CN105821159A - 一种区分pedv变异株和经典株的套式rt-pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，属于PEDV病毒的快速检测技术领域。本发明为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT‑PCR特异性低、灵敏性差的问题；本发明提供了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。

Description

一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法

技术领域

本发明属于PEDV病毒的快速检测技术领域，特别涉及一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法。

背景技术

流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，它的主要特征是呕吐、水样腹泻和脱水死亡；各种年龄的猪均易感，尤其对1～2周龄哺乳仔猪的危害最为严重，发病死亡率可高达90％～100％，Sun R Q等报道2010年10月开始，中国南方有超过十个省爆发了PEDV，导致超过100万头仔猪死亡,给养猪业带来了很大的经济损失。早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需要在临床上运用一种简便、快速、敏感、特异的诊断方法。

目前，可鉴定PEDV病毒分型的主要方法主要是：病毒的分离鉴定以及测序；分子诊断技术；聚合酶链式反应(RT-PCR)技术。作为传统的检测方法，PEDV的病原学检测和分子诊断技术在着许多问题。

PEDV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作困难，所需周期长，PEDV目前只可在个别种类的细胞上生长繁殖(如vero细胞，ST细胞)又由于胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用增强了该病毒对Vero细胞的感染力，所以传代须加入一定浓度的胰酶用于增强病毒在细胞上的适应性，病毒分离期间出现CPE比较困难，并且试验需进行很长时间。病毒分离以后为了最终确认该组织中的病毒是否变异，还需借助基因测序并通过遗传进化分析判断其是否发生变异。虽然这种方法可以作为确诊PEDV是否为变异毒株的最终诊断依据，但此方法不仅操作繁琐，而且成本高、过程复杂、操作时间长，在临床上区分是否为变异毒株感染实用价值不大。

分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，比如：RT-PCR扩增技术，可设计经典毒株特异性的引物进行PCR扩增后，利用凝胶电泳试验观察片段长度所对应的位置，确定是否为经典毒株。但在实际操作过程中特异性不强、准确率较低的情况始终存在，是由于病毒发生变异一般只插入或确实少量的碱基，利用传统RT-PCR很难鉴别病毒的经典毒株与变异毒株，之后依然要用到基因测序并进行遗传进化分析得到结果，同样操作繁琐，而且耗费大、耗时多，在临床上也难以加以应用。

所以，一种简便、快速、特异、敏感且对当前流行的经典毒株与变异毒株进行有效鉴别的检测方法急需出现，而套式RT-PCR具备上述优点，符合使用要求，适合对PEDV的经典株与变异株在临床上进行快速检测与鉴定。

此套式PCR的原理：据统计，目前爆发的仔猪流行性腹泻很多是由PEDV变异毒株引起的，Kim S J和H M等指出PEDV只有一个血清型，但是对比其部分S基因发现不同国家和地区存在多样性。田野等利用世界各地不同分支PEDV的55株做参考，对S抗原表位基因序列进行进化分析，发现了S基因的抗原位点发生了16个碱基的变化。王隆柏等对其7株PEDV流行毒株的S基因序列比对分析发现，与CV777标准毒株相比，7株PEDV毒株存在多个氨基酸突变、插入和缺失现象。大量文献表明现在流行的PEDV S基因在58aa处有4个氨基酸(QGVN)的插入，基于这一原理，根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成两对特异性扩增引物，在优化RT-PCR反应条件的基础上，并完成特异性、敏感性实验及对临床送检样品检测实验，建立PEDV区分变异毒株与经典毒株的套式RT-PCR检测方法。该套式PCR检测方法使用可识别变异株的内引物，可以分别鉴定PEDV经典毒株和变异毒株，经典PEDV仅在第一次PCR会产生749bp的条带，第二次无法产生条带；而变异PEDV在第一次PCR产物中产生760条带，第二次产生510bp的条带。本实验通过S基因遗传变异分析设计出的套式RT-PCR检测方法，可直接通过扩增后的产物进行琼脂电泳凝胶试验得到对应目的片段，两次RT-PCR就能快速得出病毒是否为变异毒株的结果，这将节约大量的时间及测序的成本。目前关于区分PEDV流行毒株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术在国内外还未见报道。经SOOPAT检索，现在并没有设计针对PEDV S基因引物而对PEDV经典毒株与变异毒株鉴别检测技术的申报和授权。

综上所述，为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT-PCR特异性低、灵敏性差的问题，同时也为了创造一种更加通用、在临床上更具有普适性的快速、准确、特异性强的检测区分经典与变异PEDV的方法，本试验研究发明了区分PEDV流行毒株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。

发明内容

鉴于当前鉴定PEDV毒株是否为变异毒株只能依靠病毒分离、RT-PCR扩增后测序等方法，这些方法耗时长，特异性不强，花费高，不能很好快速通过一次试验直接鉴别变异毒株从而监测猪群发生疫情时的具体致病毒株，本发明提供一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法。本发明的检测方法适用于对PEDV病毒的快速检测，主要应用于鉴别检测猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株、猪场快速诊断PEDV及其流行病学的监测。

本发明针对PEDV流行毒株存在多处变异的S基因，利用两对引物进行套式RT-PCR试验能够快速、准确、高效的对组织病料、细胞培养物等中含有的PEDV进行毒株是否变异的检测和分析。用此套式PCR既能在PEDV临床检测中快速鉴定是否为变异毒株又能在指导合理预防治疗等方面的提高参考依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)合成目的片段：根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引物；

应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，

外引物上游PEDV/F-1：5’-AACACTTAGCCTACCACA-3’；

外引物下游PEDV/F-2：5’-GTGGAATCATTGGACAA-3’；

内引物上游PEDV/R-1：5’-GAAAACCAGGGTGTCAA-3’；

内引物下游PEDV/R-2:5’-GAAATACCATCCTCACCAG-3’；

(2)套式RT-PCR扩增反应：将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应：2μL的RNA、1μL的PEDV/F-2下游引物和3μL的ddH₂O混匀，70℃反应10min，然后冰上急冷两分钟；此反应混合溶液再加入2μL 5×MLV buffer，0.5μLdNTP Mixture，0.25μL RNase Inhibitor，0.25μL M-MLV以及1μL ddH₂O；经42℃保温1h后，70℃保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA；

取2μL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10×PCR buffer2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物上游PEDV/F-1和外引物下游PEDV/F-2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL并混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，49℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；

(3)第二次套式RT-PCR扩增反应：取2μL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物上游PEDV/R-1和内引物下游PEDV/R-2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O16μL混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明设计了这两对引物分别进行两组试验，用以确定两对引物最佳退火温度，分别设定6个退火温度进行梯度PCR。各个退火温度均能扩增出条带，PEDV/F-1、PEDV/F-2引物在49.1℃时条带最清晰，并且无特异性条带；PEDV/R-1、PEDV/R-2引物在51.2℃时最清晰，并且无特异性条带。这两个退火温度确定为最佳退火温度。

2.该方法首先利用外引物PEDV/F-1和PEDV/F-2扩增出第一次RT-PCR的外片段产物，这时五株PEDV的毒株(经典毒株和变异毒株)都在外片段中扩增，经1％的琼脂糖电泳凝胶显示出结果大小经典毒株为759bp，变异毒株为760(见图1)。再利用内引物PEDV/R-1，PEDV/R-2扩增出第二次RT-PCR产物，经典毒株没有显示扩增片段，而变异毒株扩增片段结果为510bp(图2)。与预期结果相符。

3.以已检测确诊的PEDV、TGEV、PDCoV和RV阳性病料提取的总RNA为模版进行扩增，使用本套式RT-PCR检测方法，1％的琼脂糖电泳凝胶显示TGEV、PDCoV和RV的内引物扩增和外引物扩增均没有目的条带，而PEDV经典毒株结果是外引物扩增有目的条带，而内引物扩增无目的条带。但PEDV变异毒株则是内引物扩增和外引物扩增均有目的条带。此试验表明本实验所设计的扩增分析技术特异性较好(图3)。

4.将一株经典毒株的PEDV用Trizol法提取的RNA定量，用ddH₂O进行系列10倍倍比稀释，取120ng RNA，设7个梯度，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，反转录后进行PCR反应，利用本套式引物检测套式RT-PCR的敏感性。由(图4)可知10^-2至10^-6(1.2ng至0.12pg)稀释的PEDV毒株反转录后扩增产物均能检测出510bp的目的片段，10^-7(0.012pg)稀释的PEDV毒株反转录后扩增产物未检测出510p的目的片段。而外引物RT-PCR仅能扩增到10^-4(12pg)(图5)。实验结果显示套式PCR敏感性比常规PCR高出两个数量级。5临床送检的148份病料中有111份得到“两次都为阳性”的结果，37份病料得到“第一次阳性，第二次阴性”的结果，由试验可知，111份为变异毒株，37份为经典毒株，变异毒株的比例为75％。对148份病料得到的产物送往大连宝生物公司进行测序，测序结果表明“两次都为阳性”样本中有碱基插入、变异；“第一次阳性，第二次阴性”样本为经典毒株的DNA序列。

附图说明

图1为外引物套式PCR扩增产物的电泳检测结果图；其中，M：分子质量标准；1：PEDV经典毒株外引物扩增产物；2～5：PEDV变异毒株外引物扩增产物；

图2为套式PCR内引物扩增产物的电泳检测结果图；其中，M：分子质量标准；1：PEDV经典毒株内引物扩增产物；2～5：PEDV变异毒株内引物扩增产物。

图3为套式PCR特异性试验的检测结果图；其中，M：分子质量标准；1：TGEV外引物扩增产物；2：TGEV内引物扩增产物；3：PDCoV外引物扩增产物；4：PDCoV内引物扩增产物；5：RV外引物扩增产物；6：RV内引物扩增产物；7：PEDV经典毒株外引物扩增产物；8：PEDV经典毒株内引物扩增产物；9：PEDV变异毒株外引物扩增产物；10：PEDV变异毒株内引物扩增产物；

图4为套式PCR敏感性试验的检测结果图；其中，M：分子质量标准；1：12ng；2：1.2ng；3：120pg；4：12pg；5：1.2pg；6：0.12pg；7：0.012pg(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)；

图5为常规RT-PCR敏感性试验的结果图；其中，M：分子质量标准；1：12ng；2：1.2ng；3：120pg；4：12pg；5：1.2pg(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 样品中RNA的提取

1实验材料

含有PEDV毒株的样品，根据样品采集时间和地点分别命名为MX-2014,MX-2015,HA-2015,NC-2014,NC-2015；含有TGEV毒株的样品命名为QW；含有PDCoV毒株的样品命名为BC；和含有RV毒株的样品命名为JC。

1.1主要试剂

Trizol总RNA提取试剂；TaqTM酶、反转录酶M-MLV、RNase inhibitor、5×M-MLV buffer、10×PCR buffer、琼脂糖、DL2000DNA Maker、dNTPs、6×Loading buffer均购自Takara公司。

2试验方法

2.1Trizol法提取总RNA

2.1.1取样品MX-2014,MX-2015,HA-2015,NC-2014,NC-2015,QW,BC和JC研磨液250μL到2ml EP管中，加入500μL预冷的Trizol。

2.1.2样品剧烈混合，室温放置10min。

2.1.3加200μL氯仿颠倒EP管两次，剧烈混合至乳白色。室温静置10min。之后4℃，12000rpm离心15min

2.1.4取上层水相转移至新EP管中，加入等体积异丙醇混匀放置10min。之后4℃，12000rpm离心15min。离心结束后尽可能除去所有上清液。

2.1.5加入1mL 75％DEPC水配置的乙醇溶液洗涤RNA沉淀和管壁，4℃，7500rpm离心5min。

2.1.6尽可能除去全部乙醇，RNA沉淀干燥处理后，用25μL无RNase污染的水将RNA溶解。放-20℃保存备用。

实施例2：套式RT-PCR扩增反应

1引物的设计

应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，外引物上游PEDV/F-1：5-AACACTTAGCCTACCACA—3’,外引物下游PEDV/F-2：5’—GTGGAATCATTGGACAA—3’。

2第一次套式RT-PCR扩增反应

Trizol法提取总RNA后进行反转录反应：2μL的RNA、1μL的PEDV/F-2下游引物和3μL的ddH2O混匀，70℃反应10min，然后冰上急冷两分钟。

2.1此反应混合溶液再加入2μL 5×MLV buffer，0.5μL dNTP Mixture，0.25μLRNase Inhibitor，0.25μL M-MLV以及1μL ddH₂O。

2.2经42℃保温1h后，70℃保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA。

2.3取2μLcDNA作为模板进行第一次PCR扩增。反应体系为：10×PCR buffer2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物F1、F2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL并混合均匀。

2.4按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性5min，49℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应。

实施例3：第二次套式RT-PCR扩增反应

1第二次PCR引物的设计

应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，内引物上游PEDV/R-1：5’—GAAAACCAGGGTGTCAA—3’，内引物下游PEDV/R-2:5’—GAAATACCATCCTCACCAG—3’。

2进行第二次套式RT-PCR扩增反应

取2μL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物R1、R2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL混合均匀。

2.1按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性5min，51℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应。获得第二次PCR产物。

实施例4：套式RT-PCR退火温度的优化试验

1利用毒株NA-2015cDNA 2μL作为PCR模版，建立25μL的PCR反应体系(10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物F1、F2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL混合均匀)。PEDV/F-1、PEDV/F-2引物在48℃～50℃之间设定6个退火温度(分别为：48.0℃，48.4℃，48.8℃，49.1℃，49.5℃，50.0℃)进行梯度PCR，经电泳凝胶试验，紫外凝胶成像系统观察结果到49.1℃时条带最亮，说明内引物F1、F2最佳退火温度应为49.1℃。

2利用第一次PCR产物2μL作为PCR模版，建立25μL的PCR反应体系(10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物R1、R2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL混合均匀)。PEDV/R-1、PEDV/R-2引物在50℃～52℃之间设定6个退火温度(分别为：48.0℃，48.4℃，48.8℃，49.1℃，49.5℃，50.0℃)进行梯度PCR，经电泳凝胶试验，紫外凝胶成像系统观察结果到51.2℃时条带最亮，说明内引物F1、F2最佳退火温度应为51.2℃。

实施例5：套式RT-PCR的特异性试验

1利用Trizol法提取毒株QW，BC和JC，MX-2014，MX-2015(TGEV、PDCoV、RV和PEDV)的总RNA后，反转录得cDNA。建立25μL的PCR反应体系(10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物F1、F2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL混合均匀)得到第一次PCR产物。

2利用第一次PCR产物所得DNA建立25μL的PCR反应体系(10×PCRbuffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物R1、R2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O16μL混合均匀)得到第二次PCR产物的。取5μL PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。结果见图3，TGEV、PDCoV、RV的毒株都没有显示目的条带，而MX-2014，MX-2015显示出了对应的目的条带，说明此方法具有特异性。

实施例6：套式RT-PCR的敏感性试验

将一株PEDV的变异毒株(HA-2015)用Trizol法提取RNA,核酸蛋白检测仪检测总RNA浓度及质量在检测RNA质量前,将核酸蛋白检测仪预热10min.用与溶解RNA相同的RNase free dH2O调零,测定RNA样品的OD值,得出OD260/OD280≈2，再取120ng RNA，利用ddH₂O进行系列10倍倍比稀释，设7个梯度，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，反转录后进行PCR反应，利用本套式引物检测套式RT-PCR的敏感性。将此7个RNA样本使用引物F1、F2和R1、R2进行两次PCR试验，并使用电泳凝胶试验观察结果。由(图4)可知10^-2至10^-6(1.2ng至0.12pg)稀释的PEDV毒株反转录后扩增产物均能检测出510bp的目的片段，10^-7(0.012pg)稀释的PEDV毒株反转录后扩增产物未检测出510bp的目的片段。而外引物RT-PCR仅能扩增到10^-4(12pg)(图5)目的片段为760bp。实验结果显示套式PCR敏感性比常规PCR高出两个数量级。

实施例7:临床样品的检测

对广东省内不同五个城市临床送检的已经过常规RT-PCR检测的148份PEDV阳性病料进行套式RT-PCR，并用琼脂糖凝胶电泳进行第一次RT-PCR产物(引物F1、F2)和第二次RT-PCR产物(引物R1、R2)试验观察结果。

经琼脂糖凝胶电泳检测，临床送检的148份病料中有111份得到“两次都为阳性”的结果，37份病料得到“第一次阳性，第二次阴性”的结果，由试验可知，111份为变异毒株，37份为经典毒株，变异毒株的比例为75％。对148份病料得到的产物送往大连宝生物公司进行测序，测序结果表明“两次都为阳性”样本中有碱基插入、变异；“第一次阳性，第二次阴性”样本为经典毒株的DNA序列。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)合成目的片段：根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引物；

应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，

外引物上游PEDV/F-1的序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物下游PEDV/F-2的序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物上游PEDV/R-1的序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物下游PEDV/R-2的序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)套式RT-PCR扩增反应：将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应：2μL的RNA、1μL的PEDV/F-2下游引物和3μL的ddH₂O混匀，70℃反应10min，然后冰上急冷两分钟；此反应混合溶液再加入2μL 5×MLV buffer，0.5μLdNTP Mixture，0.25μL RNase Inhibitor，0.25μL M-MLV以及1μL ddH₂O；经42℃保温1h后，70℃保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA；

取2μL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10×PCR buffer2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物上游PEDV/F-1和外引物下游PEDV/F-2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL并混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，49℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；

(3)第二次套式RT-PCR扩增反应：取2μL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物上游PEDV/R-1和内引物下游PEDV/R-2各1μL，r-Taq酶0.5μL，ddH₂O16μL混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测。