CN106011313A

CN106011313A - 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂

Info

Publication number: CN106011313A
Application number: CN201610573183.5A
Authority: CN
Inventors: 郭鹏举; 朱余军; 丛峰; 黄韧; 陈梅丽
Original assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN106011313B

Abstract

本发明公开了一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析方法及试剂。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明的灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

Description

一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析方法及试剂

技术领域

本发明属于养殖业的病原检测领域，具体涉及一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的多重荧光免疫分析方法及试剂。

背景技术

随着市场对禽类的需求不断增多，养禽业得到迅猛的发展，养禽业集约化程度不断提高，禽呼吸道病原的感染呈逐年上升趋势。禽的呼吸道疾病一直是导致养禽业重大经济损失的主要因素。鸡呼吸道疾病的病原有其复杂性，它可有病毒、支原体以及细菌引起发病，在临床上还会出现各种混合感染。这些疾病的产生在养鸡生产中不容忽视。鸡的呼吸道疾病经常发生，各种日龄的鸡均可感染甚至导致死亡，成年鸡产蛋会下降，同时鸡的呼吸道疾病发病率高，容易引起多种疾病的继发感染，例如支原体会诱发鸡的肺炎和气囊炎，所以积极预防和及时治疗呼吸道疾病有着重大的意义。

鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体是重要的禽呼吸道病原，临床症状和病理变化极为相似，在临床和组织病理学上很难区分。鸡呼吸道疾病多是混合感染，在临床上容易造成误诊，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，病毒的分离和鉴定、血清学试验、酶联免疫吸附试验以及分子生物学诊断。传统的检测方法敏感性低，特异性差，不易检测出混合感染，而且操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗，造成重大的经济损失。

随着分子生物学的快速发展，多重PCR已广泛应用于禽病混合感染的鉴别诊断，其原理是设计能够同时扩增出多种待测病原特定片段大小的多对引物，在PCR反应体系中加入多对引物，能够对多种病原进行鉴别诊断。多重RT-PCR因其灵敏性、特异性和操作的简单性被广泛应用于禽病的混合感，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性，而多重PCR是靠片段的大小来区别的，一般到了三重以上，片段大小差别大，其每种病毒的扩增效率不一样，造成结果存在偏差。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的多重荧光免疫分析的引物。

本发明的另一目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的多重荧光免疫分析的试剂。

本发明的再一目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的多重荧光免疫分析的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物L1：5’-GCAGCGAAAAGAAGGC-3’（SEQ ID NO:1），

引物L2：5’-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3’（SEQ ID NO:2）；

引物B1：5’-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3’（SEQ ID NO:3），

引物B2：5’-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3’（SEQ ID NO:4）；

引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO:5），

引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO:6）；

引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO:7），

引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO:8）。

进一步的，所述引物L1和L2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物G1和G2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物S1和S2其中一条引物的5’端被生物素化。

进一步的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

进一步的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。

一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的试剂，该试剂中含有上述任一所述引物。

进一步的，上述试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。

进一步的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的方法，包括如下步骤：

1）从样品中提取病毒RNA或/和DNA；

2）以提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增；

3）将上步扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；

4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：

5×buffer 4µL

dNTP 0.8µL

引物混合液 2µL

酶 0.8µL

模板 1µL

ddH₂O 11.4µL

Total 20µL；

进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

进一步的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：

4种荧光编码微球 20µL

链霉亲和素-藻红蛋白 75µL

扩增产物 5µL

总体积 100µL；37℃反应30min。

本发明的有益效果是：

1）本发明方法可以同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行检测，本发明通过RT-PCR获得目标扩增片段，再将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的病原。

2）本发明方法能够同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。

附图说明

图1是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体及人工模拟的四重感染的RT-PCR的电泳图；

图2是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体及人工模拟的四重感染的多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；

图3是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；

图4是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；

图5是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图。

具体实施方式

引物L1：5’-GCAGCGAAAAGAAGGC-3’（SEQ ID NO:1），

引物L2：5’-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3’（SEQ ID NO:2）；

引物B1：5’-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3’（SEQ ID NO:3），

引物B2：5’-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3’（SEQ ID NO:4）；

引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO:5），

引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO:6）；

引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO:7），

引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO:8）。

优选的，所述引物L1和L2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物G1和G2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物S1和S2其中一条引物的5’端被生物素化。

优选的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

优选的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。

优选的，上述试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。

优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

1）从样品中提取病毒RNA或/和DNA；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

优选的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：

5×buffer 4µL

dNTP 0.8µL

引物混合液 2µL

酶 0.8µL

模板 1µL

ddH₂O 11.4µL

Total 20µL；

优选的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

优选的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：

4种荧光编码微球 20µL

链霉亲和素-藻红蛋白 75µL

扩增产物 5µL

总体积 100µL；37℃反应30min。

优选的，步骤3）中4种编码不同荧光色的荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，4种荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 引物

经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2对同时快检测鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的效果最好，其碱基序列如下所示。

引物L1：ACTGTGTAAAGCAGGCCAAGGTCTGT（SEQ ID NO：1）；

引物L2：AACAATCAATTTGGCACAATGCC（SEQ ID NO：2）；

引物S1：CCCAGCCATATACTCAGTCGTGC（SEQ ID NO：3）；

引物S2：TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC（SEQ ID NO：4）；

引物P1：AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT（SEQ ID NO：5）；

引物P2：GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA（SEQ ID NO：6）；

引物R1：ACGTCTCAAATACACTCTGATAC（SEQ ID NO：7）；

引物R2：TTCCAATCKGGAGATTGCAAGTTG（SEQ ID NO：8）。

本发明采用多重荧光免疫分析的方法对4种ILTV、IBV、MG和MS病原进行区分，故将上述引物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物L1、B1、G1和S1的5’端连接有tag序列，所连接的tag序列分别为：

引物L1的tag序列为：5’-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3’（SEQ ID NO：9）；

引物B1的tag序列为：5’-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3’（SEQ ID NO：10）；

引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO：11）；

引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO：12）。

另外，引物L2、B2、G2和S2的5’端还添加有生物素标记。

实施例2 用于快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）的多重荧光免疫分析试剂

该试剂包括以下组分：

（1）实施例1所设计的用于多重荧光免疫分析的引物；

（2）4种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物中的tag序列互补配对；4种微球均购自luminex公司，其中ILTV、IBV、MS和MG分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A067、MTAG-A036、MTAG-A025和MTAG-042。

（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。

实施例3 ILTV、IBV、MS和MG的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立

（1）ILTV、IBV、MS和MG质粒的构建

用天根的核酸自动抽取仪分别提取ILTV、IBV、MG、MS病原的RNA/DNA，分别用引物对L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2进行RT-PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化，将纯化后的cDNA分别连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。

（2）质粒PCR扩增

用实施例1所述的引物分别对ILTV、IBV、MS、MG引物进行单重、四重RT-PCR扩增。

上游引物混合液的制备：将L1、B1、G1和S1以摩尔比1:1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将L2、B2、G2和S2以摩尔比1:1:1:1比例进行混合。利用ILTV、IBV、MS、MG 4种病原的特异性模板，以及ILTV、IBV、MS、MG四重模板，对上述四种病毒的特应性区域进行扩增。其中四重模板的制备：将四种质粒以体积比1:1:1:1的比例进行混合。

PCR扩增反应体系如下：

扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

电泳检测结果：将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。M：DL2000bp DNA marker，1：IBV，2：ILTV，3：MG，4：MS，5：对IBV+ILTV+MS+MG进行的四重PCR，6：PCR空白对照。从图1中可以看出，ILTV的扩增产物大小约为141bp，IBV的扩增产物大小约为162bp，MG的扩增产物大小约为133bp，MS的扩增产物大小约为141bp，由于这四种病毒的扩增产物大小相近，所以四重PCR扩增产物的电泳条带无法分辨。

（3）将所得的PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：

分别包被有特异的anti-tag序列的4种微球，其中anti-tag序列能相应地与ILTV、IBV、MS和MG四种病毒引物上的tag序列互补配对。四种微球均购自luminex公司，具体的ILTV、IBV、MS和MG分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A067、MTAG-A036、MTAG-A025和MTAG-042。

荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×TmHybrdization Buffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。

SA-PE工作液制备：将1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10μg/μl。

充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μl，样品孔中加入5μl PCR产物，背景孔中加入5μl PCR blank产物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中37℃孵育30min。

依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μl上述反应液进行检测，结果如图2所示，图中“ILTV+IBV+MS+MG”表示四重PCR结果；“ILTV”、“IBV”、“MG”、“MS”分别对ILTV、IBV、MG、MS进行的单重PCR；从图2中可以看出，虽然四重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病原。

结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：

最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10头健康鸡组织样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为381.3，因此将本发明的cutoff值定为400。只有检测样品的MFI值高于400时，该实验数据才能进行有效分析。

待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞400时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤400时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

实施例4 ILTV、IBV、MS和MG的多重荧光免疫分析检测特异性实验

分别用鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体、禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽传染性贫血病毒、马立克病毒作为模板进行多重荧光免疫分析检测。实验结果如图3所示，只有传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、滑液囊支原体、鸡毒支原体为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。

实施例5：ILTV、IBV、MS和MG的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验

将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至10¹copies/μl，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。ILTV、IBV、MS和MG的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图4所示，实验结果表明，所有病原的灵敏度检出限为10²copies/µl。

实施例6：样品的检测

从鸡场采集的喉气管、肺、肾、肝样品，用天根核酸自动抽取仪提取RNA/DNA，使用Qiagen的RT-PCR kit进行扩增，以RNA/DNA作为模板，采用上述ILTV、IBV、MS、MG的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测仪上读数。具体步骤参照实施例3，实验结果如图5所示。

经普通PCR检测实验结果表明，样品1、2、3、5、6、12、21为阴性样本；4、7、9、10、14、17、18、19、20为鸡传染性喉气管炎病毒样品；5、11为鸡滑液囊支原体样品；13为鸡传染性支气管炎病毒样品；8、15、16为鸡毒支原体样品。通过测序分析，结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广东省实验动物监测所

<120> 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析方法及试剂

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcagcgaaaa gaaggc 16

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcatcgtgct cggtgtcc 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatcacgctc aagttcaagg c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcattgttcc tctcctcatc 20

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cttacagatt acaggagcag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aagcatttca tttgttttac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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attagcagct agtgcagtgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tttgaggatt atcagtattt g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atctcaatta caataacaca caaa 24

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<212> DNA

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attaaacaac tcttaactac acaa 24

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cactacacat ttatcataac aaat 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctttcttaat acattacaac atac 24

Claims

1.一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物L1：5’-GCAGCGAAAAGAAGGC-3’（SEQ ID NO:1），

引物L2：5’-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3’（SEQ ID NO:2）；

引物B1：5’-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3’（SEQ ID NO:3），

引物B2：5’-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3’（SEQ ID NO:4）；

引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO:5），

引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO:6）；

引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO:7），

引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO:8）。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：

所述引物L1和L2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物G1和G2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物S1和S2其中一条引物的5’端被生物素化。

3.根据利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

4.根据权利要求1或3所述的引物，其特征在于，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。

5.一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的试剂，其特征在于，该试剂中含有权利要求1~4任一所述引物。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，该试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。

7.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

8.一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）从样品中提取病毒RNA或/和DNA；

2）以提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用权利要求1~4任一所述的引物进行RT-PCR扩增；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：

5×buffer 4µL

dNTP 0.8µL

引物混合液 2µL

酶 0.8µL

模板 1µL

ddH₂O 11.4µL

Total 20µL；

步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：

4种荧光编码微球 20µL

链霉亲和素-藻红蛋白 75µL

扩增产物 5µL

总体积 100µL；37℃反应30min。