CN105899947A - 分析测试装置、试剂盒和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析试验装置，和用于监测、感测、阅读和显示结果的方法和试剂盒，通过使用具有诸如电池、阅读装置和其它电路的印刷电子元件的装置和/或通过使用将敏感指示剂pH染料用于测试的比色工具，或通过两者。
Description
发明领域
本发明涉及分析测试装置、试剂盒和使用测试装置以感测、监测、区分读数及显示装置打算测试的结果的方法。先前的装置已经可以用来检测或监测样品中以非常低浓度存在的痕量的化学和/或生物靶标，所述样品包括但不仅仅是生物样品、材料、有机或无机样品。痕量的化学和/或生物靶标可以包括生物/化学产品、片段或整个目标，例如核酸序列、细胞、病毒、病原体、化学品，具有在诸如药物基因组学、病原体检测和监测、遗传倾向确定、用于临床试验的遗传分类、诊断学、预测学、传染性疾病的诊断学和监测、生物防护、法医分析、亲子鉴定、动植物育种、食品检测、人体鉴定、基因改造的生物体测试、化学污染、食品安全、生产链的监测和追踪以及产品在线监测/控制领域在关怀/地点/兴趣(in point ofcare/site/interest)和实验室中的应用。
本发明通过方法的组合实现。一种方法是通过使用印刷电子元件来感测需要测量的变化，诸如pH值。测量反应变化的另一种方法是通过使用由使用印刷电子元件检测的比色介质(表明颜色变化或变得可见的颜色中的变化)，作为检测结果的方法中的一种。此外，使用印刷电子元件传感器在集成单元上显示测量结果。
现存的一些装置是例如横向流动装置和在诊断分析中使用它们的方法。US SN14/345,276通过全文引用并入本文。US SN 14/345,276公开的方法和装置对于检测或监测在提供的样品中以非常低浓度存在的诸如化学、生物和材料靶标的靶标是有用的。然而，US14/345,276的方法和装置没有利用本发明的方法、装置和试剂盒。
除了横向流动装置外，本发明可以使用纸上的微流体燃料电池。
到目前为止，印刷电子元件已经用于不同的技术领域。然而，本发明的装置的显示方面第一次使用印刷电子元件来显示测试的结果。这些印刷电子元件包括至少一种印刷电路显示器和/或印刷形式的电池。同样已经确定感测监视器、差分阅读单元和/或显示单元倾向于具有印刷形式的电子元件。为了读取打算通过装置测量的结果，这些诸如电路、显示器和电池的电子元件全都位于诸如但不限于横向流动装置的医疗装置上。
印刷电子学是通过使用通常的印刷设备用于在不同的基底上产生电子装置的印刷方法。将图案印刷在材料上，诸如丝网印刷、柔版印刷、凹版印刷、平版印刷和喷墨印刷，因为这些是典型地低成本过程。然后在基底上使用电子功能的电子或光学墨水，产生诸如薄膜晶体管或电阻器的主动或被动装置。
术语印刷电子元件意思是其中一种(或多种)墨水包含基于碳的化合物的有机电子元件或塑料电子元件。相反地，印刷电子元件，指定过程，以及服从于选定的印刷过程的特定要求，可以利用任何基于溶液的材料。这包括有机半导体、无机半导体、金属导体和纳米颗粒等。
为了制备印刷电子元件，几乎使用了所有的工业印刷方法。
印刷最重要的好处是低成本。较低的成本使得能够用于更多的应用中。一个实例是RFID系统，其使得能够在贸易和运输中非接触式识别。同样，印刷在柔性基底上允许电子元件放置在弯曲表面上。
本发明进一步涉及诊断法、基因测试、血统和品种选择测试、基因改造生物体测试、病原体检测、基因分型、突变检测、用于处方或临床治疗的伴侣基因测试、癌症类型检测、癌症的监测和预后。基因测试已经广泛用在临床应用、食品工业、法医测试、人体鉴定、病原体流行性监视和新疾病菌株的检测。这种基因测试覆盖了涉及分析物中核酸检测和鉴定的一系列技术。实例包括DNA测序、实时聚合酶链式反应(PCR)、DNA微阵列和限制性片段长度多态性(RFLP)为例。本发明提供用于进行此类测试的改善的方法，或通过使用印刷电子元件或在使用染料pH指示剂的系统中或两者皆有。
用于检测通常以微量形式发现的核酸的传统方法需要多种装置和步骤来处理样品、扩增目标物和检测扩增物。核酸(DNA或RNA)的扩增已经很好地建立，并且目前存在各种用于不同分析需要的方法。即使使用检测的电信号来监测PCR的核苷酸插入的现有反应方法也不使用本发明的印刷电子元件或比色方法(参见US 788,015B2和US 8,1 14,591B2)。
基于基于热循环的聚合酶链式反应(PCR)的扩增已经显示出在检测核酸及诸如拷贝数变化或单核苷酸多态性的基因变化中是可靠的。这一方法已经很好地建立，因此它常常是用于诸如临床和法医应用的需要非常多规则的应用的标准方法。不论什么核酸扩增方法，除可视化的方法之外，扩增产物是不可检测的。现在的核酸可视化方法涉及将荧光探针附加到扩增反应中。这些探针包括在Taqman检测寡核苷酸和双链DNA螯合剂中的荧光标签、Sybr Green或对反应产物敏感的其它荧光化学品。荧光化合物在这种类型的检测中是必需的，因为荧光分子发射大量的质子，并且发射只有在荧光产物存在时才可检测。当Taqman检测寡核苷酸的荧光探针杂交到扩增产物并且被DNA聚合酶切开或Sybr Green螯合到扩增产物时，发射才会发生。
然而，这些荧光化合物对曝光敏感或需要诸如冷藏的特殊储存条件。暴露于外界光中对荧光化学品造成不可逆的损害，这种现象称作光漂白。对于任何荧光方法，任何发射的发生也需要激发光源。通常使用UV光源作为激发光源来激发荧光探针以产生可测量的光发射。一个实例由PATH,Seattle,USA的Paul LaBarre(PloS One V6,第6期,el 9738)公开，通过引用将其全文并入本文。当扩增产物焦磷酸盐释放荧光化学品使其不被淬灭时，荧光发射成为可能。需要UV光源并且由手持UV LED提供。光的强度取决于产物的量以及外界光条件。在将未知样品与阳性对照和阴性对照比较的情况下，单一的UV LED将不能够为全部三个样品提供均匀照明。在没有仪器帮助时，难以区分阳性反应和阴性反应。另一扰动源是来自荧光染料的不一致发射。因为发射依赖于两金属离子结合之间的交换，该交换是二级反应而非扩增反应，它受到来自于通常存在于EDTA血液或其它操作变动中的其它金属螯合剂的干扰。
样品会抑制或妨碍荧光读数的另一个实例是当溶液不是透明溶液时，诸如当样品是未处理的全血。没有精密仪器，几乎不可能处理体积少于1微升的样品。虽然大部分核酸反应在50微升以下，更普遍地在25或10微升进行，当样品是浑浊或严重有色时，荧光方法严重受限。反应前需要大量稀释或纯化步骤。
用于检测核酸的扩增方法使用pH敏感系统直接测量氢离子而非使用荧光染料。这是通过利用具有离子敏感效应晶体管(ISFET)传感器的CMOS芯片技术完成的["A pH-1SFETbased micro sensor system on chip using standard CMOS technology,"("一种使用标准CMOS技术的位于芯片上的基于pH-1SFET的微传感器系统,")Haigang Yang等，Systems-On-Chip for real-time appliction,Proceeding of the FifthInternational Workshop,2005]。氢离子传感层是CMOS芯片顶层的氮化硅。这项技术导致了成本效益好的核酸分析。对于任何CMOS芯片，电气性连接是必需的，而且需要芯片的特殊包装以允许测量和扩增反应。因此，该方法昂贵且具有挑战性。它昂贵是因为与任何CMOS芯片的设计和生产都相关的高成本。它具有挑战性是因为至少两个原因：1.来自通过针孔或小包装缺陷的扩增液泄漏的短路风险，和2.在例如氮化硅的传感层和反应组分之间的强烈干扰风险。因为这些挑战和担忧，对于成本效益好且简单的基因测试，并非理想的解决方案。
因此本发明也涉及到在核酸扩增存在时产生可读的电子数据集或产生颜色差异的新的方法，装置和试剂盒。对于任何反应，在反应后保持反应容器安全密封是至关重要的。这是为了防止其它进一步的反应被之前扩增的核酸污染。在向反应中加入样品核酸之后，用于检测或反应的任何必需组分应该与扩增试剂一起密封。尽管已知核酸扩增会产生pH值下降，但是却不知道如何能在没有仪器的帮助下进行pH值依赖的核酸扩增，诸如检查正确的起始pH值和相应地执行必要的调整。也不知道如何能进行诸如聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增反应而不使反应受到额外的染料组分的抑制。例如，在标准PCR反应中，在扩增试剂中总是包含10mM Tris或更高浓度。在当前的方法中，总缓冲液容量应该限制在5mM以下或优选地2mM以下或优选地1mM以下，以致于pH值变化不被缓冲液抑制。
另一个与pH染料相关的问题是染料抑制扩增反应。pH指示剂染料，诸如溴百里酚蓝在1mg/mL的浓度时产生优良的颜色强度，但是它完全抑制LAMP反应。当在核酸扩增方法中使用可溶染料时，限制染料与扩增组分的接触是至关重要的。这可通过稀释或通过限制分子接触表面积完成。通过稀释，限制染料的浓度以致于干扰最小。在更优选的方法中，染料应是不溶的，并且染料存在于与扩增试剂接触的固相中，以致于染料与扩增试剂的分子接触表面积大幅减少。
在扩增中，在没有额外的tris缓冲液存在时，提供稳定的起始pH值是可能的。如果容器保持密封，反应中染料的颜色能很多天不改变。
依赖于Mg离子浓度和扩增的起始pH值，扩增后的pH值变化或是阳性或是阴性。因此，控制起始pH值很重要。然后通过加入弱缓冲组分或加入酸/碱来调整而设定起始pH值。当pH染料与扩增试剂预混合时，则更容易在不需要pH计时知道起始pH是否正确。
由于染料组分可溶或存在于与反应接触的固体表面，因此对反应室的形式没有限制，而ISFET则相反。为了可视化阅读，容器的至少一部分不是完全不透明的以允许观察。整个过程与任何柜台上的反应小瓶相匹配而不需要设计专有的反应盒，诸如Cepheid的Xpert或BioFire的生物膜阵列的情况。
发明背景
已经使用分析测试来分析测试样品，尤其是用于此类用途的横向流动装置已经用在即时测试应用中，因为它们使用简单并且使用相对便宜。参见US SN 14/345,276，通过引用将其全文并入本文。这些已建立的可读装置通常依赖于诸如金、乳液或荧光的有色颗粒以当分析物与有色颗粒接触时变得可见。使用者观察得到产生的颜色。这样，可能因为使用者对有色模式的解释而存在对如何解释结果的不一致。
为了帮助缓解颜色模式的这一潜在解释，已经开发了数字横向流动分析仪，其中单独的电子阅读器在横向流动膜测试区上扫描和阅读无论是颜色或荧光的模式。这种类型仪表的实例包括ESEQuant横向流动免疫分析阅读器和IDEXX实验室的SNAPshot Dx分析器。
市售的一些这种类型的装置具有与它们用途相关的固有问题。例如，卡式阅读器的方法使得这类装置变得昂贵。在大多数这种情况下，可将一次性仪表整合入横向流动装置的流动中。一种此类装置是Clear Blue验孕装置，其中可光学感测反应区域的有色线以监测线的出现。这种类型的装置具有两个横向流动分析(LFA)条，具有诸如光学传感器、处理器、LCD(液晶显示器)和电池的合适的电子元件的印刷电路板(PCB)。这种类型测试装置使用LFA检测怀孕标记hcG。一个LFA是校准控制而另一个是检测条。
不幸地，这些类型的装置相当浪费，因为电子元件在仅使用一次后就被丢弃。此外，此类装置的制造需要许多步骤，因此增加了成本。因此，需要其中此类装置更容易生产并且不是仅使用一次后就丢弃的装置。
例如，诸如聚合物和其它分子的导体和半导体材料如今已用在电子元件阵列中。此类用途包括移动服务中的显示器，在此类装置中使用有机电子元件(和无机电子元件)代替传统电子元件。
使用电子元件的一个实例是射频识别(RFID)，但是仍在寻求开发加上记忆输入一起的快速开关晶体管和100KHz频率的天线。有机晶体管可能是为表面提供电子元件以用于诸如测试分析的用途的解决方案。
对纸加入有机电子元件缓和错误读数问题、伪造、破坏和安全问题。
本发明克服这一技术缺点的一种方法是利用对晶体管使用和其它使用均兼容的电子墨水材料。本发明提供与调节电荷输送的材料系统一起使用的一种机制或开关现象，用在显示器中以及也用于能量存储或转化。
因为纸是人类制造的最多的生产产品，因此它是用于待使用的有机/无机电子元件的合理基底。纸可以减少许多途径和材料沉积步骤的使用，形成本发明的基础。
印刷技术包括基于薄片的印刷和基于卷轴式的印刷。基于薄片的喷墨印刷和丝网印刷通常用于低容量、高精度的工作。凹版印刷、平板印刷和柔版印刷也用于高容量生产。然而平板印刷和柔版印刷主要用于无机和有机导体，凹版印刷特别适用于质量敏感层。通过大规模印刷方法的手段制备有机场效应晶体管和集成电路。
也使用丝网印刷用于制作电子元件，由于具有从膏糊状材料生产有图案的厚层的能力。
气溶胶喷射印刷是利用印刷电子元件的另一种方法。气溶胶喷射印刷开始于墨水的雾化，其可加热至80℃，产生直径1-2微米级别的液滴。雾化的液滴夹杂在气体流中并被递送至打印头。
与印刷类似的其它方法包括微触电印刷和纳米压印平板印刷也是有用的。此处，通过类似于分别以软、硬形式冲压的方法分别制备μm和nm尺寸层。常常以减法的方式制备实际结构，例如，通过蚀刻遮蔽物沉积或通过剥离方法。例如可以制备用于OFET的电极。
使用有机和无机材料用于印刷电子元件。墨水材料必须是以例如溶液、分散液或悬浮液的液体形式可用的，并且它们必须起到导体、半导体、电介质或绝缘体的功能。
有机印刷电子学整合了来自印刷、电子学、化学和材料科学，尤其是来自有机和聚合物化学的知识和开发方案。在结构、操作和功能方面，有机材料在某种程度上不同于传统电子元件，其影响装置和电路设计及最优化，以及制造方法。
共轭聚合物的发现以及它们发展成可溶材料提供了第一种有机墨水材料。来自于这一类的聚合物拥有导电性、半导电性、电致发光、光电和其它性能。
有机半导体包括掺杂有聚(苯乙烯磺酸盐)的导电聚合物聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(poly(3,4-ethylene dioxitiophene))(PEDOT:PSS)，和聚(苯胺)(PANI)。这些聚合物以不同配方可商购获得并且已经分别使用喷墨、丝网和平板印刷，或丝网、柔版和凹版印刷来印刷。在传感技术2011第五届国际会议标题为“基于阻抗测量具有聚苯胺层的柔性pH传感器(Flexible pH sensor with polyaniline layer based on impendance measurement)”呈现的摘要中公开了通过阻抗变化利用聚苯胺层用于感测pH值变化的柔性传感器的使用。
无机电子元件提供高度有序的层和界面。
银纳米颗粒与柔版、平板和喷墨一起使用。金颗粒与喷墨一起使用。
其它重要的基底标准是低粗糙度和合适的可湿性，其可在处理前调整(涂覆、电晕)。与传统印刷相反，高吸光率通常是不利的。
发明概述
本发明的目标之一是通过利用印刷电子元件来提供医疗测试装置分析、装置和试剂盒，其中装置的电子系统部分是通过使用有机半导体材料或无机材料印刷。
本发明提供功能性化学/有机场晶体管作为传感器。此外，本发明提供功能性可印刷检测电路作为控制器，以及可见形式的结果阅读器。
此外，本发明提供通过使用根据可程序化间隔计时器(PIT)水平改变导电性的可印刷组分和材料来测量PIT的传感器装置。
在本发明中有用的有机材料包括如聚苯胺、聚(3-己基噻吩)、并五苯、聚三芳胺、5',5-二-(7-十二烷基-9H-芴-2基)-2,2'-双噻吩、聚乙烯、萘二甲酸酯和/或聚(4,4'-二癸基双噻吩-共聚-2,5噻吩并[2,3-b]噻吩)(poly(4,4'didecylbithiopene-co-2,5-thieno[2,3-b]thiophene))的此类材料。在本发明中有用的无机材料包括五氧化钽、氯化银、银浆、硅、二氧化硅、氮化硅、氧化铝和/或其它矿物半导体、金属和金属氧化物。此外，纳米颗粒、纳米管和/或石墨烯在本发明是有用的。
本发明的另一目标是包括通过印刷方法制造的本发明的晶体管、电阻器、电容器、二极管、内部连线和其它相关电子元件。在本发明中是有用的印刷方法包括原子层沉积、气相沉积、喷墨印刷、卷轴式印刷和/或丝网印刷。
此外，因此本发明的另一目标提供通过利用高容量输出系统来印刷这些组件的新方法。例如，基于墨水的卷轴式印刷可以印刷数百万的本发明的电子组件，因此削减了制造成本并简化了这些装置的总体使用。
此外，本发明具有重量轻的优势并且给组件提供了增强的柔性。柔性传感器提供了与此类装置的横向流动条良好接触，但是它避免了对任何此类装置的膜结构的潜在损害。此外，因为印刷电子元件的实际重量比通常的印刷电路板(PCB)组件(这些包括印刷电路板和诸如封装的逻辑和记忆芯片、电阻器、电感器和电容器的分立元件)更小，更好地保护横向流动条免受潜在的损害。
本发明将传感器整合成诸如在薄片上的单一系统。如此，可通过整合电化学转变以悬浮期望的特定物质来构造单次使用系统。此外，本文提供了随后可被放大和甚至进一步被解码以潜在地显示数值的任何电子信号。
因此本发明包含以无需使用许多组件形式印刷的可印刷的电子传感器系统、晶体管、感应晶体管、控制电路、信号处理电路、显示电路、和任选地电池。
本发明的一个实施方案是用以监视的印刷的逻辑电路和在一段时间内来自传感器的电信号。
因此，用于实施本发明方法的另一个实施方案是pH指示剂方法，其中例如核酸、扩增物的样品流动通过位于基底上的微流体通道，并且当它流动时，沿着通道的长度连续穿过适合于连续重复的基底(substrate)或基底(base)中提供的温度区。pH指示剂染料可以并入所有PCR和本文描述的诸如横向流动装置的其它实施方案中。当使用这种方法、装置和/或试剂盒时，观察的解读是颜色变化、在最初未发现线的地方出现线或其它图案，在白色背景上出现线或线消失以指示阴性结果，以及指示反应结果解读的其它观察。
虽然上文一般说明为达到热循环设计的PCR系统，多种等温核酸扩增技术是已知的，例如单链置换扩增(SDA)，并且可同样依照本发明监测使用此类技术的DNA或RNA扩增。
本发明的一个目标是提供至少一种在与样品混合前与扩增试剂混合的pH指示剂染料。当加入样品后有扩增反应时，pH值变化导致pH指示剂染料的颜色变化。当染料固定于能透过氢离子而不能透过DNA聚合酶或核酸的固体基质时，通过肉眼更容易看到颜色变化。因为差别渗透性，通过增加固体基质中的染料浓度来增加光强度而不增加抑制反应的风险是可能的。pH指示剂可以是颗粒或固定于颗粒上。颗粒尺寸不受染料或颜色选择的限制。颗粒尺寸只与反应容器或条件的选择相关。染料也可以固定在膜上或容器表面，使得对扩增反应的干扰最小化。
本发明的另一个目标也是提供用于检测或监测例如核酸扩增反应的pH敏感染料。染料可在溶液中、在诸如珠子或条的三维物体上，或在容器或隔间里或其组合。
可有利地使用珠子的用途。珠子是由例如二氧化硅、聚苯乙烯、琼脂糖或葡聚糖的任何适合于染料附着的材料合成的球形颗粒。可使用核-壳结构合成颗粒，因此可由顺磁性材料和染料水凝胶形成颗粒。例如二氧化硅的珠子具有较高的密度，如此容易保持珠子在溶液中的恒定位置或通过反转反应小瓶将珠子从溶液中移出。
本发明也具有比色感测的有利用途，作为通过在溶液中或固定于诸如在珠子里的一种或多种3D结构上使用pH敏感染料来显现这些分析结果的一种方法。同样，该系统可发生在反应室或容器中，可使用上述的组合。
因此，本发明的另一个目标是提供产生可通过印刷电子装置或比色机制观察的pH或视觉信号的横向流动平台。由至少三种或更多种方法组合来实现该目标。一种方法是通过使用由印刷电子光电导体检测的比色介质(改变颜色或变得可见)。另一种方法是通过导致不同电压输出的印刷电子传感器(当传感器暴露于不同pH时记录变化)；和使用导致在集成显示单元上显示结果的印刷电子传感器(当传感器暴露于不同pH时记录变化)。在初始基线和一段时间内获取读数。然后，记录变化和用受化学或生物反应影响的阈值pH值变化制成观察报告。
在本发明的装置的优选实施方案中，传感器是离子敏感场效应晶体管(ISFET)。使用这种ISFET来感测PIT和监测pH值。OFET(有机场效应晶体管)也是有用的。
因此本发明的另一目标是提供产生通过印刷电子装置观察的pH或视觉信号的核苷酸检测平台(定量的和/或定性的检测)。在这个平台上使用的扩增方法是等温或PCR等，并且通过下面三种方法或更多种组合实现：
1)通过印刷电子光电导体检测颜色度量介质(诸如pH染料)(改变颜色或变得可见)；2)导致不同电压输出的阻抗印刷电子传感器(当传感器暴露于不同pH值时阻抗变化)；和/或3)导致在集成显示单元上显示结果的阻抗印刷电子传感器(当传感器暴露于不同pH值时阻抗变化)。
在本发明的ISFET的实施方案中，该装置具有印刷为差分测量的电路以监测在对照区、测试区和背景区之间发生了什么活动(见图1)。
本发明的可选择的特征使用包含安装到柔性基底或印刷电路板上的柔性传感器组件和ASIC芯片的混合方法。
附图简述
图1：该图提供了用于测量在测试区传感器(ISFETl)和背景区传感器(ISFET2)之间的信号差异的基本差模电路，控制区是ISFET3。
图2：在测试区监测pH值变化的本发明的设计。
图3：通过颜色变化监测的酶依赖性pH值。
图4：本发明的pH指示剂，其中1是样品垫，2是结合垫，3是层析膜，4是测试线，5是对照线，6是吸收垫，以及8是支撑材料。
图5A：该图代表利用单独组件的先前系统。图5B：该图代表仅用几个印刷步骤制造整个系统的材料的使用。
图6.对应于pH值范围的每个染料薄膜的颜色。
图7.照片阐明了pH薄膜在针对2C19基因型分型的LAMP反应中的颜色反应。
图8.以薄膜、纤维素颗粒和可溶分子的形式测试K1化学品。
图9.照片显示在LAMP反应前每个管中的染料颜色。
图10.该照片显示在上排的LAMP反应中发生扩增的管中染料颜色变化，而在下排的LAMP反应中没有发生扩增的管中染料颜色不变。
图11A和B.该图显示用于扩增检测测试的两种不同的薄膜。
图12.溴百里酚蓝不产生颜色变化，并且pH保持不变。
图13.该图阐明实施例传感器和pH测试结果。
图14.在LAMP反应前，每个管的染料颜色是粉红色。
图15.然后管1至7的染料颜色变成黄色并且管8至10保持粉红色。
图16.该图表显示阳性和阴性区别反应。
图17.这些是显示在泳道1至7中的LAMP扩增的琼脂糖电泳照片。
图18.该图显示在反应前关于DNA的阳性或阴性的染料颜色。
图19.该图显示在反应后关于DNA的阳性或阴性的染料颜色。
图20.该图是反应前全血对染料颜色的影响。
图21.该图是反应后全血的作用。
图22.该图显示在将染料振荡出溶液后，固定的染料的颜色。
图23.该图是使用琼脂糖电泳的每个管中的LAMP反应。
图24.该图显示在染料存在时的PCR反应结果。
图25.该图是pH指示剂染料物理截留和化学连接至交联聚合物基质的示意图。
图26.该图显示当使用水凝胶片时在反应对无反应之间的颜色差异。
图27.该图显示pH响应的染料结合的聚氨酯水凝胶在直径2mm的醋酸纤维素球体上的实例。
发明详述
如图2中所示，本发明的装置之一包含结合垫、吸收垫、测试线和对照线。当样品加载在结合垫上时，由于毛细管作用力(papillary force)，样品向测试线移动。试剂在结合垫中(这可能是样品收集管)。在中间，两者在测试线和对照线处被印刷监视器分开。当有分析物存在时，在测试线形成免疫复合物。对照线指示存在活性试剂。任选地，条带包含层析膜。
电子元件的印刷有大量记载，但是在诊断装置中则没有。一些用于电子元件印刷的技术包括有机LED显示器，柔性触摸屏、RFID超级电容器和光伏膜。用作显示部分的有机LED可用不同颜色或字体显示是/不是的答案。
智能包装也能用作OLED。本发明的装置使用OLED显示预设信息。
RFID可用于存货控制和防伪方法。印刷电子元件的集成允许防伪(例如，本发明可完成在本地/远程数据库确认装置序列号以确保该装置从未被使用或未被盗，也没有在该装置未被批准的地点被使用)。在本发明中，该装置知道其必须检测什么目标并且展示具有结果的目标。
作为实例，印刷电子元件上的内部连线可使用银，用作导电墨水。本发明的电路使用导电墨水、半导体墨水、掺杂质和介电物质，包括分配器、比较仪、非门和放大器。
本发明实施例中使用的所有引物由Integrated DNA Technologies或ThermoFisher合成。因为反应中pH染料的存在对扩增反应造成极小的影响，所以不需要改变扩增试剂的构成。唯一的例外是镁离子(Mg2+)应该足够高，例如1.5mM或优选地2mM或更高，如此使脱氧核苷酸与镁离子形成复合物。
LAMP是使用引物以便与DNA杂交和以便靶向感兴趣的特定序列的双链DNA扩增过程。扩增是通过以下实现的：引物与模板DNA形成杂交，自内引物延伸，内引物稍后通过聚合酶的链置换活性被外引物取代，以及靶序列和新合成链的指数扩增。
将引物、脱氧核苷酸(dNTP)、反应缓冲液、指示剂染料和聚合酶预混合，除了聚合酶在最后一步加入以防止非特异性反应之外，无特定步骤顺序。对于使用非冻干制剂的反应，上述试剂应放置在冷藏箱中以防止非特异性反应。如果需要加热，在密封容器和将容器放入加热块之前，在最后一步加入样品DNA，例如纯化的人类基因组DNA、动物DNA、植物DNA、新鲜人类全血、λDNA、pUC19质粒、不同的病毒、任何自然存在或合成的核酸片段、或嵌合的人造核酸类似物诸如肽核酸(PNA)、吗啉基和锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和合成碱基，或诸如RNA的任何其它核酸模板。在扩增反应的结束时，通过肉眼或通过简单照相机观察反应容器。
其它形成本发明的目标包括但不限于脂蛋白的氨基酸序列，例如肽，多肽，糖蛋白，脂蛋白诸如α-胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、β淀粉样和HIVp24蛋白。
此外，在本发明中使用诸如细菌荚膜多糖的糖类聚合物和诸如内毒素的脂多糖。
使用本发明的方法、装置和试剂盒诊断的特殊的病毒和/或细菌疾病包括但不限于乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒、HIV、人乳头状瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、虾白斑综合症、猫白血病毒等。与这些诊断相关并形成本发明的装置、试剂盒和方法的蛋白质包括重组核蛋白、扎伊尔埃博拉病毒的糖蛋白和S基因蛋白；乙型肝炎核心多表位；抗-HCV免疫球蛋白G和重组B病毒糖蛋白。
通过本发明诊断的细菌疾病包括梅毒、衣原体和淋病。
当使用冻干试剂时，第一步是在加入样品目标前，用水重悬干燥的试剂。剩余步骤按照非冻干反应中描述的相同顺序。
本发明的实施例也提供了用于通过使用比色方法测量和电子印刷方法测量pH值变化的装置、试剂盒和方法。
存在用于PCR监测的具有集成驱动器(加热器)的用硅制造的纳升反应室，参见例如Iordanov等人，“用于DNA复制的传感纳升反应室(Sensorised nanoliter reactorchamber for DNA multiplication)”，IEEE(2004)229-232(通过引用将其全文并入本文)存在。如Iordanov等人在上文提及的文章中指明，未处理的硅和标准硅相关材料是Taq聚合酶的抑制剂。因此，当使用例如硅锗或彩色硅的硅或硅相关材料(下文中为“硅”)制造用于核酸扩增的室或通道时，通常会覆盖上材料以防止硅降低聚合酶效率，例如SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PerspexTM或玻璃。
用于PCR的微制造硅玻璃芯片也在Shoffher等人的Nucleic Acid Res.(1996)24,375-379中描述，通过引用将全文并入本文。使用标准光刻法程序制造硅芯片并蚀刻成115μm的深度。将PyrexTM玻璃盖放置在每个硅芯片顶部并使硅和玻璃结合。有但仅有少数表面的实例用于本发明。其它的包括氧化硅。
作为替代方案，用于PCR监测的样品可流动通过微流体装置的通道或室。因此，例如，样品可流动通过连续穿过适合于变性、引物热处理和引物延伸的PCR阶段的不同温度区域的通道或室。
因此，在用于实施本方法的一实施方案中，用于核酸扩增的样品流动通过基底上的微流体通道，并且当它流动时，沿着通道的长度连续穿过适合于连续重复的基底(substrate)或基底(base)提供的温度区。可将pH指示剂染料并入上文描述的所有PCR实施方案中。
虽然上文通常举例说明为实现热循环设计的PCR系统，很多等温核酸扩增技术是已知的，例如单链置换扩增(SDA)，并且可依据本发明同样监测使用此类技术的DNA或RNA扩增。
LAMP是使用引物以便与DNA杂交和以便靶向感兴趣的特定序列的双链DNA扩增过程。扩增是通过以下实现的：引物与模板DNA形成杂交，自内引物延伸，内引物稍后通过聚合酶的链置换活性被外引物取代，以及靶序列和新合成链的指数扩增。
提供的下述实施例是作为本发明的说明并不限于本发明。
实施例1
pH检测装置和使用该装置的方法，该装置具有pH敏感传感器、用于计算信号强度的控制电路，和显示器像素，该装置的电子元件全部使用卷轴式印刷或丝网印刷。将这些印刷在诸如柔性塑料的电介质材料上。该装置的生产避免因装置损毁的浪费并且以大生产量生产。该装置作为LFA是有用的，其中线的观察指示反应结果。
实施例2
将实施例1的印刷电子元件放置在LFA条带顶部，其中pH敏感传感器、控制电路(计算信号强度)和显示器像素全部通过卷轴式印刷或丝网印刷印刷。将这些电子组件印刷到诸如柔性塑料的电介质上。
具体地，为了测量pH值，印刷电子系统与层析介质接触。监测pH值的变化，为通过在10分钟和30分钟测量pH值变化的速率。除其他外，可加入胶水作为中间层。
实施例3
印刷感测器也包括印刷电池为电路供电，或作为可选特征，纽扣电池。电池材料的选择应不具有火灾危险或化学危险品的性质。优选地，电池包括自测功能。
印刷传感器包含显示监视器(例如，OLED有机发光二极管)以指示结果(是/不是/失败等)。这种印刷传感器具有做简单计算的能力。作为可选元件，传感器具有通信模块(例如RFID)以将患者的信息和结果上传至基站(诸如膝上型PC、定制化基站、触摸板、智能手机或其组合)。
另一任选元件是能够从基站(例如，膝上型PC、定制化基站、触摸板、智能手机或其组合)下载患者信息的传感器，如此该特别装置被'烙'上患者的ID。任选地将这些通信加密至有线系统或无线系统。
将所有传感器组件整合入连续的印刷生产过程(例如，卷轴式)中。分别进行传感器和LFA的装配。
此外，如果外界温度不在确定可接受范围内，存在温度传感器以补偿/调整/阻止装置的使用。
存在用于PCR监测的具有集成驱动器(加热器)的用硅制造的纳升反应室，参见例如Iordanov等人，“用于DNA复制的传感纳升反应室(Sensorised nanoliter reactorchamber for DNA multiplication)”，IEEE(2004)229-232(通过引用将其全文并入本文)。如Iordanov等人在上文提及的文章中指明，未处理的硅和标准硅相关材料是Taq聚合酶的抑制剂。因此，当使用例如硅锗或彩色硅的硅或硅相关材料(下文中为“硅”)制造用于核酸扩增的室或通道时，通常会覆盖上材料以防止硅降低聚合酶效率，例如SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PerspexTM或玻璃。
用于PCR的微制造硅玻璃芯片也在Shoffher等人的Nucleic Acid Res.(1996)24,375-379中描述，通过引用将全文并入本文。使用标准光刻法程序制造硅芯片并蚀刻成115μm的深度。将PyrexTM玻璃盖放置在每个硅芯片顶部并使硅和玻璃结合。有但仅有少数表面的实例用于本发明。其它的包括氧化硅。
作为替代方案，用于PCR监测的样品可流动通过微流体装置的通道或室。因此，例如，样品可流动通过连续穿过适合于变性、引物热处理和引物延伸的PCR阶段的不同温度区域的通道或室。
因此，在用于实施本方法的一实施方案中，用于核酸扩增的样品流动通过基底上的微流体通道，并且当它流动时，沿着通道的长度连续穿过适合于连续重复的基底(substrate)或基底(base)提供的温度区。可将pH指示剂染料并入上文描述的所有PCR实施方案中。
虽然上文通常举例说明为实现热循环设计的PCR系统，很多等温核酸扩增技术是已知的，例如单链置换扩增(SDA)，并且可依据本发明同样监测使用此类技术的DNA或RNA扩增。
本发明实施例中使用的所有引物由Integrated DNA Technologies或ThermoFisher合成。因为反应中pH染料的存在对扩增反应造成极小的影响，所以不需要改变扩增试剂的构成。唯一的例外是镁离子(Mg2+)应该足够高，例如1.5mM或优选地2mM或更高，如此使脱氧核苷酸与镁离子形成复合物。
LAMP是使用引物以便与DNA杂交和以便靶向感兴趣的特定序列的双链DNA扩增过程。扩增是通过以下实现的：引物与模板DNA形成杂交，自内引物延伸，内引物稍后通过聚合酶的链置换活性被外引物取代，以及靶序列和新合成链的指数扩增。
将引物、脱氧核苷酸(dNTP)、反应缓冲液、指示剂染料和聚合酶预混合，除了聚合酶在最后一步加入以防止非特异性反应之外，无特定步骤顺序。对于使用非冻干制剂的反应，上述试剂应放置在冷藏箱中以防止非特异性反应。如果需要加热，在密封容器和将容器放入加热块之前，在最后一步加入样品DNA，例如纯化的人类基因组DNA、新鲜人类全血、λDNA、pUC19质粒的或任何其它核酸模板。在扩增反应的结束时，通过肉眼或通过简单照相机观察反应容器。
当使用冻干试剂时，第一步是在加入样品目标前，用水重悬干燥的试剂。剩余步骤按照非冻干反应中描述的相同顺序。
实施例4
与无机场效应晶体管(FET)相似，OFET具有源极，漏极和栅电极。在源极和漏极之间的通道电流由场效应掺杂产生的栅电压调节。与硅FET相比，OFET显示出相对较低的载体移动性和稳定性，但是在柔性、生物相容性、大面积和溶液可加工性方面显示更好的性能。因此，OFET适合于在一次性传感器中应用。
表1总结了基于OFET的化学和生物传感器的实例。
表1总结了基于OFET的化学和生物传感器的实例。
实施例5
本发明的诊断试剂盒的实施例包括含有层析介质的横向流动装置。这种层析介质包括：(a)位于检测区上游的样品加载区；(b)位于样品加载区和检测区之间的报告载体区，其中报告载体区包含能与分析物形成复合物的报告载体。本发明的报告载体包含载体和一种或多种高效酶盒。将高效酶盒或高效酶定义为能催化反应以使得速率超过1000/秒/酶盒的酶的组合。在酶学中该数值也称作周转率或Kcat；和(c)检测区，其中检测区包含用于分析物的捕获组分和指示剂。样品在应用区域测试样品接触，其中测试样品从样品加载区沿着层析介质移动通过报告载体区至检测区并越过检测区。向测试区加入底物，其中底物在包含报告载体的高效酶分析物存在时经历反应，并且在检测区中产生对应于装置完成测试样品中分析物存在或不存在的指示剂反应。
实施例6
本发明的诊断试剂盒的实施例在层析介质中使用酶辅助扩增方法检测分析物存在或不存在。分析物是诸如能被抗体或抗体类似物识别的抗原的生物标记。在这个实施例中，报告载体具有随后结合至分析物和高效酶上的第一抗体。捕获组分包括在与第一抗体不同的表位与分析物结合的第二抗体。在一个实施方案中，第一抗体共价交联至高效酶。
报告载体包含链霉亲和素和生物素化的高效酶和生物素化的抗体。第一抗体通过非共价链霉亲和素-生物素相互作用结合或关联至高效酶。
实施例7
在本发明的另一个实施例中，分析物是核酸序列。在这个实施例中，报告载体包含杂交至目标核酸序列的一部分的第一核酸序列，是与第一核酸相关联的高效酶。第一核酸共价交联至高效酶。报告载体包含链霉亲和素和生物素化的高效酶和生物素化的第一核酸。第一核酸通过非共价链霉亲和素-生物素相互作用关联至高效酶。
在本发明的一个实施例中报告载体结合HIV的p24蛋白。在另一个应用中，报告载体结合HIV核酸。底物是液体溶液，作为装置的部分。溶液将在最后阶段加到条带上。
在一个实施方案中，测试线(图4中的4)也包含pH颜色指示剂。在分析物存在时，线(图4中的4)的颜色变化。在C线(图4中的5)上也有相同的pH颜色指示剂。在报告载体存在时，颜色变化。在图11中能找到实施方案的实施例。
在一个实施方案中，pH颜色指示剂是放置在测试线和对照线顶部的薄膜。在另一个实施方案中，pH颜色指示剂在测试线和对照线的位置印刷至层析介质中。
在另一个实施方案中，底物溶液包含pH指示剂。由于pH值变化，在分析物存在时测试线(图4中的4)的颜色出现。在报告载体存在时，对照线(图4中的5)的颜色变化。在图2中也显示了反应的实施例。
在另一个实施方案中，目标是人类丙型肝炎病毒的核心蛋白。对核心蛋白的第一表位具有特异性的第一抗体连接至报告载体。对核心蛋白的第二表位具有特异性的第二抗体固定在层析介质的检测区。公开的方法检测至少0.5pg的蛋白或更多。蛋白质包括诸如但不限于HIV、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、疱疹病毒作为实例的病毒蛋白；肿瘤蛋白(针对前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)；针对卵巢癌的癌抗原125(CA 125)；针对甲状腺髓样癌的降钙素；针对肝癌的α-胎蛋白(AFP)；和针对诸如睾丸癌和卵巢癌的生殖细胞肿瘤的人类绒毛膜促性腺激素(HCG)；诸如人类心肌肌钙蛋白T或I的心血管疾病蛋白、或肺蛋白、肝蛋白、肾脏蛋白和诸如β淀粉样蛋白的神经蛋白；诸如那些用于检测梅毒、衣原体和淋病的细菌蛋白。
在另一个实施方案中，目标是针对心肌梗死的人心肌肌钙蛋白T和/或心肌和/或肌钙蛋白I。诊断试剂盒包含印刷电子传感器和控制电路以为快速测量提供定量结果。试剂盒的敏感性也被用于高敏感性心肌肌钙蛋白I的分析。
在另一个实施方案中，在一段时间内电子传感器产生连续pH值读数以产生时间依赖的pH值曲线。通过比较不同测试区、控制区和层析介质上除测试区或控制区之外的任何其它点的曲线，在阈值查看检测的是/否的答案。相似的，通过比较测试区、控制区好在层析介质上的除测试/控制区外的另一点的曲线，执行半定量或定量测量。此外，当随着时间监测和记录反应过程时，也记录了反应的差别读数。
实施例8
K1薄膜是与1-羟基-4-[4-(羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸钾结合的20微米厚度的纤维素膜。
K2薄膜是与4-[4-(2-羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚结合的20微米厚度的纤维素膜。
K1溶液是1-羟基-4-[4-(羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸钾。
K1颗粒是与1-羟基-4-[4-(羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸钾结合的直径50微米的纤维素微粒PH-101.。
使用不同的染料形式检测：
在分析中使用了三种不同形式的K1染料：K1薄膜、K1颗粒和可溶的K1。分析显示染料形式和LAMP反应的兼容性。建立LAMP反应以使用p450 2C19野生型引物组和K562基因组DNA。将约300份拷贝的1ng K562与反应组分混合。在反应前，每个管均包括染料。反应在63摄氏度维持30分钟，观察反应的颜色。
该照片显示了pH薄膜在LAMP反应中针对2C19基因型分型的颜色反应。照片是在LAMP反应后拍摄的。在图中，顺序是K1薄膜野生型(A)或突变体(D)；K1粉末野生型(B)或突变体(E)；K1溶液野生型(C)或突变体(F)。
表2总结了在LAMP反应中提供的K1染料的色值和pH值。
以薄膜、纤维素颗粒和可溶分子的形式测试K1化学品。(见图8的上表)。使用颜色面板将2C19基因型分型的颜色变化转变成数字。图表显示了pH值变化(起始pH-结束pH)和颜色变化(起始颜色-结束颜色)。当颜色变化或pH值变化的阈值维持在1时，有LAMP反应的样品与没有LAMP反应的样品是不同的。pH值变化与颜色变化100％一致。
实施例9
建立反应以使用p450 2C19野生型引物组和K562基因组DNA。将约300份拷贝的1ngK562与这些反应组分混合。在反应前，每个管均包括pH指示剂染料。在阴性对照样品中，用2.8mM的(脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸)的混合物替换dNTP。反应在63摄氏度维持30分钟，观察反应的颜色。
| 野生型引物混合溶液 | 终浓度 |
| 2C19_FIP.野生 | 1.6μM |
| 2C19_BIP.野生 | 1.6μM |
| 2C19_LF | 0.8μM |
| 2C19_LB | 0.8μM |
| 2C19_F3 | 0.2μM |
| 2C19_B3 | 0.2μM |
| LAMP缓冲液 | 终浓度 |
| KCl | 50mM |
| MgSO4 | 5mM |
| NH4Cl | 5mM |
| BSA | 1mg/mL |
| 吐温20 | 0.10％ |
| Betain | 1M |
| 脱氧核苷酸 | 2.8mM |
| Bst聚合酶 | 32U |
| H2O | 填充至50μL |
在每个管中，在LAMP反应前，将不同的染料薄膜(K1和K2)或可溶的pH指示剂(溴百里酚蓝，0.1mg/mL)与扩增试剂混合。针对扩增检测测试两种不同的薄膜。反应建立的照片和结果显示在图9和10中。通过使用译码面板将颜色变化转变成值。编译的值显示在表3中。为了显现颜色差异和扩增对未扩增，值绘制在图8中。
结果显示在模板存在时的颜色变化。
照片显示了在LAMP反应前，每个管中染料的颜色。在照片中，管是有模板(A)和没有模板(D)的K1薄膜LAMP反应，有模板(B)和没有模板(E)的K2薄膜，有模板(C)和没有模板(F)的溴百里酚蓝溶液。
图9和图10显示在LAMP反应中发生扩增的管中(上排)染料颜色变化，而在LAMP反应中没有发生扩增的管中(下排)染料颜色保持不变。在照片中，管是有模板(A)和没有模板(D)的K1薄膜LAMP反应，有模板(B)和没有模板(E)的K2薄膜，有模板(C)和没有模板(F)的溴百里酚蓝溶液(见图10)。
表3显示与LAMP反应相关的颜色结果和pH值。
| LAMP前 | LAMP后 | ||||
| Lamp反应 | pH值 | 色值 | pH值 | 色值 | |
| K-1 | 是 | 8.7 | 3 | 6.7 | 1 |
| 不是 | 8.7 | 3 | 7.9 | 3 | |
| K-2 | 是 | 8.7 | 3 | 6.5 | 1 |
| 不是 | 8.7 | 3 | 7.5 | 3 | |
| BB | 是 | 8.7 | 蓝色 | 6.6 | 蓝色 |
| 不是 | 8.7 | 黄色 | 7.8 | 黄色 |
针对扩增检测测试两种不同的薄膜。将两种不同的pH指示剂固定在纤维素薄膜上。使用其自身的颜色面板将每种薄膜的颜色变化转变成数字。表3显示了pH值变化(起始pH-结束pH)和颜色变化(起始颜色-结束颜色)。在所有三种染料薄膜中，LAMP反应的值明显区别于没有LAMP反应的值。pH值变化与颜色变化100％一致。在图12中，使用琼脂糖电泳分析每个管中的样品。
颜色变化的强度非常强，如此可容易通过裸眼确定结果。当使用可溶性染料(溴百里酚蓝，0.1mg/mL)作为指示剂时，也存在明显的颜色变化。这显示使用可溶性染料是可能的。
然而，在较高浓度，染料抑制反应。当将可溶的K1染料与LAMP反应混合时，也观察到相似情况。可溶性化学品易于干扰和抑制扩增。
溴百里酚蓝不会产生颜色变化而且pH值保持在8.5不变(见图13)。
实施例10
建立反应以使用λ引物组(图22)和λ基因组DNA。将DNA模板稀释至代表1、10、100、1,000、10,000,、100,000、1,000,000和10,000000份拷贝的λDNA的多种浓度。在反应前，每个管中包括K2薄膜。阴性对照不包含λDNA。反应在63摄氏度维持30分钟，观察反应的颜色。当有扩增时，K2薄膜颜色从深紫红色变成淡黄色。在本分析中，敏感显示的极限为10份拷贝。
| 引物混合溶液 | 终浓度 |
| λ_FIP | 1.6μM |
| λ_BIP | 1.6μM |
| λ_LF | 0.8μM |
| λ_LB | 0.8μM |
| λ_F3 | 0.2μM |
| λ_B3 | 0.2μM |
| LAMP缓冲液 | 终浓度 |
| KCl | 50mM |
| MgSO4 | 5mM |
| NH4Cl | 5mM |
| BSA | 1mg/mL |
| 吐温20 | 0.10％ |
| Betain | 1M |
| 脱氧核苷酸 | 2.8mM |
| Bst聚合酶 | 32U |
| H2O | 填充至50μL |
管1至7的染料颜色变成黄色。管8至10保持粉红色。结果显示检测限是10份拷贝的λDNA(见图14和15)。
表4
提供了不同拷贝数的反应的色值和pH值的结果。
在LAMP反应前，每个管中染料的颜色是粉红色。每个管对应一λDNA浓度(见图14)。
管1至7的染料颜色变成黄色。管8至10保持粉红色。结果显示检测限是10份拷贝的λDNA(见图15)。
表5：提供了不同拷贝数的反应的色值和pH值的结果。
图表显示可容易区分阳性和阴性反应的区别。使用K2薄膜的检测显示低至10份拷贝的λDNA(见图16)。
琼脂糖电泳照片显示LAMP扩增发生在泳道1至泳道7，其中拷贝数分别是10,000,000、1,000,000、00,000、10,000、1,000、100和10。泳道8对应于单拷贝的λDNA，其中没观察到扩增。泳道9和泳道10是无λDNA的反应。
实施例11
在每个管中，在LAMP反应前，将可溶pH指示剂(溴百里酚蓝，0.1mg/mL)、K1薄膜和pH测试纸(Merck Millipore cat#1.09543.0001,非渗出纸)与扩增试剂混合。
建立反应以使用p450 2C19野生型引物组和K562基因组DNA。将约300份拷贝的1ngK562与反应组分——50mM KCl、5mM MgS04、5mM NH4C1、1M Betaine、1mg/mL BSA、0.1％吐温20、2.8mM dNTP(脱氧腺苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸和脱氧胞苷三磷酸)、1.6μM FIP和BIP、0.8μM Loop-F和Loop-B、0.2μM F3和B3、和32U的Bst聚合酶在50μL反应中混合。在加入Bst、K562或全血前，将pH值调整至8.0。在阴性对照样品中，用2.8mM的(脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸)的混合物替换dNTP。在另一个面板中，将从手指扎针采集的2μL的新鲜全血加入到每个管中。反应在63摄氏度维持30分钟，观察反应的颜色。
除了K1薄膜，所有的在全血存在时，看出扩增对非扩增的之间的差别是非常有挑战性的。由于可简单和容易地将浑浊的全血溶液从K1薄膜上移除，可像照片中显示的那样监测核酸扩增。
照片显示了在反应前有(阳性)或没有(阴性)纯化的DNA的染料颜色。反应使用纯化的DNA作为模板。从左至右，管包含染料：溴百里酚蓝(A和B)、K1薄膜(C和D)，和pH测试纸(E和F)。在pH8时，管A和B是淡蓝色、管C和D(K1薄膜)是深紫红色，和管E和F(Merck-Millipore的pH纸)是褐绿色。
照片显示了在反应后有(阳性)或没有(阴性)DNA模板的染料颜色。当反应中有DNA模板时，染料颜色变化。管B(溴百里酚蓝)从淡蓝色变成黄色。管D(K1薄膜)从深紫红色变成橙色。管F(pH纸)从褐绿色变成淡黄色。
照片显示在反应前全血对染料颜色的作用。将具有模板DNA的管标记上正号，而将没有加DNA的管标记上负号。每个管包含2μL新鲜全血。从左至右，管包含溴百里酚蓝(A和B)、K1薄膜(C和D)，和pH测试纸(E和F)。在pH8时，溴百里酚蓝是淡蓝色，K1薄膜是深紫红色，和由于不同颜色的混合Merck-Millipore的pH纸难于确定颜色。
照片显示反应后的全血作用。可溶染料溴百里酚蓝(A和B)的颜色在全血存在时变得不能辨别。
照片显示在将染料振荡出溶液后，固定的染料的颜色。在K1薄膜(C和D)和pH纸(E和F)的情况中，可将血从固定的染料移除。移除的过程不需要使用者打开管，因此没有污染的风险。在移除血后，pH纸的颜色也难于区分扩增(F)和不扩增(E)。这是因为纸的多孔渗水结构困住血。K1薄膜的颜色是唯一显示无扩增(C,色值＝3)和扩增(D,色值＝1)之间明显差别的反应。
每个管中的LAMP反应使用琼脂糖电泳。BTB是溴百里酚蓝(见图23)。
实施例12
PCR实施方案
| 引物混合溶液 | 终浓度 |
| HCV核心正向引物 | 1μM |
| HCV核心反向引物 | 1μM |
| PCR缓冲液 | 终浓度 |
| KCl | 50mM |
| MgCl4 | 2mM |
| 脱氧核苷酸 | 1mM |
| Taq聚合酶 | 2.5U |
| H2O | 填充至30μL |
在PCR中使用用于监测核酸扩增的指示剂染料薄膜。薄膜与PCR反应条件相配。在一个实施例中，通过使用包含丙型肝炎病毒核心1b基因的质粒装配分析。在PCR反应前，用染料薄膜设置反应。调整每个反应的pH值在8.0-8.2之间。热循环程序遵循在94摄氏度2分钟的初始变性步骤，具有三步模块的55次重复：94摄氏度30秒，65摄氏度20秒和72摄氏度15秒。反应最后一步在72摄氏度维持2分钟后结束反应。在管从机器中取出后观察管颜色。
结果显示有扩增的管(黄色)和没扩增的管(粉红色)之间的不同颜色差异。
在图33中，提供了染料存在时的PCR反应结果。K1薄膜显示在A、C、E和G中，而K2薄膜显示在B、D、F和H中。在PCR反应前，所有的薄膜显示橙色。在PCR反应后，无扩增的管(E和F)显示粉红色。发生扩增的具有质粒模板的管显示黄色(G和H)。
实施例13
一直以来都希望开发不需要样品准备和从样品到最终结果不需要超过2步和对于结果解释不需要仪器的能够检测基因的分析。本发明提供了满足这些要求的方法。基因在直接从指尖扎针采血的全血存在时扩增。通过使用固定染料监测扩增来检测基因的存在。这导致将所有这些步骤减少至一步。
首先，将水从预定体积容器加载至一个或多个包含冻干扩增试剂的反应容器中，在指示剂染料存在时将诸如全血的样品加载至反应容器中。
为了防止污染，在任何核酸扩增后，容器应该保持仪器保持牢固密封。当扩增反应为非澄清溶液如全血扩增时，在没有任何仪器的帮助下，扩增结果通常难以读取。为了克服来自与样品一起带入的悬浮胶体颗粒或有色化合物的干扰，通常通过稀释或加热或两者预处理样品。实施例涵盖了无仪器的常规检测，诸如DNA螯合荧光染料、YO-PRO-1或SybrGreen(Genome Letters,2,1 19-126,2003)、金属螯合染料、钙黄绿素和羟基萘酚蓝(Biotechniques,46,167-172,2009)。
本发明证明染料化学品(K1和K2)共价连接到安装在扩增发生的容器中的水凝胶3D物体上。从我们公开的内容显示，使用与K1或K2结合的薄膜允许肉眼容易读取核酸扩增结果。然而，没有打开反应容器，并不总是容易在容器中将溶液从薄膜分离，因为薄膜趋向于粘住容器壁。3D物体通过将指示剂染料和容器之间的接触表面最小化解决了该问题。
3D物体是球体，如此使3D物体和反应之间的接触面积最小化。可通过对诸如聚苯乙烯球体、纤维素球体或其他材料制成的球体的球体涂上水凝胶层形成3D球体。选择不同颜色的球体以加强指示剂颜色染料的对比度以促进肉眼更好地读取颜色变化。
本发明也描述其中染料是受外部磁场影响的指示剂球体或3D染料指示剂物体的设计。当将顺磁或铁磁的材料嵌入3D物体或球体时，控制染料的位置是可能的，如此在没有浑浊溶液的干扰下可观察染料并且在容器安全密封时可如此操作。在水凝胶涂层前，植入就像将铁针压入聚合物球体一样简单。
然而在另一个实施方案中，3D物体是在外部磁力影响下能形成3D物体簇的小颗粒的聚集。颗粒是具有相当于球体的微米直径或其它适于容易进行磁力操作的尺寸。
水凝胶由聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚氨酯(PU)、聚(乙二醇)(PEG)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)或聚酰亚胺(PI)制成。
染料是任何反应性乙烯基磺酰基染料或pH指示剂染料。
水凝胶是通过使用聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)形成的，水凝胶与K2染料结合，K2染料也称作4-[4-(2-羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚的指示剂染料(乙烯基磺酰基染料)。
材料是
1)2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、2,2-二甲氧基-2-苯基乙酮、4-[4-(2-羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚(pH指示剂染料)、硫酸、氢氧化钠和碳酸钠
水凝胶的制备
在表6中给出了在水凝中使用的试剂的化学成分。
表6：用于水凝胶形成的试剂的化学成分。
| 试剂 | 重量％ |
| HEMA | 63 |
| 聚(乙二醇)二甲基丙烯酸 | 1.5 |
| 2,2-二甲氧基-2-苯基乙酮(DMPA) | 0.5 |
| DI水 | 35 |
表5：用于水凝胶形成的试剂的化学成分
在称量后将所有的试剂一起加入并经受10分钟的搅拌以获得均匀的混合物。该混合物是浇铸至玻璃培养皿中的溶剂。该培养皿经受UV照射3min，其中实行了聚合和交联反应。在UV下，DMPA(光引发剂)发生分解，每个光引发剂分子产生两个自由基。自由基引发HEMA聚合以形成PHEMA，并且同时也激活聚(乙二醇)二甲基丙烯酸(交联剂)以实行PHEMA链的分子间的交联反应。3min后，将水凝胶从培养皿上剥离并浸入DI水中1hr以保证除去所有的副产物和未反应的试剂。
用4-[4-(2-羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚对PHEMA水凝胶进行化学着色
在一个典型固定程序中，将100mg指示剂染料与1g浓硫酸彻底混合(用杵在研钵里捣)并在室温放置30min。这使得指示剂染料的2-羟乙基磺酰基基团转变成磺酸基。然后将混合物倒入900mL蒸馏水中并用1.6mL 32％的氢氧化钠溶液中和。然后，将25.0g碳酸钠溶解在100mL水中并且随后加入5.3mL的32％的氢氧化钠溶液。在这个阶段，将PHEMA水凝胶层放入该染色液中。在碱性条件下，染料磺酸基转变成化学反应性的乙烯基磺酰基衍生物，并且同时发生乙烯基磺酰基基团和聚合物反应基团(例如，PHEMA水凝胶的羟基基团)的迈克尔加成。12h后，将有色层从染色浴中移出并用蒸馏水洗涤几次。
在这个阶段，染料分子化学连接至交联聚合物基质。同样由于水凝胶吸收水溶液的能力，染料被物理性加载至基质中。这是如下文所示的染料结合至聚合物的非共价类型。在充分洗涤后，染料停止从水凝胶中浸出，并且在这个阶段将有色水凝胶切成小块以用于核酸测试。
实施例14
建立反应以使用λ引物组和λDNA。在水凝胶片存在时，将约100亿拷贝的λDNA与反应组分混合(管2)。在阴性对照样品中(管1)，用2.8mM的(脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸)的混合物替换dNTP。反应在63摄氏度维持30分钟，观察反应的颜色。水凝胶片为约2mm×4mm×1mm。在反应结束时，很显然在所有四种脱氧核苷酸存在时，水凝胶片从紫红色变成橙色，而当缺失脱氧胸苷三磷酸阻止LAMP反应时，颜色保持紫红色。
| 引物混合溶液 | 终浓度 |
| λ_FIP | 1.6μM |
| λ_BIP | 1.6μM |
| λ_LF | 0.8μM |
| λ_LB | 0.8μM |
| λ_F3 | 0.2μM |
| λ_B3 | 0.2μM |
| LAMP缓冲液 | 终浓度 |
| KCl | 50mM |
| MgSO4 | 5mM |
| NH4Cl | 5mM |
| BSA | 1mg/mL |
| 吐温20 | 0.10％ |
| Betain | 1M |
| 脱氧核苷酸 | 2.8mM |
| Bst聚合酶 | 32U |
| H2O | 填充至50μL |
在图26中提供了当使用水凝胶片时在反应对无反应之间的颜色差异。
在直径2mm的醋酸纤维素球体上pH响应的染料结合的聚氨酯水凝胶的实施例。
核壳水凝胶颗粒的pH反应。涂覆水凝胶的醋酸纤维素与pH指示剂染料共价连接，并且展示了染料的颜色。在pH7时，颜色是黄色。在pH8.5时，颜色是紫红色。
λ引物组
λ_FIP 5'-CAGCATCCCTTTCGGCATACCAGGTGGCAAGGGTAATGAGG-3'
λ_BIP 5'-GGAGGTTGAAGAACTGCGGCAGTCGATGGCGTTCGTACTC-3'
λ_F3 5'-GAATGCCCGTTCTGCGAG-3'
λ_B3 5'-TTCAGTTCCTGTGCGTCG-3'
λ_LF 5'-GGCGGCAGAGTCATAAAGCA-3'
λ_LB 5'-GGCAGATCTCCAGCCAGGAACTA-3'
CYP2C19引物组
2C19_F3 5'-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT C-3'
2C19_B3 5'-AGG GTT GTT GAT GTC CAT-3'
2C19_FIP.野生5'-CCG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCTAG-3'
2C19_BIP.野生5'-CGG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
2C19_FIP.Mut 5'-CTG GGA AAT AAT CTT TTA ATT TAA ATT ATT GTT TTC TCTAG-3'
2C19_BIP.Mut 5'-CAG GAA CCC GTG TTC TTT TAC TTT CTC C-3'
2C19_LF 5'-GAT AGT GGG AAA ATT ATT GC-3'
2C19_LB 5'-CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TT-3'
引物序列
| HCV核心正向引物 | GTCGCGTAACTTGGGTAAGG |
| HCV核心反向引物 | AAGCTGGGATGGTCAAACAG |
实施例15
制造装置，其中电子印刷传感器和检测电路并使用。建立具有三层的pH传感器。一层是储藏底物或待测试分析物的层。它也包含至少两个电极，每个均被pH传感材料覆盖。在本实施例中，使用聚苯胺。最后，有作为绝缘体以在电极和底物或分析物之间设置屏障的第三层。
电阻器和电池也是系统或装置的部分。
为了测量在本实施例中测量的电阻变化，使用分配器电路以使值作为电压变化而测量。
使用该装置测量特别使用的pH水平。如果需要是需要测量pH值范围，使用多于一个的分配器电路。此外，为了测量潜在的线性或其它反应，取多个时间读数。
实施例16
使用聚苯胺作为覆盖两个平面光电导体的薄膜。聚苯胺薄膜作为颜色对照滤光器。该装置的一个光电导体作为对照，并且它的聚苯胺薄膜不接触测量pH值变化的分析物。另一个光电导体是装置的测试部分，并且它的聚苯胺薄膜与分析物反应并且基于pH反应改变颜色。也提供用于电池的电压分配器。聚苯胺在酸性pH是绿色，在碱性pH是蓝色。
Claims (87)
1.医疗测试装置，所述装置包括：印刷电子电路、显示器和电池、传感器、监视器、阅读和显示单元，其中至少一种电子元件是印刷的或其中所述装置使用比色介质来检测在测量化学或生物反应中的颜色变化。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述装置是集成测试横向流动装置。
3.如权利要求2所述的集成测试横向流装置，其中所述电子元件是使用有机半导体材料印刷的。
4.如权利要求3所述的集成测试横向流装置，其中所述有机半导体材料是聚(3-己基噻吩)、并五苯、聚三芳胺、5',5-二-(7-十二烷基-9H-芴-2-基)-2,2'-双噻吩、聚乙烯、萘二甲酸酯、聚(4,4'二癸基双噻吩-共聚-2,5噻吩并[2,3-b]噻吩)、聚苯胺或其组合。
5.如权利要求2所述的集成测试横向流装置，其中所述电子元件是使用无机材料印刷的。
6.如权利要求5所述的集成测试横向流装置，其中所述无机材料是五氧化钽、氯化银、银浆、硅、二氧化硅、氮化硅、氧化铝、矿物半导体、金属、金属氧化物或其组合。
7.用于包含层析介质的装置的诊断试剂盒，所述装置包括：(i)位于检测区上游的样品加载区；(ii)位于样品加载区和检测区之间的报告载体区，其中所述报告载体区包括能与分析物形成复合物的报告载体，并且其中所述装置包含所述报告载体、载体和一种或多种高效酶盒；和(iii)检测区，其中所述检测区包含所述分析物的捕获组分和指示剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其还包括：具有测试样品的样品加载区，其中所述测试样品从所述样品加载区沿着所述层析介质移动通过所述报告载体区至所述检测区并越过所述检测区。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其还包括：具有测试样品的样品加载区，其中所述测试样品在加载至样品加载区之前与所述报告载体混合。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其还包括：向所述检测区加入底物，其中所述底物在包含报告载体的高效酶分析物存在时反生反应，并在所述检测区内产生对应于所述测试样品中所述分析物存在或不存在的指示剂响应。
11.在层析介质中使用酶辅助扩增方法检测分析物存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：作为生物标记的分析物、识别所述生物标记的实体；具有与分析物结合的第一实体的报告载体；和捕获组分。
12.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述生物标记是抗原，所述捕获组分是在与所述第一抗体不同的表位与分析物结合的第二抗体。
13.如权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述第一抗体共价交联至高效酶。
14.如权利要求13所述的诊断试剂盒，其中所述报告载体包括链霉亲和素和生物素化的高效酶和生物素化的抗体，其中所述第一抗体通过非共价的链霉亲和素-生物素相互作用与所述高效酶相关联。
15.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述分析物是核酸序列。
16.如权利要求15所述的诊断试剂盒，其中所述报告载体包括与靶核酸序列的一部分杂交的第一核酸序列，并且其中所述高效酶与所述第一核酸相关联。
17.如权利要求16所述的诊断试剂盒，其中所述第一核酸共价交联至所述高效酶。
18.如权利要求17所述的诊断试剂盒，其中所述报告载体包括：链霉亲和素和生物素化的高效酶和生物素化的第一核酸，并且其中所述第一核酸通过非共价的链霉亲和素-生物素相互作用与所述高效酶相关联。
19.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述报告载体结合HIV的p24蛋白、HBV、HCV、HPV或疱疹病毒；梅毒、衣原体、淋病的细菌蛋白的核酸或蛋白质；脂蛋白或其核酸；糖蛋白或其核酸。
20.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述报告载体结合HIV核酸。
21.用于测量化学或生物反应的方法，所述方法包括：使用包含至少一种选自电路、显示器、电池、传感器、监视器、阅读单元、显示单元的电子元件的印刷电子装置，加入分析物；观察反应；读取结果；所述装置具有数据输入和数据输出机制以及动力输入机制。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述装置是横向流动装置或微流体装置。
23.如权利要求1所述的装置，其中所述装置使用比色介质来检测颜色的变化或使化学或生物反应可视化。
24.如权利要求23所述的装置，其中所述比色介质是pH敏感指示剂染料。
25.如权利要求24所述的装置，其中所述pH敏感染料是在溶液中；固定在一个或多个3D结构上；固定在反应室或容器中；或其组合。
26.用于测试pH值变化的方法，所述方法包括：使用权利要求25所述的装置来测量所述pH值变化。
27.如权利要求25所述的装置，其中所述pH敏感染料固定在一种或多种3D结构上。
28.如权利要求25所述的装置，其中所述pH敏感染料固定在反应室或容器中。
29.如权利要求25所述的装置，其中所述pH敏感染料是固定在溶液中，或一个或多个3D结构上，或在反应室或容器中，的组合。
30.如权利要求1所述的装置，其中所述印刷电子元件是纳米颗粒、纳米管、石墨烯或其组合。
31.如权利要求1所述的装置，其中所述印刷电子元件是通过原子层沉积、气相沉积、喷墨印刷、卷轴式印刷、丝网印刷或其组合印刷的。
32.如权利要求1所述的装置，其还包括：晶体管、控制电路、信号电路、显示电路、电池、用于数据记录的输入和输出以及电源。
33.用于测量pH值变化的装置，其中所述装置包括：包含测试线、对照线和结合垫的印刷传感器系统。
34.如权利要求33所述的装置，其还包括吸收垫。
35.如权利要求32所述的装置，其中所述装置提供是/不是半定量或定量显示；在之前没有发现线的地方出现线；在白色背景上出现线；不同图案的出现；颜色变化；线的消失；或其组合。
36.如权利要求33所述的装置，其中显示具有与分析结果相关的文本信息的至少一个发光二极管或发光二极管阵列。
37.医疗测试装置，所述装置包括：印刷电池、印刷传感器和上传信息的通信模块，其中所述通信模块将信息上传至基站。
38.包括层析介质的集成测试横向流动装置，其具有位于检测区上游的样品加载区；报告载体区；检测区，其中报告载体位于所述样品加载区和所述检测区之间。
39.如权利要求38所述的装置，其中所述报告载体包括载体和一种或多种高效酶。
40.如权利要求39所述的装置，其中在层析介质中通过酶辅助扩增方法检测分析物存在或不存在。
41.如权利要求40所述的装置，其中所述分析物是被抗体识别的生物标记抗原。
42.如权利要求41所述的装置，其中所述报告载体包括与所述分析物和高效酶结合的第一抗体；并且所述捕获组分包括在与所述第一抗体不同的表位与所述分析物结合的第二抗体。
43.如权利要求42所述的装置，其中所述报告载体是链霉亲和素、生物素化的高效酶、生物素化的抗体和/或其组合。
44.如权利要求43所述的装置，其中所述分析物是核酸序列。
45.如权利要求41所述的装置，其中所述报告载体结合HIV核酸。
46.如权利要求24所述的装置，包括：是1-羟基-4-[4-(羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸钾或4-[4-(2-羟基乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚的指示剂染料，或任何反应性乙烯基磺酰基染料或其组合。
47.如权利要求25所述的装置，其中所述指示剂染料混合在所述反应试剂中。
48.如权利要求25所述的装置，其中所述pH指示剂染料是反应前扩增试剂的部分。
49.如权利要求25所述的装置，其中所述pH指示剂染料在反应后加入。
50.如权利要求25所述的装置，其中所述pH指示剂固定于细颗粒微粒、薄膜或三维物体上。
51.如权利要求50所述的装置，其中所述颗粒是由聚合物、多孔性颗粒或核-壳颗粒制成的微颗粒，并且其中所述染料共价结合所述微颗粒。
52.如权利要求51所述的装置，其中所述颗粒由聚合物、多孔性颗粒或核-壳颗粒制成。
53.如权利要求52所述的装置，其中一种或多种颗粒作为离散的颗粒、结合至少一种或多种颗粒是可行的。
54.如权利要求50所述的装置，其中所述三维物体受外部磁力影响。
55.如权利要求50所述的装置，其中所述薄膜是与所述pH指示剂染料共价结合的膜。
56.如权利要求50所述的装置，其中所述三维物体是由水凝胶制成或是包覆在毫米或微米尺寸的非水凝胶三维物体表面。
57.如权利要求56所述的装置，其中所述三维物体与非水凝胶材料混合来增加质量密度，以增强所述非水凝胶材料的有色背景引入的颜色强度。
58.如权利要求56所述的装置，其中所述三维物体是受外部磁力影响形成三维物体簇的小颗粒的聚集。
59.如权利要求58所述的装置，其中所述三维物体是一个或多个毫米颗粒，并且其中所述毫米颗粒受外部磁力影响在反应容器中移动。
60.如权利要求56所述的装置，其中所述水凝胶由聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚氨酯(PU)、聚(乙二醇)(PEG)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、或聚酰亚胺(PI)、或其组合制成。
61.如权利要求23所述的装置，其中一种或多种指示剂染料用作起始pH值的指示剂。
62.如权利要求61所述的装置，其中一种或多种pH指示剂与每种受制于不同pKa的pH指示剂一起使用。
63.如权利要求61所述的装置，其中使用至少两种pH指示剂来给出所述起始pH值超出范围的指示。
64.如权利要求61所述的装置，其中在反应前没有线存在的地方出现了线或其它图案表明观察到化学或生物反应。
65.如权利要求61所述的装置，其中比色变化表明观察到化学或生物反应。
66.如权利要求23所述的装置，其中使用扩增方法来进行反应，并且所述方法是热循环法或等温法。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述热循环法是PCR，实时PCR或逆转录PCR。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述等温法是环介导扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、重组聚合酶扩增(RPA)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导扩增(TMA)、SMART(Nucl.Acids Res.29:e54,2001)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、交叉引物扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、分支滚环扩增(RAM)、切口酶扩增反应(NEAR)、切口酶介导扩增(NEMA,CN100489112C)、等温链扩增(ICA)、指数扩增反应(EXPAR)、信标辅助检测扩增(BAD AMP)、引物生成滚环扩增(PG-RCA)、或其它核酸扩增方法，其中所述扩增不需要热循环。
69.检测核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)一个或多个容器，(b)扩增试剂，和(c)至少一种pH指示剂。
70.如权利要求69所述的试剂盒，其中所述pH指示剂是1-羟基-4-[4-(羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-萘-2-磺酸钾或4-[4-(2-羟乙基磺酰基)-苯偶氮基]-2,6-二甲氧基苯酚，或任何反应性乙烯基磺酰基染料或其组合。
71.pH检测装置，其包括：控制用于计算信号强度的电路的pH敏感传感器组件，和显示器像素组件，其中所述组件印刷在电介质材料上。
72.如权利要求71所述的装置，其中所述电介质材料是软质塑料。
73.用于检测化学或生物样品中比色变化的装置，所述装置包括：
a.电子印刷在电极上的至少两个光电导体；
b.覆盖一个光电导体的有机膜，其中覆盖一个光电导体的一个膜充当对照并且不与测试介质相互作用；
c.检测另一个光电导体颜色变化的pH测量装置；
d.电池；和
e.数据和动力输入和输出。
74.如权利要求73所述的装置，其中用作所述膜的有机材料是聚丙氨酸，并且其中pH值变化反映为颜色变化。
75.通过使用根据pH值变化测量导电率的印刷电子元件测量pH值变化的装置，所述装置包括：
a.隔间或层，其中放置至少两个电极，并且其中所述电极是印刷电极，并且其中放置底物或分析物；
b.其后，包含印刷pH传感材料的第二隔间或层；和
c.具有绝缘性以在所述印刷电极和所述底物或分析物之间造成屏障的第三隔间或层。
76.如权利要求75所述的装置，其还包括分配器电路，以记录转化为可测量电压的电阻。
77.如权利要求76所述的装置，其中所述电压变化是以电泳和/或电层析方式显示。
78.用于感测化学和/或生物反应的方法，所述方法包括：
a.检测电信号输出；
b.监测当化学和/或生物反应中的pH值变化时的电信号；其中用于所述反应电子检测的检测组件和监测组件中的至少一种在实体上。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述化学和/或生物反应的检测是在单一区域；使用差分输出；或在反应期间的不同时间点测量pH。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述反应是PCR反应、实时PCR或逆转录PCR。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述反应是比色反应。
82.如权利要求79所述的方法，其中所述反应是等温反应。
83.如权利要求77所述的方法，其中所述等温反应是单链置换扩增(SDA)、DNA扩增、RNA扩增或其组合。
84.如权利要求23所述的方法，其中所述敏感指示剂染料是与所述扩增试剂一起冻干的。
85.如权利要求23所述的方法，其中使用至少两种pH指示剂来给出所述起始pH超出范围的指示。
86.如权利要求85所述的方法，其中每种敏感指示剂染料用作所述起始pH值的指示剂。
87.如权利要求79所述的方法，其中所述等温方法为环介导扩增(LAMO)、链置换扩增(SDA)、重组聚合酶扩增(RPA)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导扩增(TMA)、SMART(Nucl.Acids Res.29:e54,2001)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、交叉引物扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、分支滚环扩增(RAM)、切口酶扩增反应(NEAR)、切口酶介导扩增(NEMA,CN100489112C)、等温链扩增(ICA)、指数扩增反应(EXPAR)、信标辅助检测扩增(BAD AMP)、引物生成滚环扩增(PG-RCA)、或其它核酸扩增方法，其中所述扩增不需要热循环。
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