CN105879030A - 治疗肿瘤的增效药物复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医药、生物技术领域，涉及一种治疗肿瘤的增效药物复合物及其制备方法，该药物复合物由一种或多种细胞自噬抑制剂与精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶制成治疗肿瘤的增效药物复合物，该增效药物复合物通过组合给药或序贯使用方式能通过细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬增加肿瘤细胞对精氨酸酶的敏感性，增强精氨酸酶尤其是人重组精氨酸酶对肿瘤尤其是三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。本发明药物复合物可用于临床对于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、脑瘤、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤的治疗。

Description

治疗肿瘤的增效药物复合物及其制备方法

技术领域

本发明属医药、生物技术领域，涉及抗肿瘤药物，具体涉及一种治疗肿瘤的增效药物复合物及其制备方法，尤其涉及由一种或多种细胞自噬抑制剂与与人重组精氨酸酶制成的增效药物复合物，该增效药物复合物通过组合给药或序贯使用方式可用于增强人重组精氨酸酶对乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、脑瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，尤其是三阴性乳腺癌的治疗效果。

背景技术

现有技术公开了精氨酸酶是哺乳动物肝脏中参与尿素循环的一种关键酶，在尿素循环中将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。精氨酸是维持部分肿瘤细胞生长的半必需氨基酸，肿瘤细胞内精氨酸水平低于一定值后，会导致细胞死亡。精氨酸酶能在体内外特异高效的降解精氨酸；有研究在体外试验中，显示精氨酸酶能显著杀伤肝癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞以及白血病细胞等；已知精氨酸在人体的正常生理功能中具有重要作用，是一种半必须氨基酸，正常体细胞能够通过尿素循环将其他氨基酸转化为精氨酸，从而抵消外源性精氨酸缺乏；然而，对于部分精氨酸依赖的肿瘤细胞，由于缺乏尿素循环过程中的关键酶，在外源性精氨酸剥夺时，无法自身合成精氨酸，最终导致细胞死亡。研究还报道了精氨酸酶能够降解精氨酸，导致精氨酸依赖的肿瘤细胞死亡，而对正常细胞无影响。因此，精氨酸酶是一种有很大应用前景的蛋白酶类药物。有研究将精氨酸酶用于肝癌的治疗用研究已经完成二期临床试验，表现出良好的应用前景。

乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，在欧美国家的发病率占女性恶性肿瘤的首位。我国虽然属乳腺癌相对低发地区，但发病率正逐年上升，在某些大城市已升至女性恶性肿瘤的首位，严重威胁着广大妇女身体健康和生活质量。

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是本领域根据细胞形态和细胞表面受体情况分出的一个乳腺癌亚型，统计显示，三阴性乳腺癌占全部乳腺癌的10％～20％。三阴性乳腺癌是指雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progeste rone receptor，PR)与人类表皮生长因子受体2(human epiderma growth factorreceptor-type 2，HER-2)均为阴性的一类乳腺癌，其具有侵袭性生物学行为及临床病理特征的一个乳腺癌亚型，与基底细胞样乳腺癌和乳腺癌易感癌基因1(breast cancersusceptib itity genel，BRCA I)相关性乳腺癌有一定相关性。治疗实践显示，该类型乳腺癌对常规标准治疗方案效果欠佳，易发生远处转移，且缺乏相对有效的治疗靶点，预后较其他类型乳腺癌差。

细胞自噬(autophagy)又称II型程序性死亡(type II programmed cell death)，是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradation)的现象，通常根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切，其中大自噬(以下简称自噬)与肿瘤发展及治疗关系最为密切。

一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。研究显示，自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏可引起自噬底物p62积聚，通过NF-κB信号途径引起肿瘤形成，然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4％上升到37％。这也说明了在营养缺乏等条件下自噬也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制

由于自噬在肿瘤发生及发展中所起的作用尚不明确，故其在抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞过程中所起的作用也不尽相同，大致可以概括为两种：一种是对肿瘤细胞的保护，另一种则是对肿瘤细胞的杀伤。有研究公开了化疗药物5-FU以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)均能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性；迄今为止，尚未见有关人重组精氨酸酶诱导肿瘤细胞自噬以及与细胞自噬抑制剂制成复方药物或组合物治疗肿瘤的相关报道。

与本发明相关的文献有：

1，Lam TL，Wong GK，Chong HC，Cheng PN，Choi SC，Chow TL，et al.Recombinant humanarginase inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest.Cancerletters.2009；277：91-100

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发明内容

本发明的目的是针对目前人重组精氨酸酶的抗肿瘤作用虽得到了广泛的论证，但其存在体内亲和力较低，起效剂量较大，且存在潜在的毒副作用的缺陷，提供一种治疗肿瘤的增效药物复合物及其制备方法，具体涉及一种由细胞自噬抑制剂与精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶制成的治疗肿瘤的增效药物复合物，该增效药物复合物能增强精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶的活性，降低其用量和毒副作用。

本发明的增效药物复合物通过组合给药或序贯使用方式可用于增强精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶对肿瘤的治疗效果。

具体的，本发明提供了一种治疗肿瘤的增效药物组合物，其特征在于，该增效药物组合物由一种或多种细胞自噬抑制剂与精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶制成的治疗肿瘤的增效药物复合物；该增效药物复合物的一种或者几种自噬抑制剂与精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶通过使用联合给药或是序贯给药的方式，可以通过细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬增加肿瘤细胞，尤其是三阴性乳腺癌细胞对人重组精氨酸酶的敏感性，从而增强人重组精氨酸酶对肿瘤的治疗效果。

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂包括但不限于：3-MA(3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放线菌酮(Cycloheximide)、巴佛洛霉素A1(BafilomycinA1)、NH₄Cl、氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine)；本发明的实施例中，优选3-MA、氯喹、羟基氯喹和巴佛洛霉素A1。

本发明中所述的精氨酸酶通过诱导乳腺癌细胞凋亡和抑制细胞生长杀伤肿瘤细胞，所述的精氨酸酶包括但不限于人重组精氨酸酶，鼠源精氨酸酶以及各种长效化修饰的精氨酸酶，其中包括但不限于聚乙二醇修饰的人重组精氨酸酶、多聚唾液酸修饰的人重组精氨酸酶；

本发明中，所述的增效药物复合物可用于治疗的肿瘤包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、脑瘤、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，本发明的一个实施例中尤其可用于治疗三阴性乳腺癌；

本发明提供的治疗肿瘤的药物增效复合物，可以通过抑制精氨酸酶诱导的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对精氨酸酶治疗的拮抗作用，从而显著增强精氨酸酶对肿瘤的治疗效果，尤其是自噬抑制剂与精氨酸酶的序贯使用能增强精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶对肿瘤的杀伤作用和治疗恶性肿瘤的疗效。

本发明的治疗肿瘤的药物增效复合物，进一步以选择以下一组中的形式进行配方：片剂、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。

本发明进行了体外细胞试验，结果表明：在精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)杀伤肿瘤细胞时，细胞自噬能保护肿瘤细胞免于细胞死亡，从而降低了药物的疗效；本发明的一个实施例中，采用人重组精氨酸酶能显著诱导三阴性乳腺癌细胞发生细胞自噬，而细胞自噬则会部分抵消精氨酸酶的抗肿瘤效果；而通过使用细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬则能增加三阴性乳腺癌细胞对人重组精氨酸酶的敏感性，从而增强人重组精氨酸酶的疗效。

本发明提供了由一种或多种细胞自噬抑制剂与精氨酸酶，尤其是人重组精氨酸酶制成的药物复合物，该药物复合物采用联合给药或是序贯使用方式通过细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬增加肿瘤细胞对精氨酸酶的敏感性，增强精氨酸酶尤其是人重组精氨酸酶对肿瘤尤其是三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。

本发明药物复合物可用于临床对于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、脑瘤、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤的治疗。

附图说明

图1显示了人重组精氨酸酶能诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞发生细胞自噬。

图2显示了人重组精氨酸酶能抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的增殖并诱导其发生凋亡。

图3显示了抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测。

图4显示了抑制自噬能增强人重组精氨酸酶诱导的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制和凋亡。

图5显示了重组精氨酸酶诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞产生活性氧。

具体实施方式

实施例1：制备人重组精氨酸酶

采用现有技术PCR的方法获得编码人精氨酸酶的编码序列，该基因编码序列全长969bp，带有酶切位点XhoI和EcoRI，用XhoI和EcoRI内切酶分别双酶切PCR产物和空质粒载体，将目的基因与载体连接后转化氨苄抗性平板，挑取若干个阳性转化子，取其中一个扩增并提取质粒，进行XhoI和EcoRI内切酶双酶切鉴定；提取重组质粒，将重组载体用BglII酶切使线性化，电击转化毕赤酵母；挑取阳性转化子，通过RDB、MM和MD平板筛选，得到表型为his+muts的克隆子，进一步在摇床水平上进行诱导表达，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测摇床水平上精氨酸酶的表达情况，从而筛选分泌表达精氨酸酶的重组子；样品纯化，将酵母离心后取上清，经超滤浓缩，采用凝胶排阻层析进行精制；

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC进行纯度检测，结果显示，获得的人重组精氨酸酶纯度约为97％，保存于4摄氏度冰箱，使用前用细胞培养基稀释至使用浓度。

实施例2：配方自噬抑制剂药物

(1)氯喹的配制：取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

(2)氯化铵的配制：取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；

(3)羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

(4)3-MA的配制：取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；

(5)LY294002的配制：取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；

(6)巴伐洛霉素A1的配制：取适量巴伐洛霉素A1干粉配制成0.5μg/ml的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬；

(7)自噬抑制剂与精氨酸酶联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂3-MA的使用浓度范围为0-1mol/L，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹的使用浓度范围为0-50mol/L，LY294002的使用浓度范围为0-1mol/L，巴伐洛霉素A1的使用浓度范围为0-10mol/L，精氨酸酶的使用浓度范围为0-100IU/ml。

实施例3：人重组精氨酸酶诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞发生细胞自噬

MDA-MB-231细胞用1U/ml的精氨酸酶处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图1A所示，给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现；用1IU/ml的精氨酸酶处理24h，再用Cyto-ID和Hoechst三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中，在激光共聚焦显微镜下观绿色荧光斑点，结果如图1B显示，给药组细胞内有大量的荧光斑点，而对照组较少；

将收集的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞用PBS洗1次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20μg进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭1h，加入相应抗体，于4℃孵育12h，TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色；三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞经不同时间及不同浓度人重组精氨酸酶处理后，进行Western Blot检测，结果如图1C和1D所示，与对照组相比，经人重组精氨酸酶组干预的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的LC3II的表达水平增强。

实施例4：人重组精氨酸酶抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的增殖并诱导其发生凋亡试验

将适当浓度的三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)种在96孔培养板内，加入不同浓度的精氨酸酶，体系终体积为100μL，培养72h，向每孔加入10μMTT液，在培养箱内放置4h，之后用含DMSO溶解，570nm下测量光密度值(O.D.)；结果如图2A显示，精氨酸酶处理72h显著地抑制了细胞的增殖，并且如图2B所示1U/ml的精氨酸处理72h后显著地诱导了MDA-MB-231细胞的凋亡。

实施例5：抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测

用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20μg蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果如图3所示：经过1IU/ml人重组精氨酸酶处理的MDA-MB-231细胞的LC3II的表达量高于对照组，经过20μM CQ和1IU/ml人重组精氨酸酶处理后的MDA-MB-231细胞的LC3II的表达量高于1IU/ml人重组精氨酸酶单独处理后的MDA-MB-231细胞；而经过1IU/ml人重组精氨酸酶和2mM的3-MA处理后的MDA-MB-231细胞的LC3II的表达量低于1IU/ml人重组精氨酸酶处理后的MDA-MB-231细胞；由于3-MA是一种PI3K III抑制剂，PI3K III在细胞自噬的调控中起重要的作用，其能与Beciln 1等分子结合，参与调控自噬体膜的运输，因此抑制PI3K III将阻遏自噬体的形成，从而起到抑制细胞自噬的作用；实验表明，由于自噬体膜的形成与运输受阻，导致ATG8/LC3分子无法通过泛素化在自噬体膜上定位，因此LC3II分子的表达水平会降，Western Blot的结果证明2mM的3-MA能抑制由1IU/ml人重组精氨酸酶所诱导的MDA-MB-231细胞诱发的自噬；作为自噬溶酶体的抑制剂CQ能造成溶酶体的碱化，使溶酶体酶失去活性，从而造成自噬体的堆积，造成了自噬体无法在溶酶体内进行降解，导致了处于自噬体膜表面的LC3II分子的量增加；实验结果证实20μM的CQ能抑制由1IU/ml人重组精氨酸酶诱导的MDA-MB-231细胞的细胞自噬。

实施例6：抑制自噬能增强人重组精氨酸酶诱导的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制和凋亡

将适当浓度的三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)种在96孔培养板内，加入不同浓度的精氨酸酶和CQ(20μM)或者3-MA(2mM)体系终体积为100μL，培养72h，向每孔加入10μMTT液，在培养箱内放置4h，之后用含DMSO溶解，570nm下测量光密度值(O.D.)；结果显示(如图4A和4B所示)，自噬抑制剂(CQ和3-MA)明显增强人重组精氨酸酶诱导的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制；

MDA-MB-231细胞经过人重组精氨酸酶和抑制剂处理72小时经过流式细胞检测，将收集到的MDA-MB-231细胞用PBS洗1次后，加入500μl结合液和5μl AnexinV-FITC，避光室温孵育15min，随即进行流式细胞检测，结果如图4C所示，经过1IU/ml人重组精氨酸酶处理72h的MDA-MB-231细胞的细胞凋亡率高于对照组，而1IU/ml人重组精氨酸酶与20μM的CQ联合干预的MDA-MB-231细胞的细胞凋亡率显著高于1IU/ml人重组精氨酸酶单独处理的MDA-MB-231细胞。

实施例7：重组精氨酸酶诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞产生活性氧

MDA-MB-231细胞经过0.5IU/ml和2U/ml人重组精氨酸酶处理72h，收集细胞，经过DCFH-DA标记，随即进行流式细胞检测；经人重组精氨酸酶干预后的MDA-MB-231细胞与对照组相比，活性氧的产生量明显增加(如图5A所示)，抗氧化剂NAC(20mM)能明显减弱L3-II的产生，即明显减弱自噬(如图5B所示)；NAC(20mM)减弱重组精氨酸酶对MDA-MB-231细胞生长抑制作用(如图5C所示)。

Claims (9)

1.一种治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，由一种或多种细胞自噬抑制剂与精氨酸酶，制成治疗肿瘤的增效药物复合物。

2.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA(3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放线菌酮(Cycloheximide)、巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)、NH₄Cl、氯喹(Chloroquine)或羟基氯喹(hydroxychloroquine)。

3.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、氯喹、羟基氯喹和巴佛洛霉素A1。

4.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的精氨酸酶选自人重组精氨酸酶，鼠源精氨酸酶以及长效化修饰的精氨酸酶。

5.按权利要求4所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的长效化修饰的精氨酸酶选自聚乙二醇修饰的人重组精氨酸酶或多聚唾液酸修饰的人重组精氨酸酶。

6.按权利要求1-5任一所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的药物复合物其中的组分序贯使用。

7.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的肿瘤是乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、脑瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。

8.按权利要求7所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的乳腺癌、是三阴性乳腺癌。

9.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效药物复合物，其特征在于，所述的药物复合物以下述一组中的形式进行配方：片剂、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。