CN106011051A - Bend5蛋白在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Bend5蛋白在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用。所述Bend5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白的一级结构包含一个Coiled‑coil结构域和一个BEN结构域。具体地，过量表达Bend5可以促进小鼠胚胎干细胞向类似外胚层样细胞分化，过量表达Bend5还可以促进小鼠胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化。进一步地，本发明研究结果显示，转录因子蛋白Bend5依赖其BEN结构域蛋白结合Stella基因，并招募Tet1和Oct4激活Stella基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化，在不孕不育症的治疗方面具有很好的应用前景。

Description

Bend5 蛋白在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及蛋白Bend5（BEN domain containing protein 5）在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用。

背景技术

不孕不育症常给家庭、社会造成严重影响，调查显示不孕不育夫妇离婚率是正常人群的2. 2倍，已经成为一个重要的医学和社会问题。不孕不育的病因多样，其中，生殖细胞缺陷和缺失是非常常见的一种造成不孕不育症的因素。

研究显示，通过转录因子介导能提高胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞的转变效率。在体外条件下，通过在培养基中添加bFGF和Acvitin A等细胞因子能够促进小鼠胚胎干细胞（mESCs）向类似外胚层样细胞（Epiblast like cells，EpiLCs）分化，再通过添加BMP4a和 BMP8a等因子，EpiLCs能转变成原始生殖祖样细胞（primordial germ cells like cells，PGCLCs）。

但是，在上述这个体外诱导系统中，胚胎干细胞向生殖细胞分化的命运转变效率很低。究其原因就是胚胎干细胞向生殖祖细胞分化过程中需要信号通路、生殖祖细胞特异表达因子和表观遗传因子介导的基因组重编程。在这个过程中某些原始生殖祖样细胞特异表达因子会提高干细胞向原始生殖祖样细胞的分化效率，这些因子也可能是参与转录调控的转录因子，协同表观遗传因子改变干细胞基因组中表观遗传信息。

因此，寻找和鉴定新的蛋白因子促进作用于干细胞向原始生殖祖样细胞的分化，会大大提高体外诱导过程的效率，也会为不孕不育症的治疗提供治疗靶点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和技术不足，提供一种转录因子在促进小鼠胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化中的应用，所述转录因子蛋白为Bend5蛋白。Bend5蛋白依赖其BEN结构域蛋白结合Stella基因，并招募Tet1和Oct4激活Stella基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化。

本发明的目的是提供一种能够介导胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化的新的关键蛋白因子Bend5。

本发明另一目的是为Bend5促进原始生殖祖样细胞分化提供分子依据。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了转录因子Bend5（BEN domain containing protein 5）在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用。

其中，所述转录因子Bend5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1所示序列如下：

1 myafvrfled nvcyalpvsc vrdfsprsrl dfdnqkvyav yrgpeelgae pesppraprd

61 wgalllhkaq ilalaedksd lensvmqkki kipklslshv eddgevkdyg eedlqlrhik

121 rpegrkpsea ahksieavva rlerqnglsl ghstcpeevf veaspgtedm dsledavvpr

181 alyeellrny qqqqeemrhl qqelertrrq lvqqakklke ygalvsemke lrdlnrrlqd

241 vlllrlgsgp aidlekvkse clepepelrs tfseeantss yypapapvmd kyildngkvh

301 lgsgiwvdee kwhqlqvtqg dskytknlav miwgtdvlkn rsvtgvatkk kkdaipkppl

361 sphklsivre clydriaqet vdeteiaqrl skvnkyicek imdinksckn eerreakynl

421 q

另外，所述转录因子Bend5的一级结构包含一个Coiled-coil结构域和一个BEN结构域。

本发明研究发现，过量表达Bend5可以促进小鼠胚胎干细胞向类似外胚层样细胞（Epiblast like cell，EpiLCs）分化，过量表达Bend5还可以促进小鼠胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞（primordial germ cell-like cells，PGCLCs）分化。

因此，进一步地，上述应用是指Bend5蛋白在提高胚胎干细胞向类似外胚层样细胞（EpiLCs）分化和/或向原始生殖祖样细胞（ PGCLCs）分化方面的应用。

具体地，所述Bend5蛋白能够激活Stella报告基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞的转变。

更具体地，所述Bend5蛋白依赖其BEN结构域结合Stella基因上游区域激活Stella报告基因。

另外，更具体地，所述Bend5蛋白与Oct4和/或Tet1相互作用，在胚胎干细胞向类似外胚层样细胞分化过程中，Oct4和/或Tet1被招募到Stella基因上游区域，激活Stella基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞的转变。

基于上述应用，Bend5蛋白在制备能够提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞的药物或制剂方面的应用，以及装备的相关药物，也都在本发明的保护范围之内。

一种能够提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞的药物或制剂，包含有效量的Bend5蛋白或Bend5蛋白激活剂。

另外，Bend5蛋白或上述药物在制备不孕不育症治疗药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。

一种能够治疗不孕不育症的药物或制剂，包含有效量的Bend5蛋白或Bend5蛋白激活剂。

优选地，所述不孕不育症是指由原始生殖祖样细胞缺陷或缺失所造成的不孕不育症。

本发明经过大量的研究和探索，得出了以下成果和结论：

（1） 实时定量PCR实验检测Bend5基因在原始生殖祖细胞（PGC）中呈现高度表达状态（如图1）。

（2）Bend5促进原始生殖祖样细胞形成：通过构建Bend5稳定表达的ES细胞株，利用Activin A和bFGF双因子诱导两天，通过绿色荧光蛋白检测到Bend5表达加速Stella-GFP stem cell产生（如图2）和通过流式分析Stella阳性细胞检测其诱导效率（如图3）。收集阳性细胞通过实时定量PCR实验检测Stella和Bend5，显示Stella表达量均升高（如图4）。再利用悬浮诱导，实验证实Bend5促进PGCLCs形成（如图5）。

（3）通过染色质免疫共沉淀实验检测到Bend5结合Stella上游调控区域（如图6）。

（4）通过流式分析实验检测到Bend5蛋白缺失BEN结构域降低Stella阳性细胞的产生（如图7）。

（5）通过染色质免疫共沉淀实验检测到Bend5蛋白缺失BEN结构域后不结合Stella上游调控区（如图8）。

（6）通过蛋白质pull down实验检测到Bend5与Oct4相互作用（如图9）。

（7）通过染色质免疫共沉淀实验检测到Oct4能结合到Stella上游调控区（如图10）。

（8）通过蛋白质免疫共沉淀实验检测到Bend5与Tet1相互作用（如图11）。

（11）通过染色质免疫共沉淀实验检测到Tet1能结合到Stella上游调控区（如图12），Bend5蛋白缺失BEN结构域后Tet1不结合Stella上游调控区（如图13）。

综上研究结果显示，Bend5基因在原始生殖祖细胞中高度表达，Bend5蛋白作为新的转录因子，依赖其BEN结构域蛋白结合Stella基因，并招募Tet1和Oct4激活Stella报告基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞的转变。Bend5缺失BEN结构域，降低Bend5从胚胎干细胞向类似外胚层样细胞分化效率，Tet1不被招募到Stella基因上游区域。

本发明具有以下有益效果：

本发明解析了一个转录因子Bend5在小鼠胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化中的功能。

研究结果显示，转录因子蛋白Bend5依赖其BEN结构域蛋白结合Stella基因，并招募Tet1和Oct4激活Stella基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞分化，在不孕不育症的治疗方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为Bend5基因在小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和原始生殖祖细胞中相对表达量情况。

图2为通过绿色荧光蛋白检测Bend5稳定表达细胞系利用Activin A和bFGF双因子诱导两天形成EpiLCs的情况。

图3为通过促进EpiLCs诱导，Bend5促进Stella-GFP阳性细胞产生以及通过流式分析诱导效率情况。

图4为Bend5稳定细胞系经EpiLCs诱导2天后检测Blimp1、Stella和Bend5表达情况。

图5为Bend5稳定细胞系经悬浮PGC诱导7天后，Stella-GFP阳性细胞产生的情况。

图6为体外EpiLCs诱导后Bend5结合到Stella上游调控序列上的结果。

图7为Bend5 野生型和缺失BEN结构域的Bend5 的EpiLCs诱导情况。

图8为缺失BEN结构域的Bend5不结合到Stella上游调控区的结果。

图9为Bend5与Oct4相互作用情况。

图10为Oct4能结合到Stella上游调控区的结果。

图11为Bend5与Tet1相互作用。

图12为Tet1能结合到Stella上游调控区的结果。

图13为Bend5蛋白缺失BEN结构域后Tet1不结合Stella上游调控区的结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

本说明书中细胞名称“原始生殖祖细胞”和“原始生殖祖样细胞”，以及“类似外胚层细胞”和“类似外胚层样细胞”是根据来源不同，命名不同，具体说明如下：

原始生殖祖细胞（primordial germ cells，PGCs）是代表体内的自然状态的细胞。

原始生殖祖样细胞（primordial germ cells like cells，PGCLCs）是代表通过体外手段诱导出来的，与体内自然状态的属性存在一定的区别。

类似外胚层细胞（Epiblast cells）也是代表体内的自然状态的细胞。

类似外胚层样细胞（Epiblast like cells，EpiLCs）是代表通过体外手段诱导出来的，与体内自然状态的属性存在一定的区别。

实施例 1Bend5 基因在生殖样细胞中的表达

1、实时定量PCR实验检测Bend5基因在生殖样细胞中表达状态

（1）实验细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、小鼠胚胎干细胞（mES）和原始生殖祖细胞（PGC）。

（2）繁育Oct4报告基因小鼠，用其胚胎发育13.5天的胎鼠分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和原始生殖嵴，原始生殖嵴消化后通过流式细胞仪分析GFP-Oct4比率，分选出GFP-Oct4阳性细胞。收集好三种细胞后进行总RNA抽提，采用RNeasy试剂盒（Qiagen公司）对细胞的总RNA进行提取，RNA用DNase I（Ambion公司）在37℃处理30分钟来消化DNA。使用AffinityScriptqPCR的cDNA合成试剂盒（Stratagene公司）合成cDNA。采用 SYBR green PCR混合物试剂盒（Applied Biosystems公司）在ABI 7900 PCR检测系统（Applied Biosystems公司）用Bend5的RT-PCR引物，检测Bend5 cDNA的扩增情况。

2、结果如附图1所示，Bend5基因在原始生殖祖细胞（PGCs）中呈现高度表达状态。

实施例 2Bend5 促进生殖样细胞形成

1、构建稳定表达Bend5的Stella-GFP报告基因的干细胞系，去除滋养层细胞后，在含有15% 血清替代物（KSR，购于Gibco），终浓度0.1mM的 巯基乙醇（sigma），1mM非必需氨基酸(购于Gibco)，1mM谷氨酸钠(购于Gibco)，链霉素/青霉素(购于Gibco)，LIF(购于Millipore)， 2i（购于Gibco）的Knock-out DMEM (购于Gibco) 培养基中培养两代后，通过在诱导培养基中添加bFGF和Acvitin A等细胞因子能够促进小鼠胚胎干细胞（mESCs）向类似外胚层样细胞（Epiblast like cells，EpiLCs）分化，分化两天后，收集细胞用于绿色荧光蛋白（GFP）信号的分析，分析Stella阳性细胞检测其EpiLCs诱导效率。通过实时定量PCR实验检测Stella和Bend5表达量。另外，消化重选细胞种在96板U型孔板中，每孔1000个细胞，通过添加BMP4a和 BMP8a等因子于PGCLCs诱导培养基中诱导6天，EpiLCs能转变成原始生殖祖样细胞（primordial germ cells like cells，PGCLCs）。收集细胞用于绿色荧光蛋白（GFP）信号的分析，分析阳性细胞用于EpiLCs诱导效率的统计。在分子机理方面研究中，采用EpiLCs诱导样品用于染色质免疫共沉淀实验。

2、上述实时定量PCR的方法同实施例1。

EpiLC诱导的方法为：将1×10⁵细胞铺至预先用明胶处理的12孔板的一个孔，待细胞贴壁后去掉培养基，用PBS轻轻润洗一遍后，加入EpiLC培养基。细胞培养配方：DMEM/F12为1：1的培养基中包含有1% KSR（购于Gibco）、N2(1×)（购于Gibco）、B27(1×)（购于Gibco）、12 ng/ml bFGF（购于Roche）、20 ng/mlActivin A （购于Roche）、终浓度0.1mM的 巯基乙醇（sigma）。诱导两天，每天换新培养基，注意现配先用。

流式细胞仪分析的方法为：通过BD流式仪对诱导后细胞的荧光比例进行定量分析。首先，在单通道488激发下，用ES状态的无荧光的细胞对阴性细胞群进行定义，即用多边门框定阴性细胞，然后对诱导后的细胞样品上样检测。读取数据后，使用flowjor软件分析流式细胞仪所得数据，偏移出阴性细胞群的细胞所占比例则为诱导后阳性细胞的比例，即为诱导效率。

3、结果分别如附图2～5所示。

图2为通过绿色荧光蛋白检测Bend5稳定表达细胞系利用Activin A和bFGF双因子诱导两天形成EpiLCs的情况；根据GFP-Stella荧光信号，结果显示，Bend5表达加速Stella-GFP stem cell产生。

图3为通过促进EpiLCs诱导，Bend5促进Stella-GFP阳性细胞产生以及通过流式分析诱导效率情况。

图4为Bend5稳定细胞系经EpiLCs诱导2天后检测Blimp1、Stella和Bend5表达情况，Blimp1、Stella表达量均显著升高。

图5为Bend5稳定细胞系经悬浮PGC诱导7天后，Stella-GFP阳性细胞产生的情况，实验证实了Bend5可以促进PGCs形成。

实施例 3Bend5 促进 原始生殖祖样细胞机制研究

分别构建Bend5 野生型和缺失BEN结构域的Bend5，对Bend5促进原始生殖祖样细胞的机制进行研究。

1、实验方法

（1）EpiLC诱导和流式分析方法同实施例2。

（2）拟胚体诱导分化实验：消化干细胞后计数，用PBS重悬干细胞至约1000个细胞/μl。往low cell binding U botom 96 well plate（购于Nunc）的每个孔加入1000个细胞，补充100μl无LIF的ES培养基，移至培养箱中培养两天不扰动细胞。之后每天换一半的培养液。

（3）染色质免疫共沉淀：用1%甲醛将细胞（约1×10⁷）交联10min，然后用终浓度0.125M甘氨酸终止交联。将细胞置于包含50 mM的Tris（pH值8.0），10mM EDTA，1% SDS的缓冲液中裂解。用超声破碎的方法将DNA打断为200-800bp的片段。将Flag抗体（购于Sigma公司）或（Oct4 抗体 （购于Santacruz）或Tet1抗体（购于Active Motif））、磁珠蛋白A/G以及染色质在4℃过夜孵育。免疫复合物分别在低盐缓冲液、高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和TE缓冲液中各洗涤1次。将染色质和DNA复合物去交联，对富集的DNA样本进行纯化，并用Stella特异性引物来做定量PCR。

（4）蛋白质pull down实验：

在HEK293T细胞中共转染GST标签靶蛋白和不同标签的其他蛋白，转染48h后，收集细胞，用PBS洗涤一次，按照1：3体积比加入Lysis Buffer置于冰上30min裂解细胞，然后4℃，12000rpm离心10min，收集上清。首先去微量蛋白裂解液进行BCA蛋白定量（试剂盒），取等量的细胞裂解液用于Westernbloting检测转染标签蛋白的表达情况。确认蛋白表达无问题后，设置蛋白质pull down反应，每个反应取平衡过的10µl GST珠子加入细胞裂解液，4℃缓慢摇动孵育4h后，2000rpm 离心后弃上清，用wash buffer洗涤3～5次，5min/次。充分吸干溶液，然后加入2XSDS上样缓冲液，沸水煮5～10min后上样。Westernbloting检测蛋白的相互作用。

2、结果如附图6～13所示。

通过染色质免疫共沉淀实验检测，结果如图6所示，体外EpiLCs诱导后Bend5结合到Stella上游调控序列上。

通过流式分析实验检测，Bend5 野生型和缺失BEN结构域的Bend5 的EpiLCs诱导情况如图7所示，Bend5蛋白缺失BEN结构域会降低Stella阳性细胞的产生。

通过染色质免疫共沉淀实验检测，结果如图8 所示，缺失BEN结构域的Bend5不结合到Stella上游调控区。

通过蛋白质pull down实验检测，结果如图9所示，Bend5与Oct4相互作用。

通过染色质免疫共沉淀实验检测，结果如图10所示，Oct4能结合到Stella上游调控区。

通过蛋白质pull down实验检测，结果如图11所示，Bend5与Tet1相互作用。

通过染色质免疫共沉淀实验检测，结果如图12所示，Tet1能结合到Stella上游调控区。如图13所示，Bend5蛋白缺失BEN结构域后Tet1不结合Stella上游调控区。

Claims (10)

1.Bend5蛋白在提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞方面的应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Bend5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Bend5蛋白的一级结构包含一个Coiled-coil结构域和一个BEN结构域。

4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是Bend5蛋白在提高胚胎干细胞向类似外胚层样细胞分化和/或向原始生殖祖样细胞分化方面的应用。

5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Bend5蛋白能够激活Stella报告基因表达，从而促进胚胎干细胞向原始生殖祖样细胞的转变。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Bend5蛋白依赖其BEN结构域结合Stella基因上游区域激活Stella报告基因。

7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Bend5蛋白与Oct4和/或Tet1相互作用，在胚胎干细胞向类似外胚层样细胞分化过程中，Oct4和/或Tet1被招募到Stella基因上游区域，激活Stella基因表达，从而促进胚胎干细胞向类似外胚层样细胞的转变。

8. Bend5蛋白在制备能够提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞的药物或制剂方面的应用。

9. 一种能够提高胚胎干细胞诱导分化成原始生殖祖样细胞的药物或制剂，其特征在于，包含有效量的Bend5蛋白或Bend5蛋白激活剂。

10. Bend5蛋白或权利要求9所述药物在制备不孕不育症治疗药物中的应用。