[go: up one dir, main page]

CN105859867A - 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用 - Google Patents

一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105859867A
CN105859867A CN201610366249.3A CN201610366249A CN105859867A CN 105859867 A CN105859867 A CN 105859867A CN 201610366249 A CN201610366249 A CN 201610366249A CN 105859867 A CN105859867 A CN 105859867A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
antimicrobial peptide
people
peptide
antibacterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610366249.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杨浩
刘俊
付靖瑜
韩跃武
罗鹏程
汪宏良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HUANGSHI CENTER HOSPITAL
Original Assignee
HUANGSHI CENTER HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUANGSHI CENTER HOSPITAL filed Critical HUANGSHI CENTER HOSPITAL
Priority to CN201610366249.3A priority Critical patent/CN105859867A/zh
Publication of CN105859867A publication Critical patent/CN105859867A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人源抗菌肽LL‑37突变体及其应用，通过对抗菌肽LL‑37分子结构进行优化设计，将抗菌肽LL‑37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸，实验结果证明突变体具有优良的抗菌活性和稳定性；本发明主要用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。

Description

一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用。
背景技术
抗菌肽是生物体天然免疫的重要组成成分，自发现以来，由于其分子量低、抗菌谱广，抗菌机制独特而显示了其在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值，其研究及应用已成为抗菌生物技术药物领域的研究热点。
目前用于开发抗菌肽生物制剂主要是含有生物活性核心区域的内源性抗菌肽，此类多肽用于药品和食品领域，主要存在以下问题：①要解决药效动力学、毒理学、以及潜在的免疫毒性问题；②抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，其稳定性有待提高；③小分子物质的分离、纯化困难；④抗菌肽的天然资源有限，依靠化学合成抗菌肽成本较高，而通过基因工程在微生物体内直接表达基因，要解决提高抗菌肽生产效率、降低成本等问题；⑤与传统的抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性还不够理想，需要对抗菌肽做改良设计以提高其抗菌活性。
抗菌肽LL-37是来源于人的一种α-螺旋型阳离子抗菌肽，它具有广谱抗菌活性，可以抗多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌，而且还可通过免疫调节、促进创伤修复、诱导血管生成等，是人体固有免疫防御系统的重要组成部分。文献《The lipid Apalmitoyltransferase PagP: molecular mechanisms and role in bacterialpathogenesis》和《Biofilms formed by gram-negative bacteria undergo increasedlipid a palmitoylation, enhancing in vivo survival》中指出革兰氏阴性菌细胞外膜的棕榈酰转移酶PagP被激活后通过对脂质A酰化，修复细菌外膜通透性从而产生对抗菌肽的抗性。
目前，抗生素滥用导致的药物残留和细菌耐药等问题越来越受到人们的重视，细菌对传统抗生素产生耐药性已成为亟待解决的全球性问题。因此，通过抑制脂质A酰化这一途径，研发新的抗菌药物，是本发明课题研究的重要内容。
发明内容
本发明的目的就是针对细菌耐药性的问题，对抗菌肽LL-37进行优化设计，提供一种抗菌活性更好、稳定性高的抗菌肽LL-37的突变体及其应用。
本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体，所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸（G），第三个氨基酸为亮氨酸（L），第十六个氨基酸为谷氨酰胺（Q），第二十六个氨基酸为赖氨酸（K），第三十四个氨基酸为苏氨酸（T），第三十五个氨基酸为精氨酸（R），其它氨基酸残基序列不变。
本发明的一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸。
本发明的一种载体，所述载体中含有上述的多核苷酸。
本发明的一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞中含有上述载体。
本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，包括以下步骤：
（1）利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件Antheprot、分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam DensityFunctional)对抗菌肽LL-37的核酸序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础；
（2）在抗菌肽LL-37突变体的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；
（3）将表达载体转化导入GS115酵母菌中，经提取后鉴定得到重组基因工程菌；
（4）重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液，经分离纯化获得重组抗菌肽LL-37突变体蛋白。
本发明中所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。
本发明中所述载体为pPICZαA。
本发明中所述酵母菌为毕赤酵母。
本发明中所述分离纯化方法为现有技术盐析、沉淀、液相层析技术和透析的结合。
本发明所述的突变体用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。
本发明是基于抗菌肽LL-37不同长度的水解片段具有较好的生物学活性，以革兰阴性菌细胞膜棕榈酰转移酶PagP的耐药机制为基础，阳离子抗菌肽通过细菌PhoP-PhoQ 调节系统调控调控细胞膜棕榈酰转移酶PagP表达与活性，促进脂质A酰化，进而影响阳离子抗菌肽与细菌细胞膜的结合，抑制抗菌肽活性。以该途径为突破口，结合α-螺旋型阳离子抗菌肽两亲性、α-螺旋程度等因素对抗菌肽LL-37 的氨基酸残基进行替换、增减等方式，重新设计，获得突变体的氨基酸序列和核苷酸序列。
选取大肠埃希菌Escherichia coli (strain K12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP作为受体，参见附图1，以抗菌肽LL-37及其氨基酸残基为配体，参见附图2，进行分子对接和动力学模拟。
选取抗菌肽LL-37 5位苯丙氨酸到32位缬氨酸中间部位的氨基酸片段作为配体，受体选取棕榈酰转移酶PagP外膜外侧。使用AutoDock对抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶PagP进行分子对接，设定格点空间大小为60*60*60 Å3，坐标为（7.063，32.452，49.199），采用拉马克遗传算法对接。
通过对接发现抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的结合位点，参见附图3，包括抗菌肽LL-37中的GLU11，LEU28、LYS12、PHE27、ILE13和PHE6，棕榈酰转移酶PagP中的ARG94，TRP89，ASN65，SER3，GLU90、GLU90，ASN100、HIS102和THR92。重复多次对接后确定最好的对接构象，对应的配体效率值见表1。
从上表1可以看出，8种LL-37片段作为配体与受体对接时，配体效率从-1.6100~ -2.2389Kcal/mol，为后续LL-37突变体的设计奠定了实验基础。
利用ADF2014 (Amsterdam Density Functional)软件，采用ReaxFF方法，首先对抗菌肽LL-37和棕榈酰转移酶PagP进行优化，获得最小能量结构下的原子位置和晶格参数。然后，设定ReaxFF模拟参数与条件，在100*100*100 Å3的周期性空间内，采用随机均匀的方式放入4个抗菌肽LL-37分子和1个棕榈酰转移酶PagP分子，温度设定为室温298K，采用Velocity Verlet（NVT）系综，进行0皮秒内的内部压力弛豫分析，使温度和压力在预定值附近波动，经过不同时间节点，分析体系构象。在对产物的识别分析中，为研究分子的性质，采用密度泛函理论（使用PBE-D3(BJ)泛函，TZ2P基组）计算分子间键能。
ReaxFF方法模拟表明：
在0皮秒时，体系呈周期性地随机分布于单元为100*100*100 Å3的空间内，分子之间的最短距离不小于2.5埃。
体系经过8.75 皮秒时，由于LL-37与棕榈酰转移酶PagP的疏水基团互相融合发生接触，参见图4，其中球形原子为LL-37与PagP发生接触的原子，结构图中红色、蓝色、白色、灰色小球分别表示O、N、H、C原子，左边区域来自抗菌肽LL-37，右边区域来自棕榈酰转移酶PagP。
体系经历20皮秒，没有观察到解离的趋势，此时计算弱键-C-O-H…NH2-CH2-的键能为-14.97kcal/mol。
上述研究结果表明，抗菌肽LL-37与大肠埃希菌外膜上的棕榈酰转移酶PagP发生接触的原子构象比较稳定，其弱键-C-O-H…NH2-CH2-的键能达到-14.97kcal/mol，该键是连接抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的重要桥梁，其中-NH2来自抗菌肽LL-37分子的中部，在抗菌肽LL-37弯折攀爬到棕榈酰转移酶PagP表面之后，-NH2基团被带到了接触区域，进而形成稳定的化学键。
因此，抗菌肽LL-37分子结构的柔性，分子中的氨基在抗菌肽发挥抗菌活性的过程中扮演了重要角色，同时为抗菌肽LL-37突变体设计提供了可靠的理论基础。
附图说明
图1大肠埃希菌Escherichia coli (strain K12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP3D模式图；
图2抗菌肽hCAP-18/LL-37 3D模式图；
图3抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶PagP结合位点；
图4体系经过8.75皮秒后抗菌肽LL-37 与棕榈酰转移酶PagP 的“纠缠”结构；
图5抗菌肽LL-37及其突变体的亲疏水性氨基酸分布和螺旋图（左边：抗菌肽LL-37；右边：LL-37突变体）；
图6抗菌肽LL-37突变体的色谱图；
图7抗菌肽LL-37突变体的质谱图；
图8抗菌肽LL-37及其突变体对临床1号菌株的抗菌活性图；
图9抗菌肽LL-37及其突变体对临床2号菌株的抗菌活性图；
图10抗菌肽LL-37及其突变体对临床3号菌株的抗菌活性图；
图11抗菌肽LL-37及其突变体对临床4号菌株的抗菌活性图；
图12抗菌肽LL-37及其突变体对临床5号菌株的抗菌活性图；
图13抗菌肽LL-37及其突变体对临床6号菌株的抗菌活性图；
图14抗菌肽LL-37及其突变体对临床7号菌株的抗菌活性图；
图15抗菌肽LL-37及其突变体对临床8号菌株的抗菌活性图；
图16抗菌肽LL-37及其突变体对临床9号菌株的抗菌活性图；
图17抗菌肽LL-37及其突变体对临床10号菌株的抗菌活性图；
图18抗菌肽LL-37及其突变体对临床11号菌株的抗菌活性图；
图19抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抗菌活性图；
图20抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抗菌活性图；
图21抗菌肽LL-37、抗菌肽LL-37突变体及硫酸多粘菌素B对ATCC25922大肠埃希菌标准菌株的抑菌率。
具体实施方式
实施例1 抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法
（1）抗菌肽LL-37突变体基因的设计和合成
在抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点，合成密码子优化基因，连接到大肠杆菌克隆载体pUC57上，得到重组载体pUC57-LL-37 revised。
（2）重组抗菌肽LL-37突变体基因的表达载体构建
选择pPICZαA作为载体，将上述重组载体pU57-LL-37 revised经酶切、纯化后与pPICZαA按照3:1的分子数进行连接，进行转化与诱导表达。
连接体系的配制：2.5μL酵母表达载体pPICZαA，9.0μL纯化的核酸片段，4.0μL连接酶缓冲液（10倍），0.5μL T4连接酶，用二次蒸馏水补充至40μL混合均匀，在16℃条件下放置12h，形成混合物备用。连接产物转化至感受态的大肠埃希菌感受态细胞DH5α中，筛选重组质粒。
（3）重组抗菌肽LL-37突变体基因的毕赤酵母工程菌构建
将筛选的重组质粒进行测序，测序正确的质粒经SacI线性化处理后，转入毕赤酵母GS115。接种入5mLYPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养24h，取1mL上述培养菌液接入300mL/1000mL锥形瓶的YPD液体培养基中，30℃，250rpm培养至光密度（OD）达到1.3-1.5后，在4℃，1500g离心5min，丢弃上清液，加入300mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体，在4℃，1500g离心5min，丢弃上清液，加入150mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体，在4℃，1500g离心5min，丢弃上清液，加入20mL的预冷1mol/L无菌山梨醇溶液重悬菌体，离心后，丢弃上清液，加入1mL的预冷1mol/L无菌山梨醇溶液（含10%-15%甘油），轻轻混匀后，10μL每管分装备用。加入10μL线性质粒至100μL毕赤酵母菌GS115感受态细胞中，轻轻摇匀后将混合物转移至电转杯中，将电转杯至于冰块上5-10min，电击10ms，电压为10ms，电阻为200Ω，电击完成后立即加入1mL预冷山梨醇溶液，婚后后转至1.5mL离心管中，30℃静置或缓慢摇菌培养1h。取200μL菌液涂布在含100μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃培养3天后，平板上即长出克隆，随机挑选10个克隆，并在含Zeocin的YPD平板上划线纯化，通过PCR鉴定阳性克隆菌pPICZαA-LL37revised/GS115。
（4）重组抗菌肽LL-37突变体的诱导表达及纯化
挑取经PCR鉴定的阳性克隆，接种至20mL BMGY培养基中，30℃，300 rpm 培养 16-18 h至 OD600=5；3000g离心5 min收集菌体，加入少量BMGY培养基重悬菌体至OD600=1时转接至200 mL BMGY培养基中，30℃，300rpm摇菌培养并进行诱导表达；每24h向培养基中补加100%甲醇至其终浓度达0.5%，连续诱导72 h，将培养后的菌液经超声处理，裂解细胞，离心后洗涤、溶解；3000g离心5min收集培养上清定容后，缓慢加入固体硫酸铵至其饱和度达到80%，置于4 ℃沉降过夜；10000g 离心30min收集蛋白沉淀，加入 TBS (pH 7.5）溶解蛋白沉淀后，在TBS缓冲液中充分透析；4℃，8000g离心30min，取上清，使用0.45 μm滤膜进行抽滤，除去大蛋白颗粒；将TBS平衡的蛋白样品上到TBS充分清洗的Ni-NTA亲和层析柱(GEHealthcare)中，再用TBS清洗柱子；用含200mM咪挫的TBS缓冲液洗脱，并收集洗脱峰，将收集的蛋白样品于PBS缓冲液中充分透析，即得到了抗菌肽LL-37突变体蛋白。
（5）抗菌肽LL-37突变体检测
采用高效液相色谱分析上述抗菌肽LL-37突变体蛋白纯度，参见图6；采用质谱测定抗菌肽LL-37突变体的分子大小，参见图7。
从图6可以看出，从10min开始无杂峰出现，抗菌肽LL-37突变体的出峰时间为12.078min，波峰单一、波形呈正态分布，抗菌肽LL-37突变体纯度达到96.85%，可以用于抑菌实验等活性的研究。图7的质谱图显示，突变体的分子量为4505.4 Da，与理论估计的分子量一致，说明该物质是目的多肽。
实施例2 抗菌肽LL-37突变体的应用
将本发明的抗菌肽LL-37突变体加入按照药剂学上常用辅料，制成注射剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、软膏剂等。
实施例3 抗菌肽LL-37及其突变体的理化性能
利用蛋白质在线分析工具和蛋白质分析软件Antheprot，分析抗菌肽LL-37及其突变体的系列及其理化性能，得到抗菌肽LL-37及其突变体的核苷酸系列和理化性能表，分别见下表2和表3所示。
从上表3可以看出，抗菌肽LL-37突变体的理论等电点明显提高、半衰期明显延长，说明在相同PH环境下，抗菌肽LL-37突变体的净电荷量明显提高、体外稳定性更好；突变体的螺旋程度和亲疏水性与抗菌肽LL-37相比，未见明显差异，参见附图5。
实施例4 抗菌肽LL-37突变体的抑菌活性
将合成所得的多肽，采用抑菌实验研究其抗菌活性。以临床收集分离得到的11种致病大肠埃希菌和2种大肠埃希菌标准菌株为抑菌对象，利用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2012版检验标准及操作规范文件M07-A9：Methods for Dilution Antimicrobial susceptibility Tests forBacterial That Grow Aerobically；Approved Standard—Ninth Edition做抑菌实验，研究多肽的抗菌活性。
图8-图20表示经过浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、500μg/mL的抗菌肽LL-37及其突变体处理过后的13株大肠埃希菌的光密度（OD）值的变化，结果显示抗菌肽LL-37及其突变体对13株大肠埃希菌均有不同程度抑制作用。
图8表示LL-37及其突变体对临床1号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为2.5 μg/mL时，LL-37突变体对临床1号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图9表示LL-37及其突变体对临床2号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625 μg/mL时，LL-37突变体对临床2号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图10表示LL-37及其突变体对临床3号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625μg/mL时，LL-37突变体对临床3号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图11表示LL-37及其突变体对临床4号菌株的抑菌作用，结果显示LL-37与其突变体对临床4号菌株的抑菌能力相当。
图12表示LL-37及其突变体对临床5号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为2.5 μg/mL时，LL-37突变体对临床5号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图13表示LL-37及其突变体对临床6号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625μg/mL时，LL-37突变体对临床6号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图14表示LL-37及其突变体对临床7号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25 μg/mL时，LL-37突变体对临床7号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图15表示LL-37及其突变体对临床8号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25μg/mL时，LL-37突变体对临床8号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图16表示LL-37及其突变体对临床9号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为5μg/mL时，LL-37突变体对临床9号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图17表示LL-37及其突变体对临床10号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25μg/mL时，LL-37突变体对临床10号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图18表示LL-37及其突变体对临床11号菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为1.25μg/mL时，LL-37突变体对临床11号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图19表示LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625μg/mL时，LL-37突变体对ATCC25922菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
图20表示LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抑菌作用，结果显示在浓度为0.625μg/mL时，LL-37突变体对ATCC35218菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强（p<0.05）。
从上述抑菌实验结果可以得出，LL-37及其突变体对13种不同大肠埃希菌株的最小抑菌浓度（MIC），见下表4。
从表4可以看出，抗菌肽LL-37及其突变体对13株不同大肠埃希菌株的最小抑菌浓度均≤20μg/mL，除临床4号菌株最小抑菌浓度相同外，抗菌肽LL-37突变体对其他12株大肠埃希菌的最小抑菌浓度（MIC）均明显小于LL-37（ p＜0.01）。
实施例5 抗菌肽LL-37突变体的稳定性
根据抑菌实验确定突变体的最低抑菌浓度，选择浓度为1.25μg/mL的抗菌肽LL-37及其突变体、硫酸多粘菌素B分别作用于ATCC25922大肠埃希菌标准菌株，分别经过6h、12h、24h、48h处理后，抗菌肽LL-37及其突变体、硫酸多粘菌素B对ATCC25922大肠埃希菌标准菌株的抑菌效果，参见图21所示。硫酸多粘菌素B是目前临床使用的多肽类抗生素，它主要通过干扰细菌膜通透性与核糖体功能而发挥抗菌作用，对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。
从图21可以看出，抗菌肽LL-37突变体经过6h、12h、24h、48h作用于ATCC25922大肠埃希菌标准菌株均可明显抑制大肠埃希菌的增殖，其抑菌效果明显好于硫酸多粘菌素B（P<0.05）和抗菌肽LL-37（p<0.01）。浓度为1.25μg/mL的LL-37突变体经过48h作用后，仍能较好的抑制ATCC25922大肠埃希菌标准菌株，由此可见，抗菌肽LL-37突变体的稳定性好。

Claims (10)

1.一种人源抗菌肽LL-37突变体，其特征在于：所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸（G），第三个氨基酸为亮氨酸（L），第十六个氨基酸为谷氨酰胺（Q），第二十六个氨基酸为赖氨酸（K），第三十四个氨基酸为苏氨酸（T），第三十五个氨基酸为精氨酸（R），其它氨基酸残基序列不变。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸。
3.一种载体，其特征在于：所述载体中含有如权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的载体。
5.一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件Antheprot、分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam DensityFunctional)对抗菌肽LL-37的序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础；
（2）以分子对接和动力学模拟的结果为基础，对抗菌肽LL-37部分氨基酸残基进行替换或顺序调整，得到其突变体，在抗菌肽LL-37突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；
（3）将表达载体转化导入GS115酵母菌中，经提取后鉴定得到重组基因工程菌；
（4）重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液，经分离纯化获得重组抗菌肽LL-37突变体蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。
7.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：所述载体为pPICZαA。
8.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：所述酵母菌为毕赤酵母。
9.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：所述分离纯化方法为盐析、沉淀、液相层析技术和透析的结合。
10.一种人源抗菌肽LL-37突变体的应用，其特征在于：所述突变体用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。
CN201610366249.3A 2016-05-30 2016-05-30 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用 Pending CN105859867A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610366249.3A CN105859867A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610366249.3A CN105859867A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105859867A true CN105859867A (zh) 2016-08-17

Family

ID=56642495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610366249.3A Pending CN105859867A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105859867A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108659102A (zh) * 2018-04-25 2018-10-16 南方医科大学 具有抗菌及抗炎活性的多肽化合物
CN108892719A (zh) * 2018-07-09 2018-11-27 珠海中科先进技术研究院有限公司 一种新型人源抗菌肽ll-37衍生物及其应用
CN110330553A (zh) * 2019-06-05 2019-10-15 遵义医科大学珠海校区 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用
CN111892646A (zh) * 2020-08-13 2020-11-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用
CN111973805A (zh) * 2019-08-16 2020-11-24 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用
CN114540405A (zh) * 2022-03-04 2022-05-27 成都大学 一种提高毕赤酵母菌抗菌肽ll-37产量的方法及其应用
CN115873076A (zh) * 2022-11-24 2023-03-31 青岛农业大学 一种抗菌肽及其在枯草芽孢杆菌中的表达和应用
CN117777245A (zh) * 2023-06-13 2024-03-29 红河学院 一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用
WO2025082041A1 (zh) * 2024-06-07 2025-04-24 扬州大学 一种抗菌衍生肽及其组合物和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1744913A (zh) * 2003-01-29 2006-03-08 利波佩普泰德公司 Cathelicidin ll－37及其衍生物在伤口愈合中的用途
CN1798764A (zh) * 2003-01-28 2006-07-05 莱顿教学医院 衍生自ll－37的毒素的肽抑制剂
CN105063138A (zh) * 2015-09-14 2015-11-18 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1798764A (zh) * 2003-01-28 2006-07-05 莱顿教学医院 衍生自ll－37的毒素的肽抑制剂
CN1744913A (zh) * 2003-01-29 2006-03-08 利波佩普泰德公司 Cathelicidin ll－37及其衍生物在伤口愈合中的用途
CN105063138A (zh) * 2015-09-14 2015-11-18 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGSHUN WANG等: "High-quality 3D structures shine light on antibacterial, anti-biofilm and antiviral activities of human cathelicidin LL-37 and its fragments", 《BIOCHIM BIOPHYS ACTA》 *
杨浩; 姚海燕; 陈圆圆; 阎波; 郭鹏; 马驰; 韩跃武: "人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体的原核表达及纯化", 《中国生物制品学杂志》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108659102B (zh) * 2018-04-25 2021-08-17 南方医科大学 具有抗菌及抗炎活性的多肽化合物
CN108659102A (zh) * 2018-04-25 2018-10-16 南方医科大学 具有抗菌及抗炎活性的多肽化合物
CN108892719A (zh) * 2018-07-09 2018-11-27 珠海中科先进技术研究院有限公司 一种新型人源抗菌肽ll-37衍生物及其应用
CN108892719B (zh) * 2018-07-09 2021-07-30 珠海中科先进技术研究院有限公司 一种新型人源抗菌肽ll-37衍生物及其应用
CN110330553A (zh) * 2019-06-05 2019-10-15 遵义医科大学珠海校区 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用
CN110330553B (zh) * 2019-06-05 2020-12-29 遵义医科大学珠海校区 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用
CN111973805A (zh) * 2019-08-16 2020-11-24 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用
CN111892646A (zh) * 2020-08-13 2020-11-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用
CN114540405A (zh) * 2022-03-04 2022-05-27 成都大学 一种提高毕赤酵母菌抗菌肽ll-37产量的方法及其应用
CN115873076A (zh) * 2022-11-24 2023-03-31 青岛农业大学 一种抗菌肽及其在枯草芽孢杆菌中的表达和应用
CN117777245A (zh) * 2023-06-13 2024-03-29 红河学院 一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用
CN117777245B (zh) * 2023-06-13 2024-06-07 红河学院 一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用
WO2025082041A1 (zh) * 2024-06-07 2025-04-24 扬州大学 一种抗菌衍生肽及其组合物和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105859867A (zh) 一种人源抗菌肽ll-37突变体及其应用
Elbanna et al. Poly (γ) glutamic acid: A unique microbial biopolymer with diverse commercial applicability
CN105061603B (zh) 抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用
MX357674B (es) Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos.
US8663967B2 (en) Arginine deiminase mutant and preparation and application thereof
Zhao et al. Comparison on effect of hydrophobicity on the antibacterial and antifungal activities of α-helical antimicrobial peptides
KR20200030065A (ko) 변형된 l-아스파라기나아제
RU2004115039A (ru) Растворимые мутантные молекулы ctla4
CN105440125B (zh) 地特胰岛素或其类似物的制备方法
CN102863539A (zh) 融合串联抗菌肽及其制备方法
CN104497119A (zh) 一种天然抗菌肽及其应用
Monincová et al. Structure–activity study of macropin, a novel antimicrobial peptide from the venom of solitary bee Macropis fulvipes (Hymenoptera: Melittidae)
KR101519118B1 (ko) 고안정성 상피세포 성장인자 변이체
CN113087804B (zh) 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN101514229B (zh) 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物
CN111378027A (zh) 一种索玛鲁肽前体的制备方法
Ju et al. Alanine-scanning mutational analysis of durancin GL reveals residues important for its antimicrobial activity
CN103923898A (zh) 一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
CN106434594B (zh) 一种n-乙酰谷氨酸激酶突变体及其应用
CN110117324B (zh) 一种抗肿瘤活性多肽及其用途
WO2012073048A3 (en) Variants of ignar
WO2022142977A1 (zh) HrpZ型多拟表位配体蛋白在食品、化妆品、保健品或制药中的应用
CN111087449B (zh) 一种抗菌肽及其制备方法与应用
CN104404049B (zh) 一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途
CN103421103B (zh) 力墀永肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用、制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160817