CN105820332B - 一种星形聚氨基酸和星形聚氨基酸载药纳米胶束及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种星形聚氨基酸和星形聚氨基酸载药纳米胶束及制备方法。该星形聚氨基酸具有如下结构：B—An，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，n为星形聚氨基酸的星形支化度，n为5‑50中任意的正整数。本发明还公开了该星形聚氨基酸的制备方法。以所述星形聚氨基酸为原料，本发明还公开了一种星形聚氨基酸载药纳米胶束及其制备方法。本发明公开的星形聚氨基酸具有良好的生物相容性和生物降解性，由于内部具有交联结构，不易受血液循环系统的影响而发生药物的突然释放，作为药物载体稳定性良好。由其制备的载药纳米胶束在提高药物的利用率，降低药物的毒副作用方面具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及高分子药物载体领域。更具体地，涉及一种星形聚氨基酸和星形聚氨基酸载药纳米胶束及制备方法。
背景技术
目前，已市场化的药物在应用中面临着水溶性及稳定性差，药物对正常组织毒副作用大等问题。为了解决这些问题，通过将药物与药物载体结合，使药物以适当的浓度和速度释放，从而提高药物的利用率，降低药物的毒副作用。常见的药物载体包括无机纳米粒子、脂质体、聚合物胶束等。聚合物胶束由于具有粒径可控、体内循环时间长、可以进行靶向性修饰等优点，成为近年来药物载体的研究热点。
聚合物胶束是两亲性聚合物，在溶剂中为维持热力学稳定，其疏水段形成紧密内核，亲水段有序排列于内核外侧，自发形成纳米“核-壳”的胶束结构。但是由于胶束是线性聚合物自组装形成的不稳定体系，易受到血液循环系统的影响而发生药物的突然释放，从而影响药物疗效。与线形聚合物相比，星形聚合物的稳定性较高，不易受血液循环系统的影响发生药物的突然释放。此外，星形聚合物还具有较小的流体动力学半径和分子表面较高的官能度，使其成为药物载体的理想选择。
聚氨基酸作为一种新型生物可降解材料，具有生物相容性较好、活性基团较多等优点，并且其降解产物为小分子氨基酸，无毒副作用，因此聚氨基酸在生物医学领域，如生物分离、组织工程、基因治疗和药物控制释放等方面具有广泛的应用前景。如J.Am.Chem.Soc.(2012,134,119-122)公开了一种通过糖基化修饰聚谷氨酸苄酯-聚甘氨酸得到两亲性聚氨基酸，其在水中形成20～50nm胶束。J.Mater.Chem.B(2013,1,69-81)公开了一种通过还原敏感的二硫键连接聚赖氨酸苄酯和聚乙二醇得到聚乙二醇-聚赖氨酸苄酯胶束，其在还原性的环境能断开二硫键，加快药物释放速率。又如公开号为CN103224702A，申请号为201310115466.1的专利公开了一种还原敏感型聚氨基酸纳米水凝胶，由聚乙二醇为亲水段，聚谷氨酸为疏水段的两亲性共聚物为主体，加入交联剂进行化学交联后得到聚合物水凝胶。然而，目前报道的聚氨基酸胶束均为线性聚合物，稳定性较低；且大多数聚氨基酸胶束由不可降解聚合物和聚氨基酸组成，生物降解性较差。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种星形聚氨基酸，该星形聚氨基酸同时具有良好的生物相容性和生物降解性，可作为药物传输和控制释放的载体材料。
本发明的第二个目的在于提供一种星形聚氨基酸的制备方法。该制备方法简单、方便。
本发明的第三个目的在于提供一种星形聚氨基酸载药纳米胶束。该纳米胶束以星型聚氨基酸为载体，具有良好的生物相容性和生物降解性，在提高药物的利用率，降低药物的毒副作用方面具有巨大的应用前景。
本发明的第四个目的在于提供一种星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备方法。该制备方法简单、方便，可操作性强。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
一种星形聚氨基酸，所述星形聚氨基酸具有如下结构：B—An，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，n为星形聚氨基酸的星形支化度，n为5-50中任意的正整数；
其中，所述臂结构A具有式(I)所示结构
所述核结构B具有式(II)和式(III)所示结构
式(I)中R1为选自以下所示结构中的任意一种
式(II)中R2为选自以下所示结构中的任意一种
a、b、c均是正整数，a＝5-1000，b＝5-10000，c＝5-10000。
优选地，所述核结构B中式(II)和式(III)以酰胺键的方式连接；所述核结构B与所述臂结构A以酰胺键的方式连接。
为达到上述第二个目的，本发明一种星形聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：
将引发剂、氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐依次溶解于有机溶剂中，搅拌下进行开环聚合反应，得到星形聚氨基酸；
其中，引发剂为选自以下(IV)～(IX)所示结构中的任意一种：
氨基酸-N-内羧酸酐可由胺类化合物引发进行开环聚合反应，其中伯胺、仲胺作为引发剂进行聚合反应的条件温和，且得到的聚氨基酸的多分散指数较低。
优选地，所述氨基酸-N-内羧酸酐a为γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐或ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐。上述氨基酸反应形成的聚氨基酸可通过水解反应脱去侧链保护基团，形成的亲水性氨基酸可以提高星形聚氨基酸在水性介质中的稳定性。
优选地，所述氨基酸-N-内羧酸酐b为氨基酸-N-内羧酸酐b为L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-精氨酸-N-内羧酸酐或L-组氨酸-N-内羧酸酐。上述氨基酸与L-胱氨酸通过共聚反应形成星形聚氨基酸的核，可用于提高星形聚氨基酸与不同药物的作用力，从而提高载药量。
优选地，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜；更优选地，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。由于N，N-二甲基甲酰胺能够更好的溶解反应生成的聚氨基酸，使聚合反应能够更有效地进行。而在其它反应溶剂中，随着聚氨基酸的分子量增加，生成的聚氨基酸在溶剂中的溶解性降低，聚合反应不能继续进行，导致生成的聚氨基酸分子量降低。
优选地，所述氨基酸-N-内羧酸酐a与所述引发剂的摩尔比为5-1000:1。氨基酸-N-内羧酸酐a通过开环聚合反应形成星形聚氨基酸的臂结构，对星形聚氨基酸在不同溶剂中稳定性影响较大，在上述比例下的得到星形聚氨基酸的稳定性最优。
优选地，所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐b与所述氨基酸-N-内羧酸酐a的摩尔比为0.1-150：0.1-150：1；更优选地，所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐b与所述氨基酸-N-内羧酸酐a的摩尔比为0.1-100：0.1-100：1。L-胱氨酸-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐b与所述氨基酸-N-内羧酸酐a的加料比例影响制备得到的星形聚氨基酸的稳定性和载药性，在上述比例下的得到星形聚氨基酸的稳定性和载药性最优。
优选地，搅拌反应的温度为20℃-40℃；更优选地，搅拌反应的温度为30℃。由于氨基酸-N-羧酸酐的稳定性较差，在室温条件下即可开环形成相应的酰胺，所以温度对开环聚合反应的影响十分明显。高温下氨基酸-N-羧酸酐迅速进行开环反应，导致得到星形聚氨基酸的多分散指数过高；而低温下开环聚合反应速率出现明显的降低，导致得到星形聚氨基酸的聚合度过低。
优选地，搅拌反应的时间为60h-80h；更优选地，搅拌反应的时间为65h～75h。反应时间过短导致氨基酸-N-羧酸酐反应不完全，降低得到星形聚氨基酸的聚合度；反应时间过长使星形聚氨基酸聚合度和多分散指数过高，导致其稳定性和载药性能降低。
为达到上述第三个目的，本发明采用下述技术方案：
一种星形聚氨基酸载药纳米胶束，包含原料星形聚氨基酸，所述星形聚氨基酸具有如下结构：B—An，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，n为星形聚氨基酸的星形支化度，n为5-50中任意的正整数；
其中，所述臂结构A具有式(I)所示结构
所述核结构B具有式(II)和式(III)所示结构
式(I)中R1为选自以下所示结构中的任意一种
式(II)中R2为选自以下所示结构中的任意一种
a、b、c均是正整数，a＝5-1000，b＝5-10000，c＝5-10000。
由于原料星形聚氨基酸在水中的溶解度和稳定性较差，而人体内环境大部分为水性介质，这限制了星形聚氨基酸的应用。所以需将星形聚氨基酸R1基团中保护基团脱除，得到亲水性星形聚氨基酸，使得其在水中稳定性得到极大的提高，再进一步地制备星形聚氨基酸载药纳米胶束。
本发明还提供了一种星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
将星形聚氨基酸用三氟乙酸或二氯乙酸溶解，加入溶有溴化氢的冰醋酸溶液，产物经沉淀、过滤、干燥后得到亲水性星形聚氨基酸；
将亲水性星形聚氨基酸溶于水性介质中得到纳米胶束，将药物溶解在与水互溶的溶剂中得到药物溶液，将纳米胶束与药物溶液混合后，经超声或高压均质处理，用透析、超滤或柱分离法除去有机溶剂和未负载的药物，得到粒径为100～1000nm星形聚氨基酸载药纳米胶束。
优选地，所述药物为阿霉素、白藜芦醇、紫杉醇、非诺贝特、喜树碱、硝苯地平、长春西汀、比卡鲁胺和水飞蓟宾中的一种或多种。
优选地，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液或组织培养液。
由上述过程可知，本发明得到星形聚氨基酸含有由氨基酸组成的亲水链段和疏水链段，当所述星形聚氨基酸溶于水性介质中形成胶束时。由于聚氨基酸内部具有交联结构，该聚氨基酸水凝胶不易受血液循环系统的影响而发生药物的突然释放，具有较好的稳定性。
本发明的有益效果如下：
与现有技术相比，本发明以氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐为原料，引发剂依次引发氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐发生开环聚合反应；由于L-胱氨酸-N-内羧酸酐含有两个内羧酸酐结构，在聚合过程中可形成交联结构，得到星型聚氨基酸。聚合反应得到的聚氨基酸通过侧链脱保护反应后得到亲水性星形聚氨基酸，溶于水性介质中能够形成纳米胶束，可以作为控制药物释放的载体材料。此外，本发明中得到的星形聚氨基酸由氨基酸组成，具有良好的生物相容性和生物降解性，由于聚氨基酸内部具有交联结构，不易受血液循环系统的影响而发生药物的突然释放，具有较好的稳定性。由其制备的星形聚氨基酸载药纳米胶束在提高药物的利用率，降低药物的毒副作用方面具有巨大的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明星形聚氨基酸的结构示意图。
图2示出本发明实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸的核磁共振氢谱图；。
图3示出本发明实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸的红外谱图。
图4示出本发明实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸未载药胶束在水性介质的流体动力学半径分布图。
图5示出本发明实施例14得到的星形聚氨基酸载药胶束在水性介质的流体动力学半径分布图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
一种星形聚氨基酸，其结构示意图如图1所示，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，核结构B上连接的臂结构A的数目即星形氨基酸的星形支化度n，n为5-50中任意的正整数；臂结构A与核结构B以酰胺键的方式连接。
一种星形聚氨基酸的制备方法，包括以下步骤：
将引发剂、氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐依次溶解于有机溶剂中，开环聚合反应后得到星形聚氨基酸。
本发明以氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐为原料制备星形聚氨基酸，在引发剂作用下，氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐依次发生开环聚合反应；由于L-胱氨酸-N-内羧酸酐含有两个内羧酸酐结构，在发生开环聚合反应时可形成交联结构。
所述氨基酸-N-内羧酸酐a与氨基酸-N-内羧酸酐b可以为从市场上购得，也可以为按照本领域技术人员熟知的方法制备，如采用相应的氨基酸与双(三氯甲基)碳酸酯发生反应，得到相应的氨基酸-N-内羧酸酐。
按照本发明，对所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以由市场购买，也可以按本领域技术人员熟知的方法制备。
在引发剂(IV)～(IX)的引发作用下，氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐在搅拌的条件下依次发生开环聚合反应，形成星形聚氨基酸。
上述反应在有机溶剂中完成，对完成反应后的反应混合物进行后处理，即可得到星形聚氨基酸，如：反应完毕后，将反应混合物在甲醇中沉降、离心、洗涤、干燥后，即可得到星形聚氨基酸。
一种星形聚氨基酸载药胶束的制备方法，包括以下步骤：
将聚氨基酸在25℃下用三氟乙酸或二氯乙酸溶解，然后在搅拌子搅拌下加入溶有溴化氢的冰醋酸溶液，其中，溴化氢与保护基团的摩尔比为1∶10，在25℃下反应2h，产物用丙酮沉降，过滤，洗涤，真空干燥24h，得到亲水性星形聚氨基酸。
将亲水性星形聚氨基酸溶于水性介质中形成纳米胶束；将药物溶解在与水互溶的溶剂，将得到的药物溶液与亲水性星形聚氨基酸载药纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，用透析、超滤或柱分离法除去有机溶剂和未负载的药物，得到粒径为100～1000nm星形聚氨基酸载药纳米胶束。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供星形聚氨基酸的制备方法及星形聚氨基酸载药纳米胶束进行详细描述。
以下各实施例中所用原料均为从市场上购得，反应产率＝实际产率/理论产率×100％。
实施例1γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的制备
将1mol L-谷氨酸与3mol苯甲醇在25℃条件下混合，搅拌条件下滴加3mol浓硫酸，滴加完毕后，升温至70℃反应3h，反应结束后，3mol碳酸氢钠溶液中和反应混合溶液，再经过滤、洗涤、重结晶、干燥后，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯。
将1molγ-苯甲基-L-谷氨酸酯与0.6mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐。
实施例2ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐的制备
将1molε-苄氧羰基-L-赖氨酸与0.6mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐。
实施例3L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的制备
将1mol L-苯丙氨酸与0.6mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐。
实施例4L-色氨酸-N-内羧酸酐的制备
将1mol L-色氨酸与0.6mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-色氨酸-N-内羧酸酐。
实施例5L-胱氨酸-N-内羧酸酐的制备
将1mol L-胱氨酸与1.2mol双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-胱氨酸-N-内羧酸酐。
实施例6-11星形聚氨基酸的制备
分别称取0.1mmol引发剂(IV)～(IX)，分别放入6个反应瓶中，分别加入50mL无水N，N-二甲基甲酰胺后依次加入2.6325g(0.01mol)实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐，0.1912g(0.001mol)实施例3制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和0.2923g(0.001mol)实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐，在30℃下反应72h，反应结束后，反应体系用500mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h，分别得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
由于制备星形聚氨基酸的方法属于“先臂后核”法，在加入构成核结构的聚合单体前，可从聚合体系中取适量线性臂结构物质(臂结构由式(I)进行聚合反应形成)进行相应表征。
分别对星形聚氨基酸中臂结构聚谷氨酸苄酯和星形聚氨基酸的平均分子量进行测定，结果参见表1，表1为本发明实施例6～11制备的产物的平均分子量及产率。
表1本发明实施例6～11制备的产物的平均分子量及产率
| 实施例 | Mn1(D) | PDI 1 | Mn2(D) | PDI 2 | 产率％ |
| 6 | 21850 | 1.03 | 1365245 | 1.31 | 82.5 |
| 7 | 21750 | 1.10 | 1362759 | 1.46 | 84.6 |
| 8 | 21790 | 1.12 | 1363168 | 1.53 | 87.4 |
| 9 | 21830 | 1.06 | 1364190 | 1.40 | 89.8 |
| 10 | 21900 | 1.20 | 1366896 | 1.61 | 83.3 |
| 11 | 21700 | 1.15 | 1361626 | 1.57 | 85.1 |
表1中，Mn1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的平均分子量,，PDI 1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的多分散指数；Mn2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨基酸的平均分子量，PDI 2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨酸的多分散指数。
实施例12-16星形聚氨基酸的制备
分别称取5份0.1mmol引发剂(IV)分别放入4个反应瓶中，分别加入600mL无水N，N-二甲基甲酰胺后依次加入实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐，实施例3制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐，其中，各反应瓶中加入γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体的质量分别为23.69g(0.090mol)、13.16g(0.050mol)、2.37g(0.009mol)、1.32g(0.005mol)、0.263g(0.001mol)，L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的质量为1.72g(0.009mol)、47.98g(0.251mol)、9.94g(0.052mol)、13.96g(0.073mol)、2.48g(0.013mol)，L-胱氨酸-N-内羧酸酐的质量分别为2.63g(0.009mol)、73.36g(0.251mol)、15.19g(0.052mol)、21.34g(0.073mol)、3.79g(0.013mol)，在30℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用6000mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
分别对星形聚氨基酸中臂结构聚谷氨酸苄酯和星形聚氨基酸平均分子量进行测定，结果参见表2，表2为本发明实施例12～16制备的产物的平均分子量及产率。
表2本发明实施例12～16制备的产物的平均分子量及产率
| 实施例 | M1/I | M2/M1 | M3/M1 | Mn1(D) | PDI 1 | Mn2(D) | PDI 2 | 产率％ |
| 12 | 900 | 0.1 | 0.1 | 196450 | 1.07 | 257863 | 1.15 | 88.5 |
| 13 | 500 | 5 | 5 | 109144 | 1.04 | 545785 | 1.23 | 87.9 |
| 14 | 90 | 10 | 10 | 19751 | 1.05 | 197862 | 1.34 | 89.3 |
| 15 | 50 | 70 | 70 | 10933 | 1.03 | 656125 | 1.42 | 89.8 |
| 16 | 10 | 100 | 100 | 2195 | 1.09 | 439378 | 1.54 | 88.2 |
表2中，M1/I为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与六甲基二硅胺烷的摩尔比，M2/M1为L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比，M3/M1为L-胱氨酸-N-内羧酸酐与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比；Mn1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的平均分子量，PDI 1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的多分散指数；Mn2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨基酸的平均分子量，PDI 2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨酸的多分散指数。
星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备
分别将实施例12-16所制备的1g星形聚氨基酸用10mL二氯乙酸溶解，搅拌条件下加入6mL溶有溴化氢的冰醋酸溶液，得到反应混合液，将所述反应混合液在25℃下搅拌2h后，将得到的产物用150mL丙酮沉降、过滤，用丙酮洗涤三次，真空干燥24h，得到亲水性星形聚氨基酸。
分别将得到的亲水性星形聚氨基酸60mg溶于10mL水性介质中得到纳米胶束；将30mg硝苯地平或白藜芦醇溶解在二氯甲烷中，缓慢滴加至星形聚氨基酸溶液中，磁力搅拌24h后，超声30min，离心(1000rpm)10min，得到星形聚氨基酸载药纳米胶束。分别对星形聚氨基酸载药纳米胶束进行测定，结果参见表3，表3为本发明实施例12～16得到星形聚氨基酸载药后的载药量和粒径。
表3本发明实施例12～16得到星形聚氨基酸载药后的载药量及粒径
以重水为溶剂对由实施例14得到的亲水性星形聚氨基进行核磁共振分析，结果参见图2。图2为本发明实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸的核磁共振氢谱图。图2中，化学位移为4.26ppm、2.31ppm、1.977ppm、1.874时出现聚谷氨酸苄酯的信号峰，化学位移为7.25ppm时出现聚苯丙氨酸的信号峰，化学位移在2.50～4.10ppm之间出现聚胱氨酸的信号峰，由此可见，所述亲水性星形聚氨基酸具有核-壳结构。
对由实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸进行红外分析，结果参见图3，图3为本发明实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸的红外谱图，图3中，波数为1660cm-1的峰位羰基的伸缩振动吸收峰(vC＝O)，波数为1538cm-1的峰位N-H摇摆振动的吸收峰(δN-H)，由此可见所述亲水性星形聚氨基酸包括谷氨酸、苯丙氨酸和胱氨酸成分。
由图2和图3可知，所述亲水性星形聚氨基酸具有聚谷氨酸构成的壳，聚苯丙氨酸和聚胱氨酸构成的核的核壳结构。
将由实施例14得到的亲水性星形聚氨基酸溶于水性介质形成未载药的纳米胶束，对该未载药的纳米胶束进行流体动力学分析，结果参见图4。在水性介质中，亲水性星形聚氨基酸未载药纳米胶束的流体动力学半径为104±5.5nm。
将由实施例14得到的星形聚氨基酸载药纳米胶束进行流体动力学分析，结果参见图5。在水性介质中，星形聚氨基酸载药纳米胶束的流体动力学半径分别为200±5.5nm。由于聚合胶束通过疏水作用力对药物进行物理包覆，与载药后胶束的流体动力学半径对比，证明药物成功负载于聚合物胶束的核壳结构中。
实施例17星形聚氨基酸的制备
将0.1mmol引发剂(IV)加入到反应瓶中，加入200mL无水二氧六环后依次加入2.6325g(0.01mol)实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、1.9118g(0.01mol)实施例3制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和2.9229g(0.01mol)实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐，向反应瓶中加入200mL无水二氧六环将反应物溶解，然后将溶液在30℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用2000mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
通过凝胶渗透色谱，聚谷氨酸苄酯的平均分子量为21763D，多分散指数为1.05，星形聚氨基酸的平均为1365279D，多分散指数为1.37，星形聚氨基酸的产率为89.3％。
实施例18星形聚氨基酸的制备
将0.1mmol引发剂(IV)加入到反应瓶中，加入150mL无水二甲基亚砜向反应瓶后依次加入2.6325g(0.01mol)实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、1.9118g(0.01mol)实施例3制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和2.9229g(0.01mol)实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐，在30℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1500mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
通过凝胶渗透色谱，聚谷氨酸苄酯的平均分子量为21772D，多分散指数为1.08，星形聚氨基酸的平均分子量为1365245D，多分散指数为1.52，星形聚氨基酸的产率为88.5％。
实施例19-23星形聚氨基酸胶束的制备
分别称取3份0.1mmol引发剂(VI)，分别放入5个反应瓶中，分别加入600mL无水N，N-二甲基甲酰胺后依次加入实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和实施例4制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，其中，各反应瓶中加入γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体的质量分别为23.69g(0.090mol)、13.16g(0.050mol)、2.37g(0.009mol)、1.32g(0.005mol)、0.263g(0.001mol)，L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的质量为1.72g(0.009mol)、47.98g(0.251mol)、9.94g(0.052mol)、13.96g(0.073mol)、2.48g(0.013mol)和L-胱氨酸-N-内羧酸酐的质量分别为2.63g(0.009mol)、73.36g(0.251mol)、15.19g(0.052mol)、21.34g(0.073mol)、3.79g(0.013mol)，在30℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用6000mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
分别对星形聚氨基酸中臂结构聚谷氨酸苄酯和星形聚氨基酸的分子量进行测定，结果参见表4。
表4本发明实施例19-23制备的产物的平均分子量及产率。
表4中，M1/I为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与六甲基二硅胺烷的摩尔比，M2/M1为L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比，M3/M1为L-胱氨酸-N-内羧酸酐与γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比；Mn1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的平均分子量，Mn1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的平均分子量，PDI 1为凝胶渗透色谱测定得到的聚谷氨酸苄酯的多分散指数；Mn2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨基酸的平均分子量，PDI 2为凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨酸的多分散指数。
星形聚氨基酸载药胶束的制备
分别将实施例19～23制备的1g上述星形聚氨基酸用10mL二氯乙酸溶解，搅拌条件下加入3mL溶有溴化氢的冰醋酸溶液，得到反应混合液，将所述反应混合液在25℃下搅拌2h后，将得到的产物用150mL丙酮沉降、过滤，用丙酮洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到亲水性星形聚氨基酸。
分别将得到的亲水性星形聚氨基酸60mg溶于10mL水性介质中得到纳米胶束；将30mg硝苯地平或白藜芦醇溶解在二氯甲烷中，缓慢滴加至星形聚氨基酸溶液中，磁力搅拌24h后，超声30min，离心(1000rpm)10min，得到载药量为2～30％、粒径为100～1000nm星形聚氨基酸载药纳米胶束。分别对星形聚氨基酸载药纳米胶束进行测定，结果参见表5，表5为本发明实施例19～23得到星形聚氨基酸载药后的载药量和粒径。
表5本发明实施例19～23得到星形聚氨基酸载药后的载药量及粒径
实施例24星形聚氨基酸的制备
将0.1mmol引发剂(IV)加入到反应瓶中，加入100mL无水N，N-二甲基甲酰胺后入3.0631g(0.01mol)实施例3制备的ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、1.9118g(0.01mol)实施例3制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和2.9229g(0.01mol)实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，在30℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1000mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，25℃下真空干燥24h得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
通过凝胶渗透色谱测定，聚赖氨酸苄酯的平均分子量为26257D，多分散指数为1.04，星形聚氨酸的平均分子量为1641183D，多分散指数为1.27，聚氨基酸的产率为89.8％。
实施例25星形聚氨基酸的制备
将0.1mmol引发剂(IV)加入到反应瓶中，加入100mL无水N，N-二甲基甲酰胺后依次加入2.6325g(0.01mol)实施例1制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、2.3022g(0.01mol)实施例3制备的L-色氨酸-N-内羧酸酐和2.9229g(0.01mol)实施例5制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1000mL甲醇沉降，过滤，用甲醇洗涤三次后，真空干燥24h，得到星形聚氨基酸。产物星形聚氨基酸中的R1和R2分别为：
通过凝胶渗透色谱测定得到的星形聚氨基酸中，聚谷氨酸苄酯的平均分子量为20475D，多分散指数为1.05，星形聚氨基酸的平均分子量为1279674D，多分散指数为1.38，星形聚氨基酸的产率为87.5％。
星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备
分别将实施例24、25制备的1g星形聚氨基酸用10mL三氟乙酸溶解，搅拌条件下加入3mL溶有溴化氢的冰醋酸溶液，得到反应混合液，将所述反应混合液在25℃下搅拌1h后，将得到的产物用150mL乙醚沉降、过滤，用乙醚洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到亲水性星形聚氨基酸。
分别将得到的亲水性星形聚氨基酸60mg溶于10mL水性介质中得到纳米胶束；将30mg比卡鲁胺或喜树碱溶解在二甲基亚砜中，缓慢滴加至星形聚氨基酸溶液中，磁力搅拌24h后，超声30min，离心(1000rpm)10min，得到星形聚氨基酸载药纳米胶束。分别对星形聚氨基酸载药纳米胶束进行测定，结果参见表6，表6为本发明实施例24、25得到星形聚氨基酸载药后的载药量和粒径。
表6本发明实施例24、25得到星形聚氨基酸载药后的载药量和粒径
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (12)
1.一种星形聚氨基酸，其特征在于，所述星形聚氨基酸具有如下结构：B—An，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，n为星形聚氨基酸的星形支化度，n为5-50中任意的正整数；
其中，所述臂结构A具有式(I)所示结构
所述核结构B具有式(II)和式(III)所示结构
式(I)中R1为选自以下所示结构中的任意一种
式(II)中R2为选自以下所示结构中的任意一种
a、b、c均是正整数，a＝5-1000，b＝5-10000，c＝5-10000。
2.根据权利要求1所述的一种星形聚氨基酸，其特征在于：所述核结构B中式(II)和式(III)以酰胺键的方式连接；所述核结构B与所述臂结构A以酰胺键的方式连接。
3.如权利要求1所述的一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将引发剂、氨基酸-N-内羧酸酐a、氨基酸-N-内羧酸酐b和L-胱氨酸-N-内羧酸酐依次溶解于有机溶剂中，搅拌下进行开环聚合反应，得到星形聚氨基酸；
其中，引发剂为选自以下(IV)～(IX)所示结构中的任意一种：
4.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐a为γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐或ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐。
5.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐b为L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-精氨酸-N-内羧酸酐或L-组氨酸-N-内羧酸酐。
6.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐a与所述引发剂的摩尔比为5-1000:1；所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐b与所述氨基酸-N-内羧酸酐a的摩尔比为0.1-150：0.1-150：1。
7.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或二甲基亚砜。
8.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应的温度为20℃-40℃。
9.根据权利要求3所述一种星形聚氨基酸的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应的时间为60h-80h。
10.一种星形聚氨基酸载药纳米胶束，其特征在于，包含原料星形聚氨基酸，所述星形聚氨基酸具有如下结构：B—An，A为星形聚氨基酸的臂结构，B为星形聚氨基酸的核结构，n为星形聚氨基酸的星形支化度，n为5-50中任意的正整数；
其中，所述臂结构A具有式(I)所示结构
所述核结构B具有式(II)和式(III)所示结构
式(I)中R1为选自以下所示结构中的任意一种
式(II)中R2为选自以下所示结构中的任意一种
a、b、c均是正整数，a＝5-1000，b＝5-10000，c＝5-10000。
11.如权利要求10所述的一种星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将星形聚氨基酸用三氟乙酸或二氯乙酸溶解，加入溶有溴化氢的冰醋酸溶液，产物经沉淀、过滤、干燥后得到亲水性星形聚氨基酸；
将亲水性星形聚氨基酸溶于水性介质中得到纳米胶束，将药物溶解在与水互溶的溶剂中得到药物溶液，将纳米胶束与药物溶液混合后，经超声或高压均质处理，用透析、超滤或柱分离法除去有机溶剂和未负载的药物，得到粒径为100～1000nm星形聚氨基酸载药纳米胶束。
12.根据权利要求11所述一种星形聚氨基酸载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述药物为阿霉素、白藜芦醇、紫杉醇、非诺贝特、喜树碱、硝苯地平、长春西汀、比卡鲁胺和水飞蓟宾中的一种或多种；所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液或组织培养液。
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