CN105784902A - 低浓度丁酸氯倍他松的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，涉及低浓度丁酸氯倍他松的检测方法，具体来说，涉及采用高效液相色谱‑串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法。该方法采用内标法，用丙酸氯倍他索作为内标物。该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，其定量限能达到1000pg/ml，检测限能达到400pg/ml。可广泛应用于低浓度丁酸氯倍他松生物样品中浓度的测试，特别是丁酸氯倍他松乳膏透皮试验中样品浓度的测试。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及低浓度丁酸氯倍他松的检测方法，具体来说，涉及采用高效液相色谱-串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法。
背景技术
丁酸氯倍他松是中效糖皮质激素类，可应用于短期治疗和控制湿疹和皮炎，包括特应性湿疹、原发刺激性和过敏性皮炎。丁酸氯倍他松化学名为：21-氯-9α-氟-17α-羟基-16β-甲基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮丁酸酯，其分子式为C26H32ClFO5，结构式如下：
丁酸氯倍他松最大吸收波长为241nm，在检测复杂生物样品时，基线噪音大，干扰多，并且灵敏度无法满足检测需要；丁酸氯倍他松软膏中主药规格为0.5％，透皮试验中乳膏上药量为10mg/皮片，主药上药量为0.05mg，接收溶剂体积为17ml，透过率按0.1％计算，接收液浓度约为2.94ng/ml，常规的高效液相色谱法检测无法满足需求。
因此，现有技术中缺少一种对低浓度丁酸氯倍他松进行定量测定的有效方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测低浓度丁酸氯倍他松的方法，该方法是采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，能准确的检测极低浓度的丁酸氯倍他松。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
高效液相色谱-串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法，所述的方法是采用内标法，用丙酸氯倍他索作为内标物。
高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在色谱柱上通过流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子分离，击碎，再将碎片按质量数分开，经检测器得到色谱图。液质联用技术将高效液相色谱和质谱的优势进行互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱的高灵敏度结合起来，实现对复杂样品的定量分析，并简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，因此广泛应用于药物分析、食品分析和环境分析等许多领域。
内标法是将一定浓度的纯物质作为内标物加到被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行处理分析，测定内标物和待测组分的峰面积，按标准曲线法即可求出被测组分在样品中的浓度。内标物一般应满足如下要求：与待测物结构相近，具有相识的化学性质，不发生化学反应。
因此，选择合适的内标物特别重要。本申请发明人经过反复研究和筛选，发现了一种特别适合LC-MS/MS法测定低浓度丁酸氯倍他松的内标物质：丙酸氯倍他索，结构式如下：
高效液相色谱-串联质谱是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
进一步，所述高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基键合硅胶填充的色谱柱。优选色谱柱的规格为150×4.6mm，5μm。
进一步，所述高效液相色谱采用的流动相为乙腈水溶液。
进一步，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比50-90:10-50，优选体积比为90:10。
进一步，所述流动相中还含有有机酸或者挥发性有机酸盐。
进一步，所述有机酸为甲酸和/或乙酸。
进一步，所述有机酸的体积百分比为0.05％-0.15％，优选0.1％。
进一步，所述挥发性有机酸盐为甲酸铵和/或乙酸铵。
进一步，所述挥发性有机酸盐的浓度为5-20mmol/L，优选10mmol/L。
进一步，所述高效液相色谱的进样量为5-100μl，优选10μl。
进一步，所述的方法，所述质谱采用多重反应监测模式，丁酸氯倍他松和丙酸氯倍他索分别采用至少一对母离子及子离子的组合进行定量监测。
丁酸氯倍他松全扫描质谱图如附图1所示，图中有[M+H]+的离子峰，其中m/z为479.3±1的离子峰强度最大，灵敏度最高，优选m/z为479.3±1的离子为母离子。附图2为丁酸氯倍他松离子峰m/z 479.3±1的子离子扫描质谱图，图中343.4±1和371.2±1的碎片离子峰强度大且稳定，此处优选m/z为371.2±1或343.4±1的离子为子离子。
丙酸氯倍他索全扫描质谱图如附图3所示，图中有[M+H]+的离子峰，其中m/z为467.3±1的离子峰强度最大，灵敏度最高，优选m/z为467.3±1的离子为母离子。附图4为丙酸氯倍他索离子峰m/z467.3±1的子离子扫描质谱图。图中355.1±1和373.2±1的碎片离子峰强度最大且稳定，此处优选m/z为355.1±1或373.2±1的离子为子离子。
更进一步，所述丁酸氯倍他松与丙酸氯倍他索采用的母离子及子离子的组合为：所述丁酸氯倍他松采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为479.3±1，子离子m/z为371.2±1或343.4±1；丙酸氯倍他索采用的母离子及子离 子的组合为：母离子为467.3±1，子离子为355.1±1或373.2±1。
在一个具体实施例中，本发明公开了如下的液相色谱和质谱条件：
所述液相色谱采用的条件包括：
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，150×4.6mm，5μm。
流动相：乙腈水溶液，乙腈-水体积比为90:10，乙腈水溶液添加甲酸，体积百分比为0.1％。
进样量：10μl。
所述质谱采用的条件包括：
离子源：API3000电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；干燥气：N2；干燥气压力(Gas2)：70psi；离子化温度(TEM)为350℃；雾化气(Gas1)为7；气帘气(Curtain Gas)为12；喷雾电压(Ion Spray Voltage)为4600V；碰撞气(CAD)6；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)14V；
丁酸氯倍他松参数：母离子m/z为479.3，子离子m/z为371.2或343.4，去簇电压(DP)55V，聚焦电压(FP)250V，碰撞能量(CE)25V；
丙酸氯倍他索参数：母离子m/z为467.3，子离子m/z为355.1或373.2，去簇电压(DP)30V，聚焦电压(FP)150V，碰撞能量(CE)19V。
本发明进一步还保护丙酸氯倍他索作为内标物在丁酸氯倍他松浓度测定中的应用。
本发明还保护了所述的方法在丁酸氯倍他松制剂的透皮试验测试中的应用。本发明的检测方法，专属性强、灵敏度高、准确度好，可广泛用于低浓度丁酸氯倍他松样品的测定，尤其是低主药规格的丁酸氯倍他松制剂的透皮试验的测定，进一步优选其在丁酸氯倍他松乳膏透皮试验测试中进行应用。
在一个具体实施例中，本发明还具体公开了采用高效液相色谱-串联质谱检测丁酸氯倍他松乳膏透皮试验样品的方法，具体为：
采用TP-5型智能透皮仪，以pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)作为接收溶剂，50％乙腈溶液作为皮片和皮上残留物处理溶剂，采用内标法，以丙酸氯倍他索为内标物，用高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪进行测定；
测试参数设置包括：
液相色谱仪：
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，150×4.6mm，5μm，
流动相：乙腈水溶液，乙腈与水体积比为90:10；并添加适量有机酸或者挥发性有机酸盐(有机酸可选用甲酸和/或乙酸，有机酸的体积百分比为0.05％-0.15％；有机酸盐可选用甲酸铵和/或乙酸铵，有机酸盐的浓度为5-20mmol/L)。
进样量：5-100μl；
质谱仪：
离子源：API3000电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；干燥气：N2；干燥气压力(Gas2)：70psi；离子化温度(TEM)为350℃；雾化气(Gas1)为7；气帘气(Curtain Gas)为12；喷雾电压(Ion Spray Voltage)为4600V；碰撞气(CAD)6；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)14V；
丁酸氯倍他松参数：母离子m/z为479.3，子离子m/z为371.2或343.1，去簇电压(DP)55V，聚焦电压(FP)250V，碰撞能量(CE)25V；
丙酸氯倍他索参数：母离子m/z为467.3，子离子m/z为355.1或373.2，去簇电压(DP)30V，聚焦电压(FP)150V，碰撞能量(CE)19V。
本发明的有益效果：
本发明的高效液相色谱-串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法，专属性强、灵敏度高、准确度好，可广泛用于低浓度丁酸氯倍他松样品的测定，尤其是低主药规格的丁酸氯倍他松制剂的透皮试验的测定。
附图说明
图1为丁酸氯倍他松的全扫描质谱图；
图2为丁酸氯倍他松的子离子质谱图；
图3为丙酸氯倍他索的全扫描质谱图；
图4为丙酸氯倍他索的子离子质谱图；
图5为检测限溶液(404pg/ml)的LC-MS/MS色谱图；
图6为定量下限溶液(1010pg/ml)的LC-MS/MS色谱图；
图7为样品接收液(小于1010pg/ml)的LC-MS/MS色谱图；
图8为样品皮内溶液(8ng/ml)的LC-MS/MS色谱图；
图9为样品皮上溶液(180ng/ml)的LC-MS/MS的色谱图；
图10为接收液样品的线性图谱；
图11为皮内样品溶液的线性图谱；
图12为皮上样品溶液的线性图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述，但是本发明的保护范围并不限于此。
本发明的实施例以检测丁酸氯倍他松乳膏透皮试验样品的测定为例来说明，各实施例中所用的仪器及条件：
色谱仪：Agilent1100；质谱仪：API3000；工作站：Analyst1.4.2；柱温：30℃，流速：0.3ml/min；离子源：ESI。
实施例1丁酸氯倍他松乳膏透皮试验接收液样品的检测
(1)色谱条件
色谱柱：Agilent XDB-C18，规格：150×4.6mm，5μm；
流动相：0.1％甲酸乙腈溶液：0.1％甲酸水溶液(90：10)。
(2)质谱条件
采用正离子模式检测；干燥气：N2；干燥气压力(Gas2)：70psi；离子化温度(TEM)为350℃；雾化气(Gas1)为7psi；气帘气(Curtain Gas)为12psi；喷雾电压(Ion Spray Voltage)为4600V；碰撞气(CAD)6psi；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)14V；丁酸氯倍他松与丙酸氯倍他索采用的母离子及子离子的组合如下表所示：
(3)检测方法
标准曲线和质控：取丁酸氯倍他松对照品和丙酸氯倍他索对照品，分别配制成1.01ng/ml、1.515ng/ml、2.02ng/ml、2.525ng/ml、3.03ng/ml和6.06ng/ml的一系列溶液作为标准曲线，分别进样，积分得到峰面积，以峰面积比值和样品浓度做线性回归，权重因子为1/X，见图10，浓度为1.01ng/ml的溶液作为定量限，见图6；再将样品溶液稀释成0.404ng/ml的溶液作为检测限，见图5；再配制1.01ng/ml、2.52ng/ml和6.06ng/ml的样品溶液，作为质控样品，分别进样，积分得到峰面积，带入标准曲线计算浓度及准确度，准确度要求在±15％以内。
样品溶液：给药后第6、9、11、12h取1ml接收液，加入100ng/ml的内标溶液50μl，混匀，用LC-MS/MS检测接收液中丁酸氯倍他松的浓度，见图7。每次取样之后补充预热至37℃的PBS溶液1ml。
实施例2丁酸氯倍他松乳膏透皮试验皮内样品的测定
(1)色谱条件
色谱柱：Agilent XDB-C18，规格：150×4.6mm，5μm；
流动相：0.1％乙酸乙腈溶液：0.1％乙酸水溶液(90：10)；
(2)质谱条件
采用正离子模式检测；干燥气：N2；干燥气压力(Gas2)：70psi；离子化温度(TEM)为350℃；雾化气(Gas1)为7psi；气帘气(Curtain Gas)为12psi；喷雾电压(Ion Spray Voltage)为4600V；碰撞气(CAD)6psi；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)14V；丁酸氯倍他松与丙酸氯倍他索采用的母离子及子离子的组合如下表所示：
(3)检测方法
标准曲线和质控：取丁酸氯倍他松对照品和丙酸氯倍他索对照品，分别配制成5.05ng/ml、7.575ng/ml、10.1ng/ml、12.625ng/ml、15.15ng/ml和20.2ng/ml的一系列溶液作为标准曲线，分别进样，积分得到峰面积，以峰面积比值和样品浓度做线性回归，权重因子为1/X，见图11，再配制5.05ng/ml、10.1ng/ml和20.2ng/ml的样品溶液，作为质控样品，分别进样，积分得到峰面积，带入标准曲线计算浓度及准确度，准确度要求在±15％以内。
样品溶液：透皮12h后，停止实验，用50％乙腈溶液将皮面冲洗干净后，将固定于扩散池的猪皮片取下，沿圆形的给药部位剪取皮片。用滤纸吸干水份后称重，然后剪碎，置于15ml具塞离心管中，加入50％乙腈溶液10ml，加入1μg/ml的内标溶液100μl，混匀，超声1h，转移溶液至100ml小烧杯中，重复操作2次，共收集20ml的溶液，混匀，取该溶液适量，置15ml离心管中，离心10min，转速为4,000rpm/min，取上清液作为供试品溶液，LC-MS/MS检测丁酸氯倍他松的浓度，见图8。
实施例3丁酸氯倍他松乳膏透皮试验皮上样品的测定
(1)色谱条件
色谱柱：Agilent XDB-C18，规格：150×4.6mm，5μm；
流动相：10mmol/L甲酸铵乙腈溶液：10mmol/L甲酸铵水溶液(90：10)；
(2)质谱条件
采用正离子模式检测；干燥气：N2；干燥气压力(Gas2)：70psi；离子化温度(TEM)为350℃；雾化气(Gas1)为7psi；气帘气(Curtain Gas)为12psi；喷雾电压(Ion Spray Voltage)为4600V；碰撞气(CAD)6psi；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)14V；丁酸氯倍他松与丙酸氯倍他索采用的母离 子及子离子的组合如下表所示：
(3)检测方法
标准曲线和质控：取丁酸氯倍他松对照品和丙酸氯倍他索对照品，分别配制成141.4ng/ml、161.6ng/ml、181.8ng/ml、202ng/ml、222.2ng/ml和242.4ng/ml的一系列溶液作为标准曲线，分别进样，积分得到峰面积，以峰面积比值和样品浓度做线性回归，权重因子为1/X，见图12，再配制141.4ng/ml、202ng/ml和242.4ng/ml的样品溶液，作为质控样品，分别进样，积分得到峰面积，带入标准曲线计算浓度及准确度，准确度要求在±15％以内。
样品溶液：透皮12h后，停止实验，取下玻璃供给室置100ml小烧杯中，加入50％乙腈溶液10ml，搅拌洗净玻璃供给室；用棉签将残留于皮肤表面的受试物擦拭至100ml小烧杯；再用50％乙腈水溶液15ml分四次冲洗皮片表面，冲洗完后用干棉签将皮片表面溶剂吸干，冲洗液和棉签并入同一烧杯中；加入10μg/ml的内标溶液500μl，混合后，置60℃水浴加热15min，搅拌均匀，冷却至室温，取溶液适量，离心10min，转速为4,000rpm/min，取上清液作为供试品溶液，LC-MS/MS测定丁酸氯倍他松的浓度，见图9。
由上述实施例可知，本发明的高效液相色谱-串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法，专属性强、灵敏度高、准确度好，可广泛用于低浓度丁酸氯倍他松样品的测定。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.高效液相色谱-串联质谱检测低浓度丁酸氯倍他松的方法，其特征在于，所述的方法是采用内标法，用丙酸氯倍他索作为内标物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基键合硅胶填充的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用的流动相为乙腈水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相中还含有有机酸或者挥发性有机酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机酸为甲酸和/或乙酸，所述有机酸的体积百分比为0.05％-0.15％；所述挥发性有机酸盐为甲酸铵和/或乙酸铵，所述挥发性有机酸盐的浓度为5-20mmol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱采用多重反应监测模式，丁酸氯倍他松和丙酸氯倍他索分别采用至少一对母离子及子离子的组合进行定量监测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丙酸氯倍他索采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为467.3±1，子离子m/z为355.1±1或373.2±1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丁酸氯倍他松采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为479.3±1，子离子m/z为371.2±1或343.1±1。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在丁酸氯倍他松制剂的透皮试验测试中的应用。
10.丙酸氯倍他索作为内标物在丁酸氯倍他松浓度测定中的应用。
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