洲大蠊冻干粉质量控制方法，其特征在于，所述尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐进行含量测定方法为
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A，0.7％冰乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温30℃，流速0.7ml/min；
洗脱梯度为：
0-15min 100％的0.7％冰乙酸溶液-99％的0.7％冰乙酸溶液，
15-40min 99％的0.7％冰乙酸溶液-92％的0.7％冰乙酸溶液，
40-50min 92％的0.7％冰乙酸溶液-45％的0.7％冰乙酸溶液；
对照品溶液的制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品，精密称定，置量瓶中，加超纯水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黄嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取冻干粉0.2g，置具塞锥形瓶中，蒸馏水10ml，精密称定重量，超声提取10min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇均，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水定容至10ml量瓶中，0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算即得，冻干粉每克含尿嘧啶不得少于0.22％、次黄嘌呤不得少于0.77％、肌酐不得少于4.62％。
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