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CN106047836A - 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种植酸酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN106047836A CN201610421861.6A CN201610421861A CN106047836A CN 106047836 A CN106047836 A CN 106047836A CN 201610421861 A CN201610421861 A CN 201610421861A CN 106047836 A CN106047836 A CN 106047836A
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Kunming Qactive Biological Science & Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种植酸酶突变体及其制备方法和应用，植酸酶突变体的序列SEQ ID No：1，该突变体由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列发生改变而获得；本发明使用烟曲霉植酸酶的部分氨基酸序列来替代无花果曲霉植酸酶氨基酸序列，使其成为耐热性高的植酸酶；以无花果曲霉植酸酶基因序列作为模版，通过基因点突变技术使无花果植酸酶基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQ ID NO：2，该植酸酶基因的突变体与质粒PPIC9K等相连构建重复质粒，转化宿主GS115等获得基因工程菌株，通过基因工程菌株发酵，获得新的植酸酶突变体；能有较宽的pH作用范围和较理想耐热特性，适合耐高温制粒，较好地满足饲料工业的要求。

Description

一种植酸酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种植酸酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
植酸广泛存在于玉米、米糠、各种饼粕等饲料原料中，一方面它具有很强的抗营养作用，与饲料中金属离子和蛋白质结合，影响这些营养物质的消化与吸收；另一方面植酸分子含有大量有机磷，动物胃肠道由于缺少相应的酶，因而不能利用，这些有机磷随粪便排放到环境中，造成环境污染。植酸酶可使植酸发生水解反应，生成肌醇衍生物和正磷酸，作为单胃动物的饲料添加剂，可以促进动物对磷元素的利用，有助于畜禽生长，提高畜牧业效益，同时它还能降低植酸磷对环境的污染，并且可以提高饲料中能量与蛋白质的消化率。现在已成为饲料行业公认的有效饲料添加剂。植酸酶作为饲料添加剂在实际应用过程中需要耐受饲料高温制粒过程，因此饲用植酸酶必须耐热，而目前大多数植酸酶耐热性能较差。
无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)虽然酶比活相对高，也具有一定的耐热作用，但在实际应用上还不理想，如果能够将其耐热性增高，无花果植酸酶将具有更大的应用价值。相比之下，烟曲霉植酸酶有着更好的耐热性，但比活相对较低。因此，本发明根据烟曲霉植酸酶的序列中与其耐热性相关的氨基酸序列来改造无花果曲霉植酸酶，使其成为耐热性高的植酸酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植酸酶突变体及其应用，旨在解决无花果植酸酶的耐热性较差，在实际应用上不理想的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种植酸酶突变体，所述植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述植酸酶突变体由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID NO：3中第43位缬氨酸变成丝氨酸、第46位脯氨酸变为丝氨酸、第169位谷氨酰胺变为苏氨酸、第170位脯氨酸变为天冬酰胺、第171位甘氨酸变为精氨酸、第252位苏氨酸变为精氨酸、第255位缬氨酸变为天冬氨酸、第256位天冬氨酸变为丙氨酸、第258位赖氨酸变为谷氨酰胺而获得。
本发明的第二目的是提供一种植酸酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示。
本发明还提供一种替代权利要求1中植酸酶的无花果曲霉植酸酶序列，其特征在于，所述无花果曲霉植酸酶序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的第三目的是提供一种植酸酶突变体的制备方法，步骤包括：
(1)、无花果植酸酶基因连接到pMD19-T载体上的重组质粒为模板，设计引物进行突变PCR扩增；产物电泳检测，条带正确后加1μl DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；进而进行突变片段组装，配制10μl组装体系与50℃反应15min；
(2)、加入10μl突变组装后的产物于50μl DMT感受态细胞中，混匀，冰浴30min；42℃准确热激45s，立即置于冰上10min；加500μlLB培养基，200转、37℃培养1h；7000rpm离心3min，弃上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
(3)、每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉；
(4)设计连接引物，将突变后的植酸酶序列连接到酵母菌表达载体ppic9k上，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。
进一步的，步骤(1)中，所述突变PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸2.5min，共28个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。
进一步的，步骤(4)中，所述转换载体PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃扩增后延伸10min；
本发明的第四目的是提供一种植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用，特别适用水产饲料。
本发明的有益技术效果是：本发明提供的植酸酶突变体及其应用，通过分析具有更好的耐热性烟曲霉植酸酶分子结构特征，使用烟曲霉植酸酶的部分序列来替代无花果曲霉植酸酶氨基酸序列，无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQ ID NO：3中的氨基酸发生如下改变V43S,P46S,Q169T，P170N,G171R,T252R,V255D,D256A,K258Q。具体方案为以无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)作为模版，使无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQ ID NO：2，该突变后的基因除与PPIC9K构建重组质粒外，还可以与PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌(毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)，通过在平板上加入植酸钙或在平板中加入G418、Zeocin等抗生素，筛选获得植酸酶突变体基因工程菌，然后通过发酵获得新的植酸酶突变体。使其成为耐热性高的植酸酶，该植酸酶突变体在高温下，植酸酶的温度耐受情况如图5-7所示，无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在70℃耐受1h突变植酸酶相对酶活大约还有65％，而突变之前无花果植酸酶仅仅剩余35％，突变植酸酶耐受2h才降到半衰期以下。在80℃时突变后植酸酶相对酶活剩余一半时的时间大约为60min，而突变前耐受15min就达到半衰期了。高温90℃时耐受30min突变后植酸酶相对酶活还剩余接近55％，突变前仅仅剩余25％，总之突变后与突变前相比温度耐受相对提高了30％；同时植酸酶突变体较原无花果曲霉植酸酶具有更宽的作用pH，相对突变前无花果植酸酶，突变后的酶的最适pH提高了0.5个单位，并且在中性环境下pH＝7.0相对酶活剩余接近50％，与突变之前有改进。该突变体能在中性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别适合于作为水产饲料添加剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的植酸酶突变体的制备方法流程图；
图2是本发明实施例3提供的最适pH的测定曲线图；
图3是本发明实施例3提供的最适温度曲线图；
图4是本发明实施例3提供的pH耐受曲线图；
图5是本发明实施例3提供的70℃耐受曲线图；
图6是本发明实施例3提供的80℃耐受曲线图；
图7是本发明实施例3提供的90℃耐受曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、试验材料和试剂
菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli DMT感受态购于北京全式金生物技术有限公司，T载体pMD19-T,表达载体PPIC9K或PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PPINK Hc\Lc等及毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)(来源于INVITROGEN公司)。
2、酶类及其他生化试剂
DNA聚合酶,核酸酶内切酶和dNTP购自TaKaRa公司；植酸钠购自Sigma公司；FastMultiSite Mutagenesis System试剂盒购自TRANSGEN BIOTECH公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
LB培养基：Peptone10g，Yeast extract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH＝7。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
YEPD培养基：Peptone20g，Yeast extract10g，glucose20g(单灭)，加蒸馏水至1000ml，pH＝7。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
酵母发酵培养基FA和FB购自INVITROGEN公司。
实施例1
本发明通过计算机辅助手段比对替换了耐热性高的烟曲霉植酸酶序列的无花果曲霉植酸酶SEQ ID NO：4和无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID NO：3在分子动力学模拟过程中的氢键强弱作用，选取氢键作用加强的替换位点作为最终突变位点，即植酸酶突变体SEQ ID NO：1。具体实施方案为利用分子动力学模拟软件GROMACS，在标准大气压强下、100mM NaCl溶液体系分别模拟含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的蛋白结构在50℃和70℃下的运动状态50ns。利用g_hond模块计算替换位点与互作氨基酸的氢键作用，最后选取氢键作用相比于SEQ ID NO:3序列加强的替换位点作为最终突变位点。无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQ ID No：3中的氨基酸发生如下改变：第43位缬氨酸变成丝氨酸、第46位脯氨酸变为丝氨酸、第169位谷氨酰胺变为苏氨酸、第170位脯氨酸变为天冬酰胺、第171位甘氨酸变为精氨酸、第252位苏氨酸变为精氨酸、第255位缬氨酸变为天冬氨酸、第256位天冬氨酸变为丙氨酸、第258位赖氨酸变为谷氨酰胺(V43S,P46S,Q169T,P170N,G171R,T252R,V255D,D256A,K258Q)。
具体实施方案为以无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因为模板，通过基因的点突变方法，使无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQID No：2，将该突变基因与PPIC9K或PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PPINKHc\Lc相连构建重组质粒，转入毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行表达，发酵可以获得该植酸酶突变体。该突变体能在中性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别适合于水产饲料添加剂。
本发明植酸酶突变体的氨基酸序列SEQ ID No：1；突变后无花果曲霉植酸酶核苷酸序列SEQ ID No：2。
实施例2，如图1所示，一种植酸酶突变体的制备方法包括以下步骤：
S101：设计扩增引物F：-CTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R：-TAAGCAAAACACTCAGCCCAATC，无花果植酸酶连接到pMD19-T载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增，PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；
PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，66℃退火30s，72℃延伸3.5min，共28个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸3.5min，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。
S102：取10μl PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确后加1μl DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；进而进行突变片段组装，配制10μl组装体系与50℃反应15min。
S103：转化
①加入10μl突变组装后的产物于50μl DMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混匀，冰浴30min；
②42℃准确热激45s，立即置于冰上10min；
③加500μlLB培养基，200转，37℃培养1h；
④7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜。
S104：验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉。
突变1位点引物为：
1-F1：AATCGTCCATCTCCTCTGAGGTGCCAGCCGGATG
1-R1：AGAGGAGATGGACGATTCGTTTGCCAGAGAGAAG
突变2位点引物为：
2-F1：TGAAGGATCCTCGTGCCACGCCCGGCCAATCGTCGCCAA
2-R1：CCGTTCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCT
2-F2：AAGGATCCTCGTGCCCAGAACGGCCAATCGTCGCCA
2-R2：ATTGTCTGGGCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTG
2-F3：ATCCTCGTGCCCAGCCCAGACAATCGTCGCCAAAGATCG
2-R3：GGGCGTGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCTCTG
突变3位点引物为：
3-F1：CCTTCGACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGACACCAAGC
3-R1：GGTGGCGTCGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAGC
3-F2：ATCTCCACCAGCACCGACGCCACCAAGCTGTCCCCTTTC
3-R2：GCTGGGTGTCGACGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAA
3-F3：CAGCACCGTCGACACCCAGCTGTCCCCTTTCTGTGAC
3-R3：GCTTCTGGAGATGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG
设计连接引物(F：-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R：-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTAAGCAAAACACTCAGCCCAATC)，将突变后的植酸酶序列连接到酵母菌表达载体ppic9k上，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115来源于INVITROGEN公司表达，发酵测酶活。
转换载体PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30S，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃扩增后延伸10min；
其它毕赤酵母表达载体构建及毕赤酵母转化、筛选与发酵按相应的毕赤酵母载体与宿主菌株说明书(来源于INVITROGEN公司)进行。
实施例3植酸酶活力测定
3.1、仪器与设备
恒温水浴锅、紫外分光光度计、恒温培养振荡器、pH仪比色皿等。
3.2、实验材料
3.2.1、酶液
突变植酸酶菌株发酵酶液(突变)、原模板植酸酶菌株发酵酶液(无花果)
3.2.2、溶液配制
3.2.2.1、缓冲液：具体参见2002年黄培德译分子克隆实验指南第三版
0.25mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH＝1.5-3.0)
0.25mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝3.5-6.5)
0.25mol/L Tris-Hcl缓冲液(pH＝7.0-9.0)
3.2.2.2、底物溶液：5mmol/L植酸钠溶液
称取0.495g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，用缓冲液定容至100ml，现用现配。配好后不要使底物溶液受热，否则将影响测试结果。
3.2.2.3、100g/L钼酸铵溶液
取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7024·4H2O]于100ml容量瓶中，加入1ml氨水(25％)，用双蒸水定容至100ml。
3.2.2.4、硝酸溶液
将浓硝酸与双蒸水以1:2的比率配制
3.2.2.5、2.35g/L偏钒酸铵溶液
取0.235g偏钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(3..2.2.4)，用双蒸水定容至100ml。避光下可以保存一周。
3.2.2.6、颜色终止液配制
将钼酸铵溶液(3.2.2.3)、偏钒酸铵溶液(3.2.2.5)与硝酸溶液(3.2.2.4)以1:1:2的比率配制到相应的用量，要缓慢加入硝酸溶液，终止液中不要有白色沉淀。注意终止液现用现配。
酶活定义：
酶活定义为：样品在温度为37℃、pH＝5.5条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个酶活性单位，以U表示(GB/T 18634-2009)。
酶活测定方法：取10mL试管，加入1.8mL缓冲液(3.2.2.1)，加入0.2ml待测酶液，混合后预热5min，依次加入底物(3.2.2.2)，加入底物时间间隔一致，混合后反应30min，之后依次加入终止液(3.2.2.6)，加入时间间隔和加入底物的时间间隔一致，混合后，冷却10min在415nm波长下测定吸光值。如果有沉淀应先离心再测吸光值。对照组为先加入终止液后冷却至室温再加入底物溶液。实验为一个对照组，三个平行试验。
(1)植酸酶pH适性和温度适性的测定
①植酸酶pH最适性测定
将缓冲液(3.2.2.1)调成不同pH：2、3、4、5、6、7、8，9甘氨酸-盐酸(1.5-3.0)乙酸-乙酸钠(3.5-6.5)Tris-Hcl(7.0-9.0)不同pH的缓冲液溶解底物成不同pH，将酶液稀释到合适的倍数，依照上述的试验方法在37℃测出最适pH，之后在最大值两侧补半点继续检测最适pH值(例如最适pH＝5，则再取pH＝4、4.5、5、5.5和6按照上述的方法检测)。
②植酸酶温度最适性的测定
依照上述的方法测定，在上述pH的条件下，将反应物放在不同温度下反应：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，测出最适温度后，在最大值两侧补半点(例如最适温度是40℃，则补充30℃、35℃、40℃、45℃、50℃按照上述方法检测)。
③植酸酶pH耐受测定
将缓冲液(3.2.2.1)调节到不同pH：2、3、4、5、6、7、8，用这些不同pH的缓冲液稀释酶液，从放入酶液之时开始计时，稀释好的酶液放入37℃水浴锅中耐受1小时放在冰上，之后立马按照上述的方法在最适pH和最适温度下进行反应。对照组的酶液是未耐受过的酶液。
④植酸酶温度耐受测定
将酶液稀释到相应倍数，然后放入不同温度：70℃、80℃、90℃耐受1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、60min、90min、120min、150min。之后按照上述方法在最适pH和最适温度下反应。对照实验组酶液是未温度耐受过的酶液。
(2)结果与分析
①无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因突变，按上实验方法进行突变后送华大基因公司测序，结果如SEQ ID NO：2，对应植酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1，转化的酵母菌株具有植酸酶活性，选取一株发酵酶活性单位高的菌株进行发酵获得酶液进行酶学性质测定。
②植酸酶最适pH测定
植酸酶酶促反应最适pH值结果如图2所示。突变体与无花果植酸酶最适pH分别为6.0、5.5；并且在2.5都有一个峰值，相对突变前无花果植酸酶，突变后的酶的最适pH提高了0.5个单位，并且在中性环境下pH＝7.0剩余接近50％左右相对酶活，与突变之前有改进。
③植酸酶最适温度测定
植酸酶酶促反应最适温度值如图3所示，突变和无花果植酸酶最适温度为50℃；突变前后二者差异不明显。
④植酸酶酶促反应中pH耐受
由图4可知，两种植酸酶的pH耐受曲线趋势是相同的，在pH＝2-9之间37℃耐受1h相对酶活并没有太大变化，基本维持在60％以上。
⑤植酸酶温度耐受
高温下植酸酶的温度耐受情况如图5-7所示，随着温度的升高，相对酶活不断降低，随着时间的增加，相对酶活也逐渐降低。无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在70℃耐受1h突变植酸酶相对酶活大约还有65％，而突变之前无花果植酸酶仅仅剩余35％，突变植酸酶耐受2h才降到半衰期以下。在80℃时突变后植酸酶相对酶活剩余一半时的时间大约为60min，而突变前耐受15min就达到半衰期了。高温90℃时耐受30min突变后植酸酶相对酶活还剩余接近55％，突变前仅仅剩余25％，总之突变后与突变前相比温度耐受相对提高了30％。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID No：3中第43位缬氨酸变成丝氨酸、第46位脯氨酸变为丝氨酸、第169位谷氨酰胺变为苏氨酸、第170位脯氨酸变为天冬酰胺、第171位甘氨酸变为精氨酸、第252位苏氨酸变为精氨酸、第255位缬氨酸变为天冬氨酸、第256位天冬氨酸变为丙氨酸、第258位赖氨酸变为谷氨酰胺而获得。
3.编码权利要求1所述植酸酶突变体的编码基因，其特征在于，所基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
4.根据权利要求1所述植酸酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)、无花果植酸酶基因连接到pMD19-T载体上的重组质粒为模板，设计引物进行突变PCR扩增；产物电泳检测，条带正确后加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；进而进行突变片段组装，配制10μl组装体系与50℃反应15min；
(2)、加入10μl突变组装后的产物于50μl DMT感受态细胞中，混匀，冰浴30min；42℃准确热激45s，立即置于冰上10min；加500μlLB培养基，200转、37℃培养1h；7000rpm离心3min，弃上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
(3)、每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对， 找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉；
(4)设计连接引物，将突变后的植酸酶序列连接到酵母菌表达载体ppic9k上，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。
5.根据权利要求4所述植酸酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述突变PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸2.5min，共28个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。
6.根据权利要求4所述植酸酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述转换载体PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃扩增后延伸10min 。
7.根据权利要求1所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述植酸酶突变体在水产饲料添加剂中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017215218A1 (zh) * 2016-06-15 2017-12-21 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用
WO2018130212A3 (zh) * 2017-01-15 2018-08-30 中国农业科学院饲料研究所 胃蛋白抗性改良和催化效率提高的植酸酶YkAPPA突变体
CN110724676A (zh) * 2019-10-21 2020-01-24 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种植酸酶突变体及其载体与应用
CN113717959A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717958A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 比活力提高的植酸酶突变体
CN114736886A (zh) * 2022-04-24 2022-07-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法
CN116555219A (zh) * 2023-03-14 2023-08-08 江西省科学院微生物研究所(江西省流域生态研究所) 一种热稳定性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807087B (zh) * 2022-06-28 2022-09-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016078168A1 (zh) * 2014-11-21 2016-05-26 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144072B (zh) * 2006-09-13 2012-05-02 广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司 定点突变改造的植酸酶
CN102002487B (zh) * 2010-11-03 2014-04-30 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种优化改良的耐高温植酸酶phyth及其基因和应用
CN105441406A (zh) * 2014-08-05 2016-03-30 北京大学 植酸酶变体
CN105567656A (zh) * 2016-01-04 2016-05-11 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其应用
CN106047836B (zh) * 2016-06-15 2020-01-21 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016078168A1 (zh) * 2014-11-21 2016-05-26 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017215218A1 (zh) * 2016-06-15 2017-12-21 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用
WO2018130212A3 (zh) * 2017-01-15 2018-08-30 中国农业科学院饲料研究所 胃蛋白抗性改良和催化效率提高的植酸酶YkAPPA突变体
CN110724676A (zh) * 2019-10-21 2020-01-24 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种植酸酶突变体及其载体与应用
CN110724676B (zh) * 2019-10-21 2021-09-07 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种植酸酶突变体及其载体与应用
CN113717959A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717958A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 比活力提高的植酸酶突变体
CN113717959B (zh) * 2020-05-22 2024-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717958B (zh) * 2020-05-22 2024-04-12 青岛蔚蓝生物集团有限公司 比活力提高的植酸酶突变体
CN114736886A (zh) * 2022-04-24 2022-07-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法
CN114736886B (zh) * 2022-04-24 2023-12-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法
CN116555219A (zh) * 2023-03-14 2023-08-08 江西省科学院微生物研究所(江西省流域生态研究所) 一种热稳定性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用
CN116555219B (zh) * 2023-03-14 2023-12-08 江西省科学院微生物研究所(江西省流域生态研究所) 一种热稳定性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用

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