CN105936936A - 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 - Google Patents
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105936936A CN105936936A CN201610464826.2A CN201610464826A CN105936936A CN 105936936 A CN105936936 A CN 105936936A CN 201610464826 A CN201610464826 A CN 201610464826A CN 105936936 A CN105936936 A CN 105936936A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- psa
- pollen
- kiwifruit
- pcr
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 title claims abstract description 60
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 claims description 3
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 241000202216 Pseudomonas avellanae Species 0.000 abstract description 9
- 241001487783 Pseudomonas syringae pv. theae Species 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012804 pollen sample Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 5
- 101150005255 hrpW gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract 1
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 101100339667 Pseudomonas syringae pv. syringae hrpW gene Proteins 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 241000589626 Pseudomonas syringae pv. tomato Species 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100022434 Homo sapiens MVB12A gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038747 Multivesicular body subunit 12A Human genes 0.000 description 1
- 101100445860 Saccharum hybrid CFBP gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 1
- 235000003784 poor nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，提取花粉混合菌悬液DNA，用根据猴桃Psa的hrpW基因设计两对引特异性引物，进行巢式PCR，从花粉样品中扩增获得大小为590bp左右的外引物扩增和240bp左右的内引物扩增条带，经测序验证为Psa，本发明检测灵敏度为103cfu/mL，本发明建立了特异性更强、稳定性更高、灵敏度较高的Psa快速检测方法，不仅能够区分Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae等与Psa亲缘关系较近的病原菌，也能区分致病能力弱的Psa，减少了假阳性的出现。
Description
技术领域
本发明涉及果蔬病害检测技术领域，具体涉及一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法。
背景技术
近年来猕猴桃溃疡病(kiwifruit bacterial canker)的大面积爆发导致猕猴桃产量下降，严重影响产业发展。猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syingae pv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害。病原菌借助昆虫、风雨等自然条件，自主侵染猕猴桃植株的嫩芽、枝条的落叶痕、新生的分叉、叶片的皮孔、气孔等或营养较差的以上组织，随后扩散入果树各枝蔓造成整棵植株染病；或通过修剪伤口、冻裂伤口进行传播。
Gallelli.A等(2011)通过分子检测技术发现意大利的猕猴桃花粉中存在溃疡病病原菌；Stefani.E等(2011)也从花粉中检测到Psa的存在，认为花粉是导致猕猴桃溃疡病传播的主要原因之一，新西兰学者认为新西兰目前大规模流行的PSA-V(强致病力菌株)病原菌是由于进口国外带菌花粉而引进的。Psa的检测主要是采用传统的检测技术，但传统方法费时费力，而且特异性不高。近几年一些基于PCR的分子检测方法已经建立起来，这些分子检测方法更加快速，而且特异性更高。但由于Psa与其同属的(Pseudomonas syringae pv.Theae)及(Pseudomonas avellanae)亲缘关系非常近，常规的分子标记技术很难将它们区分开，而且Psa本身的遗传多样性也非常丰富。世界Psa主要分为三大类群，我国流行的猕猴桃溃疡病的Psa与最近在意大利、新西兰、西班牙、法国、葡萄牙等主要猕猴桃园流行的Psa为同一类群。通过一些学者的研究发现使用普通PCR检测Psa易出现假阳性或假阴性。由Psa引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害，一旦果树发病没有有效的药剂可以医治。因此研究出花粉中Psa的检测方法，对控制猕猴桃花粉中Psa的传播具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，降低检测成本，提高检测效率。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，包括以下处理步骤：
a)根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)进行猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA；
d)进行巢氏PCR扩增；
e)对PCR产物进行电泳检测。
进一步，所述步骤a)巢氏PCR引物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因的保守序列设计的，外引物、内引物的扩增长度分别为590、240bp。
进一步，所述步骤b)猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
进一步，所述的步骤c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增体系为：总体积25μL，其中2×PCR Master12.5μL，10μmol/L的上游引物1μL，10μmol/L的下游引物1μL；DNA模板1μL；ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增程序为：首先94℃变性5min；其次进行35个循环反应，包括94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
进一步，所述的步骤e)PCR产物电泳检测方法为：PCR反应结束后，取5μLPCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，选用2000bp DNA Marker；电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min，电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
根据猕猴桃优势Psa的hrpw基因设计巢氏PCR引物，进行检测能区分与Psa亲缘关系非常近的Pseudomonas syringae pv.Theae及Pseudomonas avellanae，减少假阳性的出现；巢氏PCR扩增既能增强检测的特异性，也能增强检测的灵敏度；猕猴桃花粉Psa的培养富集仅需4-12h，加上巢氏PCR扩增，检测时间只需要18h，而常规的Psa培养鉴定检测需要3-7天；花粉菌悬液中Psa DNA的提取采用热裂解法，不仅可以降低检测成本，而且可以实现大量样本同时操作，大大提高检测效率。
附图说明
图1是陕西猕猴桃Psa及相近病原菌hrpW基因巢式PCR扩增电泳图；
图2是猕猴桃Psa检测灵敏度电泳图；
图3是猕猴桃花粉Psa巢式PCR外引物扩增检测电泳图；
图4是猕猴桃花粉Psa巢式PCR内引物扩增检测电泳图
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明猕猴桃花粉中Psa快速检测的方法，具体包括以下处理步骤：
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，猕猴桃花粉Psa的富集培养，提取花粉混合菌悬液的DNA，用巢氏PCR扩增，PCR产物电泳，外引物扩增出现590bp条带、内引物扩增出现240bp条带为阳性。
进一步，具体包括以下处理步骤：
a)根据陕西猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)花粉菌悬液中Psa DNA的提取；
d)巢氏PCR扩增；
e)PCR产物电泳检测。
以下通过具体实施例和对比例对本发明内容和效果进行说明。
实施例一
猕猴桃Psa巢氏PCR检测方法建立
(1)猕猴桃Psa及Pseudomonas syringae pv.tomato、Pseudomonas syringaepv.Theae、Pseudomonas avellanae培养：猕猴桃Psa用King’B液体培养基培养，
(2)病原菌DNA提取：采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取目的DNA。
(3)引物设计：根据陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因设计两对引物，外、内引物扩增参考序列分别为590bp、240bp。
猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
(4)扩增体系：总体积25μL，其中2×PCR Master 12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL；DNA模板1μL；Sterilized ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
(5)巢氏PCR扩增程序为：94℃、5min，(94℃、10sec，55℃、30sec，72℃、1min)35个循环。72℃、0min，4℃保温。
(6)电泳检测：PCR反应结束后，取5μL PCR产物点样于1％琼脂糖凝胶中Du-Red核酸染料染色。电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min。电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。
(7)PCR产物测序：PCR阳性扩增产物，送至上海生物工程有限公司进行测序，样品均采用双向测序以减少误差。将测序结果用DNAMAN生物软件对序列进行校正，并在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLAST工具检索同源性。
结果见图1、表1。图1中：泳道1、2、3、4为外引物扩增Psa、Pseudomonassyringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外引物扩增为阳性；泳道6、7、8、9为内引物扩增Psa、Pseudomonassyringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外引物扩增为阳性。由图1可知，猕猴桃Psa DNA巢氏PCR扩增，可以扩增出590bp、240bp条带，与预期条带大小一致，而Pseudomonas syringaepv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae DNA进行巢氏PCR，不能扩增条带。进一步将猕猴桃Psa DNA外引物扩增PCR产物测序结果在NCBI中通过BLAST工具检索同源性，结果如表1，表明陕西猕猴桃Psa hrpW与数据库中猕猴桃Psa hrpW同源性为99％，而与Pseudomonas syringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae同源性在90％以下，因此所建立的方法可检测陕西猕猴桃Psa，并可以区分Pseudomonas syringaepv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae。
表1扩增产物序列与目标序列同源性
注：CP011972.1、HE793307.1、FR734164.1、AF232004.3、FR734165.1、AJ842305.1为GenBank中PsaICMP18884株、PsaOMP-BO 4252.A,1株、Psa ISF 8.57株、Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000株及Pseudomonas syringae pv.theaeCFBP 4097株、Pseudomonas avellanaehrpW基因序列号。
实施例二
猕猴桃Psa PCR检测的灵敏度
挑取Psa单菌落于100mL无菌King’s B液体培养基中，牛皮纸封口，24℃，200r/min培养16h，获得菌悬液。用血细胞计数板测定菌悬液浓度，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度梯度分别为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL，分别提取DNA，进行PCR扩增，研究菌悬液中Psa的检测限，确定该方法检测灵敏度。
由图2可知：泳道1-7：检测菌悬液浓度依次为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL，目的条带随着Psa菌悬液浓度的降低，依次变暗，当浓度降低为103cfu/mL时，条带微弱，依然能检测到Psa，但当浓度为102cfu/mL、101cfu/mL时没有条带，说明浓度低于103cfu/mL的菌悬液检测不到目的条带。因此，本试验中Psa的检出限为103cfu/mL，灵敏度较高。
实施例三
猕猴桃花粉Psa PCR检测
(1)猕猴桃花粉Psa的培养：分别取已制备好的猕猴桃花粉0.01g，对应加入编号1-23含有15mL已高压灭菌并冷却的King’B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口。于恒温震荡培养箱中24℃，180r/min培养12h后，获得混合菌悬液。4℃保存待用(只可短时保存)。
(2)菌悬液中Psa DNA的提取：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体。加入1mLddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液。重复洗涤一次。取100μLddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
引物设计、PCR扩增体系、扩增条件、电泳检测同实施例一(4)、(5)、(6)。扩增结果如图3、图4，图3中泳道1、12：阳性对照；泳道2、11：阴性对照；泳道3-6为花粉样品8、9、20、22外引物扩增结果；泳道7-10为花粉样品8、9、20、22内引物扩增结果。图4中泳道1为阳性对照组，泳道2-24为猕猴桃花粉样品(对应花粉编号为1-23)，其中泳道9、10、21、23的Psa检测为阳性(对应花粉编号8、9、20、22)，其余均为阴性。
图3和图4，23个花粉样品中有4个样品扩增得到550bp左右的外引物扩增条带和240bp左右的内引物扩增条带，分别与预期扩增片段及阳性对照组扩增片段大小一致，可确定8、9、20、22号花粉样品中均含有Psa。
Claims (7)
1.一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于包括以下处理步骤：
a)根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
b)进行猕猴桃花粉Psa的培养富集；
c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA；
d)进行巢氏PCR扩增；
e)对PCR产物进行电泳检测。
2.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述步骤a)巢氏PCR引物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因的保守序列设计的，外引物、内引物的扩增长度分别为590、240bp。
3.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述步骤b)猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为：称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24℃、180r/min培养12h后，4℃保存待用。
4.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取1mL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11,000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；将收集的菌体加入1mL灭菌ddH2O反复吸打，洗涤菌体，11,000rpm离心1min，弃上清液，重复洗涤一次，取100μL灭菌ddH2O，反复吸打，溶解沉淀，于100℃水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心1min，取上清液，-20℃保存备用。
5.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤d)巢氏PCR扩增体系为：总体积25μL，其中2×PCR Master 12.5μL，10μmol/L的上游引物1μL，10μmol/L的下游引物1μL；DNA模板1μL；ddH2O 9.5μL；其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。
6.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤d)巢氏PCR扩增程序为：首先94℃变性5min；其次进行35个循环反应，包括94℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
7.如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于：所述的步骤e)PCR产物电泳检测方法为：PCR反应结束后，取5μL PCR产物点样于1％的琼脂糖凝胶中，选用2000bp DNA Marker；电泳选用1×TAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min，电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610464826.2A CN105936936A (zh) | 2016-06-22 | 2016-06-22 | 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610464826.2A CN105936936A (zh) | 2016-06-22 | 2016-06-22 | 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105936936A true CN105936936A (zh) | 2016-09-14 |
Family
ID=56872809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610464826.2A Pending CN105936936A (zh) | 2016-06-22 | 2016-06-22 | 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105936936A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109187673A (zh) * | 2018-10-24 | 2019-01-11 | 杭州电子科技大学 | 一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法 |
| CN110904252A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-24 | 中国科学院武汉植物园 | 一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法 |
| CN111057741A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 安徽农业大学 | 一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法 |
| CN118421815A (zh) * | 2024-07-02 | 2024-08-02 | 西北农林科技大学深圳研究院 | 一种猕猴桃花粉中活的Psa检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104056288A (zh) * | 2013-03-01 | 2014-09-24 | 津金果有限公司 | 清除植物材料上的微生物的方法 |
| CN105296393A (zh) * | 2015-11-03 | 2016-02-03 | 中国科学院武汉植物园 | 一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法 |
-
2016
- 2016-06-22 CN CN201610464826.2A patent/CN105936936A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104056288A (zh) * | 2013-03-01 | 2014-09-24 | 津金果有限公司 | 清除植物材料上的微生物的方法 |
| CN105296393A (zh) * | 2015-11-03 | 2016-02-03 | 中国科学院武汉植物园 | 一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A. GALLELLI等: "Real-time and qualitative PCR for detecting Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolates causing recent outbreaks of kiwifruit bacterial canker", 《PLANT PATHOLOGY》 * |
| ANGELA GALLELLI等: "Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae, causal agent of bacterial canker of kiwifruit, from symptomless fruits and twigs, and from pollen", 《PHYTOPATHOL. MEDITERR.》 * |
| E. BIONDI 等: "Pseudomonas syringae pv. actinidiae detection in kiwifruit plant tissue and bleeding sap", 《ANNALS OF APPLIED BIOLOGY》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109187673A (zh) * | 2018-10-24 | 2019-01-11 | 杭州电子科技大学 | 一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法 |
| CN110904252A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-24 | 中国科学院武汉植物园 | 一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法 |
| CN111057741A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 安徽农业大学 | 一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法 |
| CN118421815A (zh) * | 2024-07-02 | 2024-08-02 | 西北农林科技大学深圳研究院 | 一种猕猴桃花粉中活的Psa检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113801804B (zh) | 一株香蕉枯萎病生防拮抗菌株及其应用 | |
| CN101880720A (zh) | 甘蔗黑穗病菌快速检测方法 | |
| CN105936936A (zh) | 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法 | |
| CN102586469B (zh) | 用于检测辣椒疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒 | |
| WO2021218206A1 (zh) | 一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法 | |
| CN111321242A (zh) | 橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用 | |
| CN102161996B (zh) | 枣树抗坏血酸过氧化物酶基因及其在提高植物抗逆性中的应用 | |
| CN102399896A (zh) | 一种用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法 | |
| CN104131007A (zh) | 一种金针菇川黄菌种的ssr标记指纹图谱与应用 | |
| CN105506124A (zh) | 金针菇f101菌种的ssr标记引物及其指纹图谱应用 | |
| CN104830698A (zh) | 一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法 | |
| CN105296393A (zh) | 一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法 | |
| CN114686609B (zh) | 一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用 | |
| CN106591145A (zh) | 一种从三叶青块根中分离的小不整球菌ef01及其应用 | |
| CN105755157A (zh) | 一种水稻稻瘟病菌的pcr检测引物组及其检测方法 | |
| CN104846064B (zh) | 一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法 | |
| CN106282386A (zh) | 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法 | |
| CN118581268A (zh) | 一种检测苹果轮纹病抗性的分子标记及其应用 | |
| CN1284864C (zh) | 用于检测梨火疫病菌的一步双重pcr方法 | |
| CN101509036B (zh) | 亚洲梨火疫病菌的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104450868A (zh) | 黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量pcr检测技术及应用 | |
| CN113981132B (zh) | 一种木贼镰刀菌的检测方法及其应用 | |
| CN105018612A (zh) | 一种大蒜病毒的定量检测方法 | |
| CN108179207A (zh) | 用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的pcr引物和方法 | |
| CN104293957A (zh) | 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160914 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |