CN106029899B

CN106029899B - 确定染色体预定区域中snp信息的方法、系统和计算机可读介质

Info

Publication number: CN106029899B
Application number: CN201380079613.2A
Authority: CN
Inventors: 李剑; 张现东; 李金良; 刘赛军; 叶敏兰
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN105555970A; WO2015043278A1; CN105555970B; CN106029899A; HK1221745A1; WO2015042980A1

Abstract

本发明提供了一种确定染色体预定区域中的SNP信息的方法、系统和计算机可读介质。其中，确定染色体预定区域中的SNP信息的方法包括：针对染色体的至少一部分，构建测序文库；利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息。

Description

确定染色体预定区域中SNP信息的方法、系统和计算机可读介质

优先权信息

无

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及确定染色体预定区域中SNP信息的方法、系统和计算机可读介质。

背景技术

世界卫生组织2012全球出生缺陷防治报告显示，全球出生缺陷总发生率为3％，每年有320万出生缺陷患儿出生，其中27万新生儿因出生缺陷而死亡。研究表明，绝大部分出生缺陷与遗传因素有关，染色体异常与单基因遗传病是两个重要原因。其中，单基因遗传病种类众多，发病率各有不同，且这些疾病绝大多数无法治愈，给整个社会和家庭带来沉重的经济和心理负担。因此防止单基因遗传病患儿的发生和减少遗传病患儿的出生是遗传性出生缺陷防控的重点。胚胎植入前诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)技术可从根源上阻断遗传病的发生和传递，将出生缺陷的预防提前到胚胎阶段。然而，单基因遗传病的植入前诊断并未广泛应用，至今为止世界上才几千例报道。究其原因，主要是由于标本量少(仅1～2个细胞)，容易产生等位基因脱扣(ADO)和污染，检测较为困难，现有的检测技术无法完全满足单基因遗传病植入前诊断的临床需求。

胚胎植入前单体型分析是目前植入前单基因病检测的主要方法。该方法通过检测突变位点和多个与其连锁的STR(或SNP)来确定突变连锁单体型，降低了等位基因扩增不平、ADO及污染的影响。多重荧光PCR技术(MF-PCR)是基于该方法最常用的技术。由于多重PCR技术具备荧光PCR高灵敏的特点，同时又结合了多个连锁STR进行突变位点的单体型分析，一度被认为是植入前单基因病诊断的金标准。但是该方法使用的连锁标记太少，具体到个别临床案例时，甚至会出现没有连锁标记可用的情况。所以在每次临床检测前，都需要进行预试验来为患者寻找和选择合适的分子标记。另外，MF-PCR使用的连锁标记通常离致病位点比较远，会因为染色体重组事件而带有一定的误诊风险。

SNP-array是在全基因组区域对SNP位点进行检查分析，SNP密度高，数量多。该方法的优点是几乎适用于所有样本的单体型分析，不需要预试验为个别样本选择分子标记。另外，该芯片可以同时检测多种疾病。但是该芯片只能通过单体型分析的方法进行间接检测，而不能对致病位点进行直接检测。

因而，目前确定染色体尤其是胚胎染色体预定区域中的SNP信息的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明旨在提出一种能够有效地确定染色体尤其是胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：针对染色体的至少一部分，构建测序文库；利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息。利用本发明的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，能够高效准确地确定染色体预定区域中的SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。

在本发明的另一方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：获取所述胚胎的全基因组；以及针对所述胚胎的全基因组，根据前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息。利用本发明的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法，能够有效、准确地确定胚胎染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胚胎的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

在本发明的再一方面，本发明还提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的设备。根据本发明的实施例，该设备包括：文库构建装置，所述文库构建装置适于针对染色体的至少一部分，构建测序文库；文库筛选装置，所述文库筛选装置与所述文库构建装置相连，并且适于利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；测序装置，所述测序装置与所述文库筛选装置相连，适于对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，并且适于基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息。利用本发明的该设备，能够有效地实施本发明上述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，从而能够高效、准确地确定染色体预定区域中SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。

在本发明的又一方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：第一全基因组获取设备，所述第一全基因组获取设备适于获取所述胚胎的全基因组；以及SNP信息确定设备，所述SNP信息确定设备与所述第一全基因组获取设备相连，用于确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息，其中，所述SNP信息确定设备为前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的设备。利用本发明的该系统，能够高效地实施前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，从而有效确定染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胎儿的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

在本发明的另一个方面，本发明还提出了一种计算机可读介质。根据本发明的实施例，所述计算机可读介质上存储有指令，所述指令适于被处理器执行以便基于测序结果，确定染色体预定区域中的SNP信息，其中，所述测序结果是通过下列步骤获得的：针对染色体的至少一部分，构建测序文库；利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；以及对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用本发明的计算机可读介质，能够有效地确定染色体预定区域中的SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。其中，当所述染色体的至少一部分为胚胎的全基因组时，所述计算机可读介质存储的指令适于被处理器执行以便针对所述胚胎的全基因组，确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息。

在本发明的再一个方面，本发明还提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的设备。根据本发明的实施例，该设备包括：测序装置；以及前面所述的存储有适于被处理器执行的指令以便基于测序结果确定染色体预定区域中的SNP信息计算机可读介质。利用本发明的该设备能够准确有效地确定染色体预定区域中SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。

在本发明的又一个方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：测序装置；以及前面所述的存储有适于被处理器执行的指令以便针对胚胎的全基因组确定胎儿染色体预定区域中的SNP信息的计算机可读介质。利用本发明的该系统能够准确有效地确定胚胎染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胚胎的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

需要说明的是，本发明提供的上述基于高通量目标区域捕获测序技术的确定染色体预定区域中SNP信息的手段，相对于现有技术，至少具有以下优势：

1、本发明通过单体型分析的方法不仅能对目标位点进行间接检测，还能够对目标位点进行直接检测。

2、本发明选择的SNP位点集中在目标基因1M范围内，密度高、连锁紧密，既可以大大提高目标区域SNP信息检测的灵敏度和准确性，又可降低检测成本。

3、本发明将多个目标检测位点集中于一张芯片上，从能够基于获得的SNP信息同时对多种疾病的多种突变进行检测，无需因人而异设计实验方案，既缩短了检测周期，又降低了检测成本。

4、本发明采用包含多个目标检测位点的芯片可以同时检测多个样本，检测通量极大提高。这为未来PGD的规模化应用提供巨大技术支持。

5、本发明的方法，除了能够用于单基因遗传病检测，还能够同时进行HLA分型、非整倍体检测，实现了单个样本的多项检测，可为相关IVF病人提供个性化服务。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的胚胎单体型分析流程图；

图2显示了根据本发明一个实施例，确定区分型SNPs方法的示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例，构建的文库的2100检测结果；

图4显示了根据本发明一个实施例的单体型构建模拟图；

图5显示了根据本发明一个实施例的胚胎单体型与胚胎遗传状况分析的流程示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的确定染色体预定区域中SNP信息的方法的流程示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法的流程示意图；

图8显示了根据本发明一个实施例的确定染色体预定区域SNP信息的设备的结构示意图；以及

图9显示了根据本发明一个实施例的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统的结构示意图。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

方法

在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的方法。根据本发明的实施例，参照图6，该方法包括：

针对染色体的至少一部分，构建测序文库

根据本发明的实施例，所述染色体的至少一部分是通过全基因组扩增获得的胚胎细胞全基因组。根据本发明的实施例，全基因组扩增的实施方法不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，全基因组扩增是通过选自PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA和MDA的至少之一进行的。由此，能够将少量的胚胎细胞进行有效扩增，从而获得较多的胚胎细胞全基因组样品。

利用探针对所述测序文库进行筛选，以便获得目标捕获片段

根据本发明的实施例，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点。根据本发明的实施例，所述预定区域包括目标基因区域和SNP-marker区域。根据本发明的实施例，所述目标基因区域包括与所述目标疾病相关基因的外显子和外显子毗邻区的至少一部分。其中，所述外显子毗邻区包括外显子5’端上游50bp的区域和所述外显子下游50bp的区域；所述SNP-marker区域包括所述目标基因上下游1M的范围。由此，在筛选过程中能够有效降低基因重组的影响，甚至能够将目标基因区与SNP-marker区域的重组的概率降低到万分之一，从而能够确保后续检测的准确性。

根据本发明的实施例，所述探针的长度为20～200nt，优选情况下，所述探针的长度为60～80nt。由此，能够有效提高目标SNP的捕获效率。根据本发明的一个实施例，所述探针是以芯片的形式提供的。由此，利用能够包含多个目标检测位点的芯片，能够同时对多种疾病多种突变进行检测，无需因人而异设计实验方案，既缩短了检测周期，又降低了检测成本；并且利用芯片可以同时检测多个样本，检测通量极大提高。

对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果

根据本发明的实施例，利用选自Illumina Hiseq2000，Genome Analyzer，Miseq测序系列，Life technologies的SOLiD测序系统，Ion Torrent测序系统和罗氏的454测序系统的至少之一进行所述测序。由此，能够有效提高测序的效率和通量。

基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息

根据本发明的实施例，基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息进一步包括：将所述测序结果与参考序列进行比对，以便获得唯一比对序列；以及利用SNP分析软件从所述唯一比对序列获取所述预定区域中的SNP信息。其中，根据本发明的实施例，所述比对是利用BWA软件包进行的。由此，能够快速准确地实现比对。根据本发明的实施例，在获得唯一比对序列后，进一步包括从所述唯一比对序列去除PCR重复扩展的序列。由此，有利于后续的SNP分析。根据本发明的实施例，可以采用的SNP分析软件的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述SNP分析软件为选自SAMtools和GATK的至少之一。由此，能够快速准确地进行SNP分析。

根据本发明的实施例，进一步包括对所获得的SNP信息进行过滤。其中，根据本发明的一些实施例，所述过滤的条件为去除满足下列条件之一的SNP：SNP测序深度低于10×，优选低于20×；以及杂合SNP中两种碱基测序深度差异高于20％，优选高于10％，更优选高于5％。由此，经过过滤的SNP信息准确可信。需要说明的是，理论上测序深度越高，杂合SNP测序深度比值越接近1：1，且SNP过滤条件中的测序深度、测序深度差异度的具体数值的设定与实施时的样本、测序深度、测序质量相关，可根据实际需要调整。在本发明的一个实施例中胚胎遗传相关个体的测序深度为50×、胚胎样本的测序深度为100×且测序质量较好，为使留下的都是测序准确符合实际的SNP，严格过滤，过滤掉低于10×的SNP，也过滤掉测序深度差异高于10％的杂合SNP，去除了大量的杂合SNP；可以理解的，采用更高深度测序(>100×)，若也要严格过滤保证剩余SNP的真实准确，可过滤掉如低于20×的SNP，过滤掉如差异高于5％的杂合SNP，相反的，对于相对低深度测序的数据，可设置过滤掉高于20％的杂合SNP。

发明人发现，利用本发明的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，能够高效准确地确定染色体预定区域中的SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。

在本发明的另一方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：获取所述胚胎的全基因组；以及针对所述胚胎的全基因组，根据前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息。

根据本发明的另一些实施例，参照图7，本发明的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法具体包括以下步骤：获取所述胚胎的全基因组；针对所述胚胎的全基因组，构建测序文库；利用探针对所述测序文库进行筛选，以便获得目标捕获片段；对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息。利用本发明的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法，能够有效、准确地确定胚胎染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胎儿的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

根据本发明的实施例，所述胚胎的全基因组是通过对胚胎细胞进行全基因组扩增而获得的。其中，根据本发明的实施例，全基因组扩增的具体实施方法不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，全基因组扩增是通过选自PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA和MDA的至少之一进行的。由此，能够将少量的胚胎细胞进行有效扩增，从而获得较多的胚胎细胞全基因组样品。

根据本发明的实施例，本发明的确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法进一步包括：

首先，获取胚胎遗传相关个体的全基因组，其中，所述胚胎遗传相关个体包括所述胚胎的父亲、母亲和先证者。需要说明的是，这里所使用的术语“先证者”指确诊为遗传了该致病基因，并表现出该疾病症状的患者，且其是与前述胚胎具有遗传关系的生物体，既可以是胚胎或者胎儿，也可以是出生后的个体。

其次，基于所述胚胎遗传相关个体的全基因组，分别确定所述父亲的SNP信息，所述母亲的SNP信息以及所述先证者的SNP信息。

接着，基于所述父亲的SNP信息和所述母亲的SNP信息，确定区分型SNP。需要说明的是，在这里所使用的术语“区分型SNP”指的是可以有效区分父母单体型的碱基，即在某一位置父母双方4个碱基中其中一碱基(常染色体)与该位置的其他碱基都不相同，该碱基可以确定父母双方4条单体型中的唯一一条，如某位置父母基因型分别为AA、AG，则G碱基为区分型SNP，因为在该位置G可以确定唯一的一个单体型，而A在其他3个单体型中都存在，无法确定唯一单体型。其中图2显示了根据孟德尔遗传原理，确定父母区分型SNPs位点方法的示意图。

接下来，基于所述区分型SNP和所述先证者的SNP信息，确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型。也即：基于所述区分型SNP和所述先证者SNP，分别针对父亲和母亲基因组中与所述预定区域对应的两条染色体，分别构建第一父亲单体型、第二父亲单体型、第一母亲单体型和第二母亲单体型，以便用于后续胚胎单体型的确定。其中，所述父亲SNP单体型包括第一父亲单体型和第二父亲单体型，所述母亲SNP单体型包括第一母亲单体型和第二母亲单体型，所述第一父亲单体型、第二父亲单体型、第一母亲单体型和第二母亲单体型是由所述区分型SNP构成的。根据本发明的实施例，可以根据孟德尔遗传原理与连锁交换定律，结合父母区分型SNP位点和先证者SNPs信息构建出父母SNP-单体型，构建原理如图4所示。所述SNP-单体型完全由区分型SNP位置碱基组成，每条单体型都含有众多区分型SNP，单体型中的区分型SNP能够与其他单体型相区分。如某一位置父母基因型分别为AA、AG，G为区分型SNP，A为非区分型SNP，A、G分别为单体型中该处的碱基。由于先证者的2条单体型，分别遗传自父母，可根据疾病情况确定致病突变所在的单体型。如显性遗传病，父亲患病，母亲正常，则先证者所遗传自父亲的单体型为致病突变所在的单体型；如隐性遗传病，父母都是携带者，则先证者(患病)的两个单体型都为致病突变所在的单体型。由此，基于区分型SNP和先证者的SNP信息，能够有效确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，进而基于胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，能够有效确定所述胚胎的SNP单体型。

然后，基于所述胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，确定所述父亲SNP单体型和母亲SNP单体型的组合方式，以便获得所述胚胎的SNP单体型。即基于所述胚胎的SNP信息与前述的第一父亲单体型、第二父亲单体型、第一母亲单体型和第二母亲单体型，确定所述胎儿染色体预定区域中的SNP类型，进而确定所述胚胎的SNP单体型。根据本发明的实施例，所述胚胎的SNP单体型是通过下列步骤获得的：确定胚胎的SNP信息显著支持的父亲单体型作为胚胎的父本来源单体型；以及确定胚胎的SNP信息显著支持的母亲单体型作为胚胎的母本来源单体型。其中，根据本发明的实施例，所述区分型SNP数不低于10个是显著支持的指示。具体地，由于胚胎的2个单体型分别遗传自父母各一条，可以根据胚胎SNPs信息结合父母SNP-单体型进行分析，判断胚胎SNPs是哪两条单体型的组合，分析原理如图4所示。分析中可采用区分型SNP数目统计计算，根据数值的大小确定胚胎单体型，具体流程如图5所示。根据本发明的实施例，一单体型区分型SNP数大于10，则可确定该单体型为胚胎其中一条单体型；如一单体型区分型SNP数小于4，则可判断该单体型为SNP错误导致。根据本发明一些具体示例，为确保准确，将一正确单体型的SNP支持数定于为不低于10个，错误单体型SNP支持数不高于3个，这是因为前面设定的SNP过滤条件较为严格，即单体型构建中所用SNP正确率较高，并且候选SNP数量大，实际测试数据表明正确单体型的SNP支持数远高于10个，错误单体型SNP支持数一般为0。根据本发明的一些实施例，经验证，对于一常染色体疾病，通过本发明的方法分析，每个胚胎只能得到2个满足要求的单体型；对于一X染色体疾病，通过本发明的方法分析，可得到一个(男胎)或两个(女胎)满足要求的单体型。

由此，能够准确有效地确定胚胎的SNP单体型，进而能够有效确定所述胚胎的遗传状态。即利用该方法能够有效地根据模拟构建的父母单体型，确定胚胎是否遗传父母的致病单体型，从而判断胚胎的遗传状态是正常、携带或致病。

设备和系统

在本发明的再一方面，本发明还提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的设备。根据本发明的实施例，参照图8，该设备1000包括：文库构建装置100、文库筛选装置200、测序装置300和分析装置400。根据本发明的实施例，文库构建装置100适于针对染色体的至少一部分，构建测序文库；文库筛选装置200与所述文库构建装置100相连，并且适于利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含所述SNP位点；测序装置300与所述文库筛选装置200相连，适于对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；分析装置400与所述测序装置300相连，并且适于基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息。利用本发明的该设备1000，能够有效地实施本发明上述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，从而能够高效准确地确定染色体预定区域中的SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。

根据本发明的实施例，所述预定区域包括目标基因区域和SNP-marker区域。根据本发明的实施例，所述目标基因区域包括与所述目标疾病相关基因的外显子和外显子毗邻区的至少一部分。根据本发明的实施例，所述外显子毗邻区包括外显子5’端上游50bp的区域和所述外显子下游50bp的区域；所述SNP-marker区域包括所述目标基因上下游1M的范围。

根据本发明的实施例，所述探针的长度为20～200nt，优选情况下，所述探针的长度为60～80nt。根据本发明的一个实施例，所述探针是以芯片的形式提供的。

根据本发明的实施例，进一步包括染色体制备装置(图中未示出)，所述染色体制备装置与所述文库构建装置100相连，并且适用于通过全基因组扩增获得胚胎细胞全基因组，所述胚胎细胞全基因组构成所述染色体的至少一部分。根据本发明的实施例，所述染色体制备装置适于通过选自PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA和MDA的至少之一进行所述全基因组扩增。

根据本发明的实施例，进一步包括DNA提取装置(图中未示出)，所述DNA提取装置与所述文库构建装置100相连，并且适于通过对生物体的外周血进行DNA提取，以便获得所述染色体的至少一部分。

根据本发明的实施例，所述测序装置300为选自Illumina Hiseq2000，GenomeAnalyzer，Miseq测序系列，Life technologies的SOLiD测序系统，Ion Torrent测序系统和罗氏的454测序系统的至少之一。

根据本发明的实施例，所述分析装置400进一步包括：比对单元，所述比对单元适于将所述测序结果与参考序列进行比对，以便获得唯一比对序列；以及SNP信息获取单元，所述SNP信息获取单元与所述比对单元相连，并且适于利用SNP分析软件从所述唯一比对序列获取所述预定区域中的SNP信息。根据本发明的实施例，所述比对单元适于利用BWA软件包进行所述比对。根据本发明的实施例，所述分析装置进一步包括适于从所述唯一比对序列去除PCR重复扩展的序列的单元。根据本发明的实施例，所述SNP分析软件为选自SAMtools和GATK的至少之一。

根据本发明的实施例，所述分析装置400进一步包括适于对所获得的SNP信息进行过滤的单元。根据本发明的实施例，所述过滤的条件为去除满足下列条件之一的SNP：SNP测序深度低于10×，优选低于20×；以及杂合SNP中两种碱基测序深度差异高于20％，优选高于10％，更优选高于5％。

需要说明的是，所述设备的各个装置可以实现本发明确定染色体预定区域SNP信息方法中的相应步骤，前面对确定染色体预定区域中SNP信息的方法的优点和效果的描述同样适用于该设备，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统。根据本发明的实施例，参照图9，该系统10000包括：第一全基因组获取设备2000，以及SNP信息确定设备1000，所述第一全基因组获取设备2000适于获取所述胚胎的全基因组；所述SNP信息确定设备1000与所述第一全基因组获取设备相连，用于确定所述胎儿染色体预定区域中的SNP信息，其中，所述SNP信息确定设备1000为前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的设备1000。利用本发明的该系统10000，能够高效地实施前面所述的确定染色体预定区域中SNP信息的方法，从而能够有效、准确地确定胚胎染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胎儿的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

根据本发明的实施例，所述第一全基因组获取设备2000适于通过对胚胎细胞进行全基因组扩增而获得所述胚胎的全基因组。其中，根据本发明的实施例，所述第一全基因组获取设备2000适于利用选自PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA和MDA的至少之一获得所述胚胎的全基因组。

根据本发明的实施例，所述系统10000进一步包括：第二全基因组获取设备(图中未示出)，所述第二全基因组获取设备适于获取胚胎遗传相关个体的全基因组，其中，所述胚胎遗传相关个体包括所述胚胎的父亲、母亲和先证者；区分型SNP确定设备(图中未示出)，所述区分型确定设备适于基于所述父亲的SNP信息和所述母亲的SNP信息，确定区分型SNP；第一单体型确定设备(图中未示出)，所述第一单体型确定设备适于基于所述区分型SNP和所述先证者的SNP信息，确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型；以及第二单体型确定设备(图中未示出)，所述第二单体型确定设备适于基于所述胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，确定所述父亲SNP单体型和母亲SNP单体型的重组合方式，以便获得所述胚胎的SNP单体型。

根据本发明的实施例，所述第二单体型确定设备进一步包括：确定胚胎的SNP信息显著支持的父亲单体型作为胚胎的父本来源单体型的单元；以及确定胚胎的SNP信息显著支持的母亲单体型作为胚胎的母本来源单体型的单元。根据本发明的实施例，所述区分型SNP数不低于10个是显著支持的指示。

需要说明的是，上述系统所包含的各个设备可以实现本发明确定染色体预定区域SNP信息方法中的相应步骤，前面对确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的方法的优点和效果的描述同样适用于该系统，在此不再赘述。

计算机可读介质

在本发明的另一个方面，本发明还提出了一种计算机可读介质。根据本发明的实施例，所述计算机可读介质上存储有指令，所述指令适于被处理器执行以便基于测序结果，确定染色体预定区域中的SNP信息，可以理解，在执行该程序时，通过指令相关硬件可完成确定染色体包括胚胎染色体预定区域SNP信息方法的全部或部分步骤，所述计算机可读介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。其中，所述测序结果是通过下列步骤获得的：针对染色体的至少一部分，构建测序文库；利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；以及对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果。

根据本发明的实施例，所述预定区域包括目标基因区域和SNP-marker区域。根据本发明的实施例，所述目标基因区域包括与所述目标疾病相关基因的外显子和外显子毗邻区的至少一部分。根据本发明的实施例，所述外显子毗邻区包括所述外显子上下游50bp的范围；所述SNP-marker区域包括所述目标基因上下游1M的范围。

根据本发明的实施例，所述染色体的至少一部分是通过全基因组扩增获得的胚胎细胞全基因组。根据本发明的实施例，全基因组扩增是通过PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlexWGA和MDA的至少之一进行的。

根据本发明的实施例，所述染色体的至少一部分是通过对生物体的外周血进行DNA提取而获得的。

根据本发明的实施例，利用Illumina Hiseq2000，Genome Analyzer，Miseq测序系列，Life technologies的SOLiD测序系统，Ion Torrent测序系统，罗氏的454测序系统进行所述测序。

根据本发明的实施例，基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息进一步包括：将所述测序结果与参考序列进行比对，以便获得唯一比对序列；以及利用SNP分析软件从所述唯一比对序列获取所述预定区域中的SNP信息。根据本发明的实施例，所述比对是利用BWA软件包进行的。根据本发明的实施例，在获得唯一比对序列后，进一步包括从所述唯一比对序列去除PCR重复扩展的序列。根据本发明的实施例，所述SNP分析软件为选自SAMtools和GATK的至少之一。根据本发明的实施例，进一步包括对所获得的SNP信息进行过滤。根据本发明的实施例，所述过滤的条件为去除满足下列条件之一的SNP：SNP测序深度低于10×，优选低于20×；以及杂合SNP中两种碱基测序深度差异高于20％，优选高于10％，更优选高于5％。需要说明的是，理论上测序深度越高，杂合SNP测序深度比值越接近1：1，且SNP过滤条件中的测序深度、测序深度差异度的具体数值的设定与实施时的样本、测序深度、测序质量相关，可根据实际需要调整。在本发明的一个实施例中胚胎遗传相关个体的测序深度为50×、胚胎样本的测序深度为100×且测序质量较好，为使留下的都是测序准确符合实际的SNP，严格过滤，过滤掉低于10×的SNP，也过滤掉测序深度差异高于10％的杂合SNP，去除了大量的杂合SNP；可以理解的，采用更高深度测序(>100×)，若也要严格过滤保证剩余SNP的真实准确，可过滤掉如低于20×的SNP，过滤掉如差异高于5％的杂合SNP，相反的，对于相对低深度测序的数据，可设置过滤掉高于20％的杂合SNP。

根据本发明的实施例，所述染色体的至少一部分为胚胎的全基因组，以便针对所述胎儿的全基因组，确定所述胎儿染色体预定区域中的SNP信息。

由此，根据本发明的实施例，所述指令进一步适于被处理器执行以便：获取胚胎遗传相关个体的全基因组，其中，所述胚胎遗传相关个体包括所述胚胎的父亲、母亲和先证者；以及基于所述胚胎遗传相关个体的全基因组，分别确定所述父亲的SNP信息，所述母亲的SNP信息以及所述先证者的SNP信息；基于所述父亲的SNP信息和所述母亲的SNP信息，确定区分型SNP；基于所述区分型SNP和所述先证者的SNP信息，确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型；以及基于所述胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，确定所述父亲SNP单体型和母亲SNP单体型的组合方式，以便获得所述胚胎的SNP单体型。其中，根据本发明的实施例，所述胚胎的SNP单体型是通过下列步骤获得的：确定胚胎的SNP信息显著支持的父亲单体型作为胚胎的父本来源单体型；以及确定胚胎的SNP信息显著支持的母亲单体型作为胚胎的母本来源单体型。根据本发明的实施例，所述区分型SNP数不低于10个是显著支持的指示。

在本发明的再一个方面，本发明还提出了一种确定染色体预定区域中SNP信息的设备。根据本发明的实施例，该设备包括：测序装置；以及前面所述的存储有适于被处理器执行的指令以便基于测序结果确定染色体预定区域中的SNP信息计算机可读介质。利用本发明的该设备能够准确有效地确定染色体预定区域中SNP信息，例如受试样本的致病基因相关的突变位点信息，进而，该信息能够有效地用于确定受试者的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为临床疾病检测或治疗提供依据。其中，当所述染色体的至少一部分为胚胎的全基因组时，所述计算机可读介质存储的指令适于被处理器执行以便针对所述胎儿的全基因组，确定所述胎儿染色体预定区域中的SNP信息。

在本发明的又一个方面，本发明还提出了一种确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：测序装置；以及前面所述的存储有适于被处理器执行的指令以便针对胎儿的全基因组确定胎儿染色体预定区域中的SNP信息的计算机可读介质。利用本发明的该系统能够准确有效地确定胚胎染色体预定区域中SNP信息，进而，该信息能够有效地用于确定胎儿的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

需要说明的是，前面描述的本发明的计算机可读介质的优点和效果同样适用于上述确定染色体预定区域中SNP信息的设备以及确定胚胎染色体预定区域中SNP信息的系统，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

一般方法

参考图1，在下面的实施例中主要步骤如下：

1、根据目标区域设计探针，定制捕获芯片

本发明所设计的捕获芯片包含两部分，一部分为目标基因区域；另一部分为SNP-marker区域。目标基因区域主要为外显子及外显子与内含子交界区域，该区域覆盖了绝大部分的致病突变，可用于疾病突变的直接检测。SNP-marker区域为目标基因区域上下游区域，该区域包含了上千个高频SNP(即千人数据库中频率大于0.3的SNP)，该区域用于检测父母差异化的SNP，结合家系中的先证者SNP信息构建致病基因单体型。由于减数分裂中同源染色体间基因重组的存在，会对基因的SNP-单体型造成影响。SNP-marker间距离越小，重组率越小，当距离小于1M时，重组率低于1％(人的重组率是1％每1M的区域)。芯片捕获包含的SNP-marker区域的范围可以基于人类基因组的一般重组率大概估计选择确定，一般地选择的目标基因区域上下游的范围小，捕获得的SNP准确，但是数量少，选择的范围大，捕获得的SNP数量多，但是范围大发生的重组概率也会越高，且选择的上下游范围大SNP数量多，设计合成花费相对高。在本发明的一个实施例中为降低基因重组的影响，确保检测准确性，将SNP-marker区域限定在目标基因上下游1M内，这样可以把目标基因区与SNP-marker区域的重组的概率降低到万分之一。

1.1目标基因捕获芯片设计

首先确定目标基因，然后以Hg19为参考序列确定目标基因所在位置，最后确定捕获区域。

1.2SNP-marker捕获芯片设计

根据1.1中确定的各目标基因位置，在该位置的上下游1M距离内选取在人群中频率较高的SNP位点。使选取的SNP位点位于目标捕获片段中间，有利于提高SNP被捕获下来的几率，在本发明的一个实施例中，由于构建的文库大小在200bp左右，即捕获探针的捕获片段大小主要在200bp左右，为提高目标SNP的捕获效率，将这些SNP位点及其上下100bp左右(使选取的SNP大致位于1/2 200bp处)的区域为SNP-marker捕获区域。

1.3芯片评估

芯片设计完成后采用专业评估软件(Sequence Search and Alignment byHashing Algorithm，SSAHA)对探针特异性评估，评估合格后进行芯片合成。

2、家系样本制备

采集胚胎细胞基因组，并采用PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA或者MDA(多重链置换扩增)方法进行胚胎细胞全基因组扩增(WGA)，并提取父母及先证者的外周血(或根据疾病类型采集家族其他患病者样本)DNA。

3、文库制备

根据将选择的测序平台(Illumina Hiseq2000，Genome Analyzer，Miseq测序系列，Lifetechnologies的SOLiD测序系统，Ion Torrent测序系统或罗氏的454测序系统)的测序要求，将上述父母及先证者的外周血DNA及胚胎细胞基因组的WGA产物分别进行文库构建，文库构建完成后进行2100、Q-PCR及富集度的检测。

4、探针捕获杂交

将上述获得的各文库混合，并将混合文库与设计好的捕获探针进行杂交，杂交流程参照芯片合成服务公司提供的技术流程。

5、高通量测序

使用Illumina Hiseq2000，Genome Analyzer，Miseq测序系列，Lifetechnologies的SOLiD测序系统，Ion Torrent测序系统或罗氏的454测序系统等进行测序。

6、数据分析

参考图1，分析过程包括：

6.1、参考序列比对

根据不同测序平台要求，过滤掉低质量的测序数据，去除含有文库接头的序列，然后利用分析软件如BWA(Burrows Wheeler Aligner)软件包将测序数据与人类参考基因组进行序列比对，按照默认最优参数(-I-i 15-L-k 2-l 31-t 4)，取比对结果中比对到芯片目标区域的reads并用SAMtools去除PCR重复扩展的序列进行后续分析。

6.2、SNP calling

对得到的有效数据，应用SNP分析软件如SAMtools和GATK进行分析，获得目标区域内所有的SNP信息。

6.3、SNP过滤

对上述得到的SNP以一定的条件进行过滤，提高SNP准确性。过滤条件为，过滤掉满足下列任一条件的：1、SNP测序深度低于10×；2、杂合SNP中两种碱基测序深度差异高于10％。这是由于测序深度过低可能会导致部分杂合SNP中其中一碱基未能测到，杂合SNP中两碱基测序深度差异过大也会导致无法与测序错误正确区分，判断为纯合。经以上条件过滤可以去除潜在错误的SNP。

6.4、筛选可以有效区分父母单体型的碱基(即区分型SNP)

区分型SNP是指在某一位置父母双方4个碱基中其中一碱基(常染色体)与该位置的其他任一碱基不相同，该碱基可以确定父母双方4条单体型中的唯一一条，如某位置父母基因型分别为AA、AG，则G碱基为区分型SNP，因为在该位置G可以确定唯一的一个单体型，而A在其他3个单体型中都存在，无法确定唯一单体型。具体示例如图2所示。按照图示要求即可以根据孟德尔遗传原理，选择确定父母区分型SNPs位点。

6.5、构建父母单体型

根据孟德尔遗传原理与连锁交换定律，结合父母区分型SNP位点和先证者SNPs信息构建出父母SNP-单体型，构建原理如图4所示，即首先结合父母区分型SNPs位点信息和先证者SNPs信息，按照基本的孟德尔遗传原理和连锁交换定律构建父母单体型；然后结合父母单体型结果和胚胎SNPs信息预测胚胎单体型结果。其中，如图4所示，红色标记的碱基字母表示父亲的区分型SNPs位点；黄色标记的碱基字母表示母亲的SNPs位点；斜体和下划线标记的碱基字母表示该位点在WGA过程中发生了ADO；G*表示致病突变碱基；--表示检测失败的位点。其中，SNP-单体型完全由区分型SNP位置碱基组成，每条单体型都含有众多区分型SNP，单体型中的区分型SNP能够与其他单体型相区分。如某一位置父母基因型分别为AA、AG，G为区分型SNP，A为非区分型SNP，A、G分别为单体型中该处的碱基。由于先证者的2条单体型，分别遗传自父母，可根据疾病情况确定致病突变所在的单体型。如显性遗传病，父亲患病，母亲正常，则先证者所遗传自父亲的单体型为致病突变所在的单体型；如隐性遗传病，父母都是携带者，则先证者(患病)的两个单体型都为致病突变所在的单体型。

6.6、分析胚胎单体型

由于胚胎的2个单体型分别遗传自父母各一条，可以根据胚胎SNPs信息结合父母SNP-单体型进行分析，判断胚胎SNPs是哪两条单体型的组合，分析原理如图4所示。分析中可采用区分型SNP数目统计计算，根据数值的大小确定胚胎单体型，如图5所示。如一单体型区分型SNP数大于10，则可确定该单体型为胚胎其中一条单体型；如一单体型区分型SNP数小于4，则可判断该单体型为SNP错误导致；本发明的一个实施例中，为确保准确，将一正确单体型的SNP支持数定于为不低于10个，错误单体型SNP支持数不高于3个，由于6.3步骤中设定的SNP过滤条件较为严格，即单体型构建中所用SNP正确率较高，并且候选SNP数量大，实际测试数据表明正确单体型的SNP支持数远高于10个，错误单体型SNP支持数一般为0。对于一常染色体疾病，经过本流程分析，每个胚胎只能得到2个满足要求的单体型；对于一X染色体疾病，经过本流程可得到一个(男胎)或两个(女胎)满足要求的单体型。

6.7、结果分析

根据胚胎是否遗传父母的致病单体型判断胚胎的遗传状态是正常、携带或致病。

实施例1

在本实施例中，采用一般方法和检测流程分别对一苯丙酮尿症(经典型)家系(家系一，常染色体隐性遗传)样本及一生育进行性肌营养不良(DMD)家系(家系二，X染色体隐性遗传)样本进行检测。家系一夫妇经过IVF获得7个胚胎，并采用MF-PCR方法进行PAH基因检测，筛选出2个正常胚胎植入，最终获得一个女婴，经脐带血基因检测确认该女婴正常。家系二夫妇经过IVF获得9个胚胎，并采用MF-PCR方法进行DMD基因PGD，筛选出3个正常胚胎，选择其中2个植入，最终获得一个男婴(其中有一胚胎没发育)，经脐带血基因检测确认该男婴正常。

家系一样本包括父母、患病女儿(先证者)外周血及7个胚胎卵裂球单细胞。经PAH基因检测，父亲为PAH基因R243Q(c.728G>A)突变携带者，母亲为PAH基因V399V(c.1197A>T)突变携带者，先证者为PAH基因R243Q(c.728G>A)与V399V(c.1197A>T)复合突变，表现为苯丙酮尿症。7个胚胎卵裂球单细胞(分别标记为E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17)经WGA后采用多重PCR检测，检测结果如表1。

表1家系一7个胚胎的MF-PCR检测结果

样本	检测结果
		E11	R243Q(c.728G>A)携带者
E12	正常
		E13	正常
E14	R243Q(c.728G>A)携带者
		E15	R243Q(c.728G>A)合并V399V(c.1197A>T)突变
E16	R243Q(c.728G>A)携带者
		E17	V399V(c.1197A>T)携带者

家系二样本包括父母、女儿(表型正常)外周血及9个胚胎卵裂球单细胞。经DMD基因检测，父亲正常，母亲及女儿为DMD基因R2905X(c.8713C>T)突变携带者。9个胚胎卵裂球单细胞(分别标记为E21、E22、E23、E24、E25、E26、E27、E28、E29)经WGA后采用多重PCR检测，检测结果如表2。

表2家系二9个胚胎的MF-PCR检测结果

采用本发明的技术方案和检测流程对上述样本进行回顾检测，得到的检测结果与MF-PCR检测结果相符，结果符合率为100％。结果表明本发明的技术能够准确检测胚胎染色体预定区域的SNP信息，并进一步基于获得的SNP信息检测胚胎基因型指导胚胎植入，且具有检测周期短(11天)、高通量、低成本的优势。具体实施按以下步骤操作：

1.样本提取与WGA(1天)

父母、先证者外周血采用QIAamp DNA Blood MidiKit(Qiagen)试剂盒按说明提取DNA，并用Nanodrop检测，浓度大于30ng/ul.7个胚胎卵裂球单细胞分别采用

Single Cell WGA kit(Qiagen)试剂盒并按操作说明进行全基因组扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳及Qubit定量。样品标记分别为：F1、M1、P1、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17，F2、M2、P2、E21、E22、E23、E24、E25、E26、E27、E28、E29。

2.Illumina Hiseq文库构建(2天)

上述获得的DNA样品及WGA产物先用CovarisTM打断仪打断至200bp大小的片段，然后根据

公司HiSeq2000TM测序仪的上机要求进行建库，具体步骤如下：

2.1样品打断

22管基因组DNA及WGA产物各取总量3ug用Covaris microTube with AFA fiberand Snap‐Cap在Covaris S2(Covaris公司)上打断。打断条件如下：

Duty Cycle	10％
		持续	5
Cycles/Burst	200
		时间(秒)	60s×5个循环

打断后用Qiagen DNA Purification Kit(Qiagen)纯化，溶于327.5μl的EB中。

2.2末端修复：

取纯化产物37.5μL，进行末端修复反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)：

反应条件为：Thermomixer 20℃温浴30min。

反应产物经Qiagen DNA Purification Kit回收纯化，溶于32μl的EB中。

2.33’末端加A反应

DNA的3’末端加A反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)：

反应条件为：Thermomixer 37℃温浴30min。

反应产物经Qiagen DNA Purification Kit(QIAGEN公司)回收纯化，溶于38μl的EB中。

2.4连接Illumina Hiseq接头(adaptor)

22个文库分别加不同的文库标签，并记录下文库标签和文库的对应关系。体系如下(试剂均购自Illumina公司)：

反应条件为：Thermomixer 16℃温浴16h。

反应产物经60ul Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化后溶20μLEB。

2.5文库构建完成后经

Bioanalyzer 2100检测片段分布范围符合要求，结果如图3，经荧光定量PCR(QPCR)检测到文库浓度结果如表3：

表3QPCR定量检测文库的相对浓度

样本	文库号	QPCR浓度(nM)
			F1	文库1	66.14
M1	文库2	53.62
			P1	文库3	47.35
E11	文库4	76.30
			E12	文库5	53.77
E13	文库6	90.65
			E14	文库7	78.46
E15	文库8	47.86
			E16	文库9	71.87
E17	文库10	51.92
			F2	文库11	60.54
M2	文库12	63.42
			P2	文库13	57.65
E21	文库14	67.35
			E22	文库15	54.76
E23	文库16	70.66
			E24	文库17	75.26
E25	文库18	57.14
			E26	文库19	72.07
E27	文库20	56.91
			E28	文库21	71.87
E29	文库22	61.94

3、芯片捕获(3天)

上述22个文库分2组，每组11个，按等比例混合成总量500ng的2个混合文库。混合文库采用NimbleGen公司定制的液相芯片SeqCap EZ Choice XL Library按操作说明进行杂交(具体步骤见Nimblegen SeqCap EZ Exome Capture操作说明书)。杂交72个小时后采用NmibleGenwashkit按操作说明进行洗脱。最后洗脱产物进行富集度检测、Qpcr和2100检测。

4、Hiseq2500测序(3天)

上述杂交产物上

HiSeq2500TM测序仪测序，测序循环数为PE101index(即双向101bp index测序)，其中仪器的参数设置及操作方法都按照

操作手册(可由http://www.illumina.com/support/documentation.ilmn获取)。

5、结果分析(2天)

测序完成后，首先对测序数据进行质量过滤和去除接头污染的序列，高质量的测序reads的进行以下分析：

5.1总体数据评价

在数据分析过程中，使用比对软件BWA(version 0.5.10)将测序reads比对到人类参考基因组(HG19，NCBI release GRCh37)上，参数设置为(-I-i 15-L-k 2-l 31-t 4)，取比对结果中唯一比对到芯片目标区域的reads并用SAMtools去除PCR重复扩展的序列进行后续分析。测序得到的数据量，如(表4)中所示。

表4测序数据产量

样本	Reads数量	覆盖率(％)	平均测序深度
				F1	257769	92.34	112.9
M1	229895	91.42	100.74
				P1	194791	91.03	85.29
E11	94342	90.3	47.22
				E12	115433	90.83	50.37
E13	80693	90.29	55.18
				E14	79561	89.71	43.29
E15	93157	89.11	45.17
				E16	96298	89.55	46.03
E17	130773	90.37	57.07
				F2	232455	91.16	119.66
M2	223421	91.57	106.6
				P2	213217	92.19	88.87
E21	104379	90.03	57.12
				E22	106759	90.78	54.33
E23	90678	90.29	43.77
				E24	89056	89.71	42.24
E25	98867	89.76	49.86
				E26	97656	89.67	48.93
E27	112321	90.13	53.27
				E28	95651	89.57	46.03
E29	98343	89.72	51.07

父母及先证者的外周血样品测序深度约为100x，胚胎细胞WGA样品测序深度约为50x。然后采用Genome Analysis Toolkit(GATK)软件包进行个样本SNP及indel分析，得到各个样本的基因型。部分基因区域基因型如(表5、表6)所示：

表5各样本部分PAH基因区域基因型

该SNP信息对应参考基因组的反义链。-表示该处无法得到SNP(无数据覆盖或深度太低)，斜体表示致病突变。表中103237426坐标和103246707坐标对应的是PAH数据库中V399V(c.1197A>T)与R243Q(c.728G>A)位点。为了便于理解，已经将该两个突变位点的反义链信息改成对应的正义链的形式表示。

表6各样本部分DMD基因区域基因型

-表示该处无法得到SNP(无数据覆盖或深度太低)，斜体表示致病突变。表中32456388坐标对应的是DMD数据库中R2905X(c.8713C>T)位点。

5.2父母单体型构建

根据父母及先证者的SNP信息按照上述图4所示方法可以构建父母单体型，包括致病突变所在的单体型，表7、表8分别表示PAH及DMD基因部分位置的单体型构建。

表7PAH基因父母单体型构建

表中F-Hap1、F-Hap2分别表示父亲两个单体型，M-Hap1，M-Hap2分别表示母亲两个单体型。该SNP信息对应参考基因组的负链。-表示该处无法得到SNP(无数据覆盖或深度太低)，斜体为致病突变。表中103237426坐标和103246707坐标对应的是PAH数据库中V399V(c.1197A>T)与R243Q(c.728G>A)位点。为了便于理解，已经将该两个突变位点的反义链信息改成对应的正义链的形式表示。

表8DMD基因父母单体型构建

表中F-Hap表示父亲单体型(男性只有一条X染色体)，M-Hap1，M-Hap2分别表示母亲两个单体型。斜体为致病突变。表中32456388坐标对应的是DMD数据库中R2905X(c.8713C>T)位点。

5.3胚胎单体型分析

根据表5、6中胚胎SNP信息及表7、8中父母单体型信息按照图4所示方法对胚胎区分型SNPs进行统计，然后根据对应每条单体型支持的SNP数目多少判断出胚胎单体型，进而判断胚胎是否致病。对于常染色体，一个胚胎只有2个单体型，一般也只有两个单体型有SNP支持，但偶尔会出现第3或第4条单体型，这是由于SNP错误导致，这种错误的SNP在总SNP中低于5％。此外，由于ADO及测序错误的存在，胚胎SNP会存在个别SNP丢失或错误现象，为避免这种错误对结果的影响，我们规定一条单体型至少有10个区分型SNPs支持。本实施例的大量数据表明，错误的单体型所支持的区分型SNPs一般不超过3个，而正确的单体型所支持的区分型SNPs会大于20个，这说明个别错误不会影响胚胎单体型判断。因而，为确保结果准确，本发明将正确单体型的SNP支持数定义为不少于10个，错误单体型的SNP数不大于3个。具体分析流程如图5所示。图5显示的为一常染色体隐性遗传病的胚胎状态分析流程，其中父母的Hap1为致病突变所在单体型。图中所示个别胚胎出现了SNP支持第3个单体型，但支持的SNP非常少，不会影响结果判断。

从以上分析结果即可判断胚胎状态，如表9所示。该结果与传统方法MF-PCR检测结果一致，结果符合率为100％。。上述流程开发软件自动完成。

表9各胚胎检测结果

样本	检测结果
		E11	R243Q(c.728G>A)携带者
E12	正常
		E13	正常
E14	R243Q(c.728G>A)携带者
		E15	R243Q(c.728G>A)合并V399V(c.1197A>T)突变
E16	R243Q(c.728G>A)携带者
		E17	V399V(c.1197A>T)携带者
E21	女，正常
		E22	女，R2905X(c.8713C>T)携带者
E23	男，R2905X(c.8713C>T)突变
		E24	女，R2905X(c.8713C>T)携带者
E25	男，R2905X(c.8713C>T)突变
		E26	女，正常
E27	女，R2905X(c.8713C>T)携带者
		E28	男，正常
E29	男，R2905X(c.8713C>T)突变

工业实用性

本发明的确定(胚胎)染色体预定区域中SNP信息的方法、系统和计算机可读介质，能够有效地用于确定染色体预定区域中SNP信息，例如胚胎染色体预定区域中SNP信息，并且该信息准确度高，能够有效地用于确定胎儿的遗传状态是正常、携带或致病，从而能够为胚胎植入前单基因病检测、孕妇产前诊断或临床疾病治疗提供依据。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

1.一种确定胚胎的SNP单体型的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：

获取所述胚胎的全基因组；以及

针对所述胚胎的全基因组，确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息，

获取胚胎遗传相关个体的全基因组，其中，所述胚胎遗传相关个体包括所述胚胎的父亲、母亲和先证者；以及

基于所述胚胎遗传相关个体的全基因组，分别确定所述父亲的SNP信息，所述母亲的SNP信息以及所述先证者的SNP信息；

基于所述父亲的SNP信息和所述母亲的SNP信息，确定区分型SNP；

基于所述区分型SNP和所述先证者的SNP信息，确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型；以及

基于所述胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，确定所述父亲SNP单体型和母亲SNP单体型的组合方式，以便获得所述胚胎的SNP单体型，

所述胚胎的SNP单体型是通过下列步骤获得的：

确定胚胎的SNP信息显著支持的父亲单体型作为胚胎的父本来源单体型；以及

确定胚胎的SNP信息显著支持的母亲单体型作为胚胎的母本来源单体型；

所述区分型SNP数不低于10个是显著支持的指示，

其中，确定染色体预定区域中SNP信息的方法包括：

针对染色体的至少一部分，构建测序文库；

利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；

对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；

基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息；以及

对所获得的SNP信息进行过滤；

所述预定区域包括目标基因区域和SNP-marker区域；

所述目标基因区域包括所述目标基因的外显子和外显子毗邻区的至少一部分；

所述外显子毗邻区包括所述外显子5’端上游50bp的区域和所述外显子下游50bp的区域；

所述SNP-marker区域包括所述目标基因上下游1M的范围；

所述探针的长度为60～80nt；

所述过滤的条件为去除满足下列条件的SNP：

胚胎遗传相关个体的测序深度为50×且测序质量较好，过滤掉低于10×的SNP，也过滤掉测序深度差异高于10％的杂合SNP；

采用测序深度高于100×，过滤掉低于20×的SNP，也过滤掉测序深度差异高于5％的杂合SNP。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色体的至少一部分是通过对生物体的外周血进行DNA提取而获得的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用选自Illumina Hiseq2000、GenomeAnalyzer，Miseq测序系列、Life technologies的SOLiD测序系统、Ion Torrent测序系统和罗氏的454测序系统的至少之一进行所述测序。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息进一步包括：

将所述测序结果与参考序列进行比对，以便获得唯一比对序列；以及

利用SNP分析软件从所述唯一比对序列获取所述预定区域中的SNP信息。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述比对是利用BWA软件包进行的。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在获得唯一比对序列后，进一步包括从所述唯一比对序列去除PCR重复扩展的序列。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SNP分析软件为选自SAMtools和GATK的至少之一。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎的全基因组是通过对胚胎细胞进行全基因组扩增而获得的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增是通过选自PEP-PCR，DOP-PCR，OmniPlex WGA和MDA的至少之一进行的。

11.一种确定胚胎SNP单体型的系统，其特征在于，包括：

第一全基因组获取设备，所述第一全基因组获取设备适于获取所述胚胎的全基因组；以及

SNP信息确定设备，所述SNP信息确定设备与所述第一全基因组获取设备相连，用于确定所述胚胎染色体预定区域中的SNP信息，

第二全基因组获取设备，所述第二全基因组获取设备适于获取胚胎遗传相关个体的全基因组，其中，所述胚胎遗传相关个体包括所述胚胎的父亲、母亲和先证者；

区分型SNP确定设备，所述区分型确定设备适于基于所述父亲的SNP信息和所述母亲的SNP信息，确定区分型SNP；

第一单体型确定设备，所述第一单体型确定设备适于基于所述区分型SNP和所述先证者的SNP信息，确定父亲SNP单体型和母亲SNP单体型；以及

第二单体型确定设备，所述第二单体型确定设备适于基于所述胚胎的SNP信息、父亲SNP单体型和母亲SNP单体型，确定所述父亲SNP单体型和母亲SNP单体型的组合方式，以便获得所述胚胎的SNP单体型，

所述第二单体型确定设备包括：

确定胚胎的SNP信息显著支持的父亲单体型作为胚胎的父本来源单体型的单元；以及

确定胚胎的SNP信息显著支持的母亲单体型作为胚胎的母本来源单体型的单元，

所述区分型SNP数不低于10个是显著支持的指示，

其中，所述SNP信息确定设备包括：

文库构建装置，所述文库构建装置适于针对染色体的至少一部分，构建测序文库；

文库筛选装置，所述文库筛选装置与所述文库构建装置相连，并且适于利用探针对所述测序文库进行筛选，其中，所述探针特异性识别所述预定区域中已知SNP位点的至少一个，以便获得目标捕获片段，所述目标捕获片段包含SNP位点；

测序装置，所述测序装置与所述文库筛选装置相连，适于对经过筛选的测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及

分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，并且适于基于所述测序结果，确定所述预定区域中的SNP信息，所述分析装置进一步包括：适于对所获得的SNP信息进行过滤的单元，所述过滤的条件为去除满足下列条件的SNP：

采用测序深度高于100×，过滤掉低于20×的SNP，也过滤掉测序深度差异高于5％的杂合SNP，

所述预定区域包括目标基因区域和SNP-marker区域，所述目标基因区域包括所述目标基因的外显子和外显子毗邻区的至少一部分，所述外显子毗邻区包括外显子5’端上游50bp的区域和所述外显子下游50bp的区域，所述SNP-marker区域包括所述目标基因上下游1M的范围；

所述探针的长度为60～80nt。

12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。

13.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述SNP信息确定设备进一步包括染色体制备装置，所述染色体制备装置与所述文库构建装置相连，并且适用于通过全基因组扩增获得胚胎细胞全基因组，所述胚胎细胞全基因组构成所述染色体的至少一部分。

14.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述染色体制备装置适于通过选自PEP-PCR、DOP-PCR、OmniPlex WGA和MDA的至少之一进行所述全基因组扩增。

15.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述SNP信息确定设备进一步包括DNA提取装置，所述DNA提取装置与所述文库构建装置相连，并且适于通过对生物体的外周血进行DNA提取，以便获得所述染色体的至少一部分。

16.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述测序装置为选自IlluminaHiseq2000，Genome Analyzer、Miseq测序系列、Life technologies的SOLiD测序系统、IonTorrent测序系统和罗氏的454测序系统的至少之一。

17.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述分析装置进一步包括：

比对单元，所述比对单元适于将所述测序结果与参考序列进行比对，以便获得唯一比对序列；以及

SNP信息获取单元，所述SNP信息获取单元与所述比对单元相连，并且适于利用SNP分析软件从所述唯一比对序列获取所述预定区域中的SNP信息。

18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述比对单元适于利用BWA软件包进行所述比对。

19.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述分析装置进一步包括：

适于从所述唯一比对序列去除PCR重复扩展的序列的单元。

20.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述SNP分析软件为选自SAMtools和GATK的至少之一。

21.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述第一全基因组获取设备适于通过对胚胎细胞进行全基因组扩增而获得所述胚胎的全基因组。

22.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述第一全基因组获取设备适于利用选自PEP-PCR、DOP-PCR、OmniPlex WGA和MDA的至少之一获得所述胚胎的全基因组。